1+1＞2：利用两种抗体靶向肿瘤细胞

自1997年  Rituximab（利妥昔单抗，一种针对淋巴瘤的单克隆抗体 (mAb) 药物）  获批，科学家陆续开发和优化多种mAb疗法。以应对不同癌症对人类健康的威胁。然而，虽然理性设计和筛选出的单克隆抗体可以高效而特异地结合癌细胞表面抗原，但因为靶抗原在健康细胞上也存在一定程度的表达，造成抗体结合癌细胞的同时也会结合健康细胞，所以许多mAb疗法也有其不可忽视的副作用  [1-2]  。

2022年7月25日，来自Genmab公司的抗体研究与技术副总监Rob de Jong团队在Nature Biotechnology上在线发表了题为Logic-gated antibody pairs that selectively act on cells co-expressing two antigens的研究文章。研究人员认为，目前mAb疗法的瓶颈在于单一的抗原靶标通常不能提供足够的选择性来区分癌组织和健康组织，如果使两种治疗性抗体仅在同时结合到同一靶细胞上，即只有满足“抗体A结合抗原A”和“抗体B结合抗原B”时，才能激活下游的免疫反应，这种设计将能提高靶向抗体疗法的选择性。

图1. 基于AND（“和”）逻辑门的治疗性抗体

作者首先总结了先前研究中的重要结论，一是mAb Fc结构域中的特定突变会促使抗体在细胞表面形成同源六聚体，并通过募集补体复合物C1来增强补体依赖性细胞毒性（complement-dependent cytotoxicity, CDC）效应[3]，这提供了一种逻辑门控抗体的作用模式。进一步的研究则表明，相较于单一mAb形成的同源六聚体，由多种mAb形成的异源六聚体具有更高的功效[4]，这为基于两种抗体-抗原识别的治疗方法提供了理论依据。于是，作者在mAb的Fc-Fc结构域的互作界面上引入互补突变，以期仅在表达两种mAb识别的两种抗原的细胞上引发抗体的异源寡聚化和触发CDC（他们将该技术命名为HexElect®）。

图2. 基于Fc结构域工程化突变的抗体对设计

为验证该方法的可行性，作者尝试构建针对CD52和CD20的抗体对。CD52在正常血液细胞类型中广泛表达，而CD20在成熟 B 细胞中严格表达。在第一代突变中，作者在Fc结构域中引入了之前报道的E430G和K439E或 E430G和S440K两种突变组合，E430G突变可以增强抗体的寡聚，K439E和S440K可以分别降低两种抗体同源寡聚的效率并提高两者间异源寡聚的效率。但作者发现，尽管这些突变大大增强了CDC效应，两种单独的抗体仍然保留了作为单一药物对全血细胞的实质性活性，这是由于游离单抗对细胞表面抗原和Fcγ受体的结合，造成逻辑门从识别CD52“和”CD20转变为识别CD52“或”CD20，  显然不能达到预期的效果  。

于是，作者在两种抗体的Fc-Fc/Fc-C1q结构域互作界面分别引入了G236R与G237A两种突变，构建第二代G236R/E430G/K439E（RGE）和G237A/E430G/S440K（AGK）两种单抗突变体。结果显示，G236/G237的引入达到了预期效果，即使突变抗体组合仅对同时表达两种抗原的目标细胞（B细胞）产生有效的CDC活性。从流式分选结果上看，单一的突变抗体并不会引起Fcγ受体的显著结合，且与PBMC共孵育时，也没有引起明显的副反应。当且仅当两种单抗同时应用于全血细胞时，才会引起CDC效应耗尽靶向的B细胞，并且显示出比其他临床 B 细胞靶向治疗剂（如利妥昔单抗）更强的活性，对非靶向细胞，如T细胞群则没有显著影响。

图3. 通过G236/G237突变调节Fc/FcγR/C1q的结合效率

在两种小鼠模型上，作者证实了这种方法在体的有效性，表明不管是在严重免疫缺陷的NOD-SCID-γ (NSG)小鼠，还是人源化免疫系统（NSG-HIS）小鼠体内，IgG1-Campath-RGE + IgG1-11B8-AGK的抗体组合均能在腹腔和血液环境中高效而特异地诱导回输的或自身的B细胞耗竭，而且三重突变并没有显著影响两种抗体的药代动力学或活性。

图4. 逻辑门控抗体疗法在体的治疗效果

同时，为验证逻辑门控抗体的作用模式，作者利用FRET分析和dSTORM 对两种抗体在细胞表面的接近度进行了评估，发现仅当CD52和CD20抗体含有E430G突变（IgG1-Campath-E430G和IgG1-11B8-E430G）时，添加纯化的C1q或C1才能增强它们之间的FRET信号，这表明 Fc-Fc相互作用和C1q或C1募集协同促进了抗体的紧密接近。但dSTORM的结果却显示，逻辑门控的两种抗体IgG1-Campath-RGE与IgG1-11B8-AGK，两者单独存在或共存时的最近邻距离没有显著的变化，这显然与预期的作用模式和FRET的结果相矛盾，可见两种抗体在细胞膜上的确切作用模式仍需进一步探索。

图5. CD52和CD20抗体组合在细胞表面的接近度

综上，研究人员成功开发了一种AND（“和”）逻辑门控的抗体疗法，通过在靶细胞表面形成异源六聚体引发CDC依赖的细胞杀伤，提高了治疗性抗体的效力，降低了潜在的副作用。基于HexElect®技术的抗体设计可有效应用于其他抗原和抗体组合，且相较于从头设计的蛋白质逻辑门[5]，突变抗体与野生型抗体的序列差异很小，可能不具有免疫原性。但其仍有需要解决的问题，1）阐明抗体组合在细胞膜表面的作用模式；2）该技术理论上适用于在膜上具有鲜明抗原表位且对CDC敏感的癌细胞，但多数肿瘤并不同时具有这两项特征[6]；3）能否构建出基于更复杂逻辑的抗体疗法，以甄别繁杂环境下的癌细胞。

参考文献

[1] Christian, B. A. & Lin, T. S. Semin. Hematol. 45, 95–103 (2008).

[2] Alinari, L. et al. Oncogene 26, 3644–3653 (2007).

[3] Diebolder, C. A. et al. Science 343, 1260–1263 (2014).

[4] Oostindie, S. C. et al. Haematologica 104, 1841–1852 (2019).

[5] Lajoie, M. J. et al.Science 369, 1637–1643 (2020).

[6] Macor, P., Capolla, S. & Tedesco, F. Front. Immunol. 9, 2203 (2018).

作者：Tony

编辑人：Transparent

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来源：医药速览 2022-08-31

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