科研丨浙大: 茶树根系分泌的L-茶氨酸通过塑造根际微生物组组装来调节土壤元素循环(国人佳作)

编译：微科盟君影，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读   根系分泌物代谢产物是植物与土壤微生物相互作用的重要媒介。L-茶氨酸是一种独特的非蛋白质氨基酸，对茶产品的风味和潜在的健康益处至关重要；然而，其在茶树中的生物学功能尚不清楚。由于L-茶氨酸主要在茶树的根部合成，本研究推测L-茶氨酸可能通过调节微生物组装来影响根际微生物群落的功能。本研究采用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)检测了茶树根系分泌物中的L-茶氨酸。此外，16S rRNA基因测序结果显示，L-茶氨酸显著改变了根际微生物群落的结构，并选择性地塑造根际微生物组装。此外，宏基因组测序数据表明，L-茶氨酸影响了土壤中编码元素循环的基因的丰度。有趣的是，L-茶氨酸通过降低narH、napA和napB基因的丰度显著抑制了反硝化和完全硝化途径。这些结果为L-茶氨酸的生物学功能以及茶树根系分泌物与根际微生物组之间相互作用的意义提供了新的见解。  

图文摘要      

论文ID

原名：L-theanine exuded from Camellia sinensis roots regulates element cycling in soil by shaping the rhizosphere microbiome assembly

译名：茶树根系分泌的L-茶氨酸通过塑造根际微生物组组装来调节土壤元素循环

期刊：Science of the Total Environment

IF：10.753

发表时间：2022.5

通讯作者：徐平

通讯作者单位：浙江大学茶叶研究所

DOI号：10.1016/j.scitotenv.2022.155801

实验设计

前言

根际是植物根系周围土壤的重要区域。植物通过改变土壤pH和结构来影响根际环境，在该区域分泌约10~50%的光合衍生碳。此外，据估计，每克根际土壤中含有数十亿个微生物，这些微生物可以通过形成和分解土壤有机质，通过根系与根系之间的信号传导调节根际环境；这使得根际土壤成为一个高度复杂的生态系统。根际微生物群落多样性随植物基因型、土壤环境、植物生长阶段和微生物相互作用等的变化而变化。植物根系分泌物，通常包括有机酸、脂肪酸和次级代谢产物，在植物和土壤微生物群落间的相互作用中发挥重要作用。 植物通过向根际分泌特定的代谢物，选择性地从土壤环境中招募功能性微生物，以帮助植物抵御生物和非生物胁迫，从而增强其对环境的适应能力。根际微生物群落在促进氧化还原反应和营养元素循环方面也起着至关重要的作用，包括碳、氮、磷和硫，这些元素对植物生长和生产力至关重要。碳固定主要由光养型和化学自养型微生物完成。氮循环也是生态系统中重要的养分循环，包括几种微生物过程，如固氮、硝化、反硝化和矿化。硫循环主要包括硫酸盐还原和氧化。土壤中磷的有效性主要由微生物介导的矿化和增溶作用决定。 茶树(Camellia sinensis)是世界上具有重要经济价值的木本作物。茶叶的日消费量估计超过20亿杯，全球年产量约为500万吨，价值约57亿美元。尽管茶树的生态功能在很大程度上尚未开发，但它们在森林生态系统中也发挥着重要作用。L-茶氨酸是茶叶中特有的一种游离氨基酸，占茶叶中游离氨基酸总量的50%以上。L-茶氨酸可以在茶树的所有部位合成，但是主要在根部合成；它也被认为是茶树氮储存的主要形式。茶树中L-茶氨酸含量随季节变化而变化。随着天气变暖，L-茶氨酸含量下降，表明高温对茶叶中L-茶氨酸含量有负面影响。此外，成熟茶树中L-茶氨酸的生物合成主要发生在根部，然后转移到叶片。然而，据我们所知，茶树根系分泌物中是否含有L-茶氨酸、温度胁迫下根系分泌物中L-茶氨酸含量的变化，以及其分泌量的变化如何影响土壤微生物的组装和元素循环，目前还没有研究。因此，本研究旨在检测茶树根系分泌物中的L-茶氨酸含量，并分析L-茶氨酸对土壤中碳、氮、磷、硫等元素循环编码基因的组装和丰度的影响，有助于进一步揭示L-茶氨酸在茶树中一些未被探索的功能。  

结果

1 茶树根系向根际土壤中分泌L-茶氨酸 

采用LC-MS法鉴定根分泌物中的L-茶氨酸。L-茶氨酸标准品的总离子色谱图和质谱图分别如图1A和B所示。m/z 46.2和m/z 84.1是L-茶氨酸的特征离子。通过将茶树根系分泌物的总离子色谱图和质谱图(图1C和D)与标准品进行比较，证实了茶树根系可以将L-茶氨酸分泌到根际土壤中。

图1 根系分泌物的代谢组分析。(A) L-茶氨酸标准品的LC-MS总离子色谱图(TIC)；(B)L-茶氨酸标准品的质谱图，m/z 46.2和84.1是L-茶氨酸的特征离子；(C)根分泌物的LC-MS提取离子色谱图；(D)根系分泌物中L-茶氨酸的质谱图。 2 低温增加了茶树根系和根系分泌物中L-茶氨酸的含量

如图2所示，温度对茶树根系和根系分泌物中的L-茶氨酸的含量有显著影响。与常温(25℃)相比，低温(4℃)条件下根系和根系分泌物中的L-茶氨酸含量分别显著增加了2.03倍(P < 0.01)和16.19倍(P < 0.05)。高温(38℃)使茶树根系中L-茶氨酸含量较常温(25℃)显著降低2.13倍(P< 0.01)，但对根系分泌物中的L-茶氨酸含量无显著影响。这些结果表明，低温可以增加根际土壤中L-茶氨酸的含量。

图2 温度胁迫下L-茶氨酸含量。(A)温度胁迫对根系中L-茶氨酸含量的影响；(B)温度胁迫对根系分泌物中L-茶氨酸含量的影响，(星号代表显著性差异，*P < 0.05，**P < 0.01，单尾t检验，误差线表示标准偏差)。 

3 L-茶氨酸影响根际微生物群落的多样性

L-茶氨酸的浓度对根际细菌群落的多样性没有显著影响，如Shannon指数(图3A)。然而，L-茶氨酸处理14d后的Shannon指数显著高于处理7d的Shannon指数，这说明L-茶氨酸的处理时间(而不是浓度)可以增加根际细菌群落的α多样性。基于Bray-Curtis距离的PCoA结果表明，3种不同浓度L-茶氨酸处理7d后的根际微生物群落形成3个不同的分组，且沿第一坐标轴明显分离(图3B)，这表明L-茶氨酸的浓度显著影响了细菌群落结构。正如预期的那样，不同浓度L-茶氨酸处理14d的根际微生物群落呈现相似的情况(图3C)。此外，处理时间显著(P = 0.001)改变了细菌群落的结构(图3D)。

  图3 土壤细菌群落的多样性。(A)细菌群落的Shannon指数(柱形上方的不同字母表示显著性差异，P <0.05，误差线表示标准偏差)；(B) 0.1 μM(S1)、1 μM(S2)和10 μM(S3)L-茶氨酸处理7d后，基于Bray-Curtis距离的PCoA分析(P = 0.003，置换多元方差分析)；(C) 0.1 μM(F1)、1 μM(F2)和10 μM(F3)L-茶氨酸处理14d后，基于Bray-Curtis距离的PCoA分析(P = 0.003，置换多元方差分析)；(D)基于Bray-Curtis距离的PCoA在7d(D7)和14d(D14)显示出时间效应(P = 0.001，置换多元方差分析)。    

4 L-茶氨酸选择性地塑造根际微生物组组装

如图4A所示，变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和浮霉菌门(Planctomycetes)是丰度最高的几个门，其总丰度占总群落的80%以上。随着L-茶氨酸处理时间的延长，放线菌门、浮霉菌门和疣微菌门(Verrucomicrobia)的相对丰度显著增加(图S2A)，而厚壁菌门的相对丰度显著降低(图S2A)。此外，酸杆菌门和疣微菌门的相对丰度随着L-茶氨酸处理浓度的增加而增加。 在属水平上(图4B)，随着L-茶氨酸处理时间的延长，Acidothermus、Conexibacter、Mucillaginibacter和Mycobacterium的相对丰度增加(图S2B)，而Alicyclobacillus、Tumebacillus和Burkholderia的相对丰度降低(图S2B)。当L-茶氨酸的处理浓度增加时，Sphingomonas的相对丰度增加，而Acidothermus的相对丰度降低。此外，在L-茶氨酸处理7d和14d后，3种不同浓度处理共有的OTU数量从1423增加到1557，分别占总OTUs数的42.8%和44.3%(图4C和D)。

  图4 L-茶氨酸对土壤细菌群落的调节。(A)主要细菌门的相对丰度；(B)主要细菌属的相对丰度。0.1 μM(S1，F1)、1 μM(S2、F2)和10 μM(S3，F3)L-茶氨酸处理7d和14d；(C、D)维恩图显示，不同浓度L-茶氨酸处理7d (C)和14d (D)天后群落OTUs出现大量重叠，显示浓度效应。 

5 L-茶氨酸影响土壤中编码元素循环的基因丰度 

宏基因组学用于探究L-茶氨酸对元素(C、N、P、S)循环途径的基因丰度的影响。结果显示，L-茶氨酸处理后，碳固定途径包括还原型柠檬酸循环途径、还原型乙酰辅酶A途径、不完全还原型柠檬酸循环途径和3-羟基丙酸双循环途径相关的基因丰度略有下降，但不显著(图S3A，S4A)。 在氮循环途径方面，包括异化硝酸盐还原、同化硝酸盐还原、反硝化、固氮、完全硝化和硝化作用，在添加L-茶氨酸后，氮循环途径相关基因丰度降低，异化硝酸盐还原、反硝化和完全硝化途径基因丰度显著降低(图5B)。我们进一步分析了该通路中相关功能基因的相对丰度，发现硝酸还原酶相关基因(narH、napA、napB、narB)和烯烃单加氧酶α亚基基因(amoA)的相对丰度显著降低(P < 0.05)(图5A)，这与氮循环中的3个途径有关(图5C)。此外，nirA/K、narG(编码反硝化因子亚硝酸还原酶(NADH))、norB(编码一氧化氮还原酶)的丰度降低。 在磷代谢途径方面，与多磷酸盐合成途径相关的基因在L-茶氨酸处理后显著富集(P < 0.05)(图S4B)。负责无机磷酸盐(pstA)转运的基因丰度显著降低(P < 0.01)(图S3B)。在硫代谢方面，确定了三种途径：同化硫酸盐还原，异化硫酸盐还原和硫代硫酸盐氧化(图S3C)。L-茶氨酸处理后，与同化硫酸盐还原途径相关的基因丰度略有下降，但与硫代硫酸盐氧化途径相关的基因丰度略有增加(图S4C)。编码亚硫酸还原酶(cysI)和硫化物氧化基因soxA的丰度显著增加，但soxY的丰度显著降低(P < 0.05)(图S3C)，表明在群落中检测到了异养细菌的硫代硫酸盐氧化能力。

图5 参与N循环代谢的主要功能基因和代谢途径。(A)参与N循环代谢的主要功能基因，(*P < 0.05，单尾独立样本t检验)；(B)氮代谢通路富集分析，图中与该通路相关的基因丰度都降低了，0 μM(CK)和1 μM(T1)的L-茶氨酸处理14d(单尾独立样本t检验)；(C)氮代谢通路图。饼图表示N循环相关基因的相对丰度。

讨论

L-茶氨酸是茶树中一种特殊的非蛋白质氨基酸，已在几种茶树品种中检测到该物质。茶树主要通过从土壤中吸收氮从而在根系中合成L-茶氨酸，然后将其输送到植株的其他部位。植物根系向根际土壤中分泌大量的光合产物，以便更好地适应环境。本研究使用LC-MS证实了L-茶氨酸从茶树根系分泌到根际土壤中。通常，冬季和早春是茶树的根系更积极地从土壤中吸收和储存氮的时期。茶树总氨基酸含量与季节高度相关，其中冬季和早春的氨基酸含量高于夏秋季节的氨基酸含量。春季茶树初生芽中的氮大部分来自于树体自身储存，只有不到30%的氮来自于环境吸收。本研究显示茶树根系中的L-茶氨酸含量随着温度的降低而显著增加，这与前人的研究结果一致。 已有研究表明，植物根系分泌物中的一些物质，如黄酮类化合物、非蛋白质氨基酸、酰基高丝氨酸内酯、植物激素和三萜类化合物，可用作信号分子、诱导剂、激活剂、抑制剂等用于组装根际微生物群。在本研究中，L-茶氨酸改变了根际细菌群落的结构。变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)是L-茶氨酸处理后根际土壤中最丰富的类群。Ji等人发现酸杆菌门、变形菌门和放线菌门是茶园土壤中最丰富的类群，这与我们的结果相似，可能是由于茶树根系分泌的L-茶氨酸。考虑到L-茶氨酸是一种氨基酸，它可以被某些细菌用作营养物质的来源，这可能是一些主要微生物被富集的部分原因。据报道，谷氨酰胺(Gln)对厚壁菌门具有抑制作用。由于L-茶氨酸与Gln的结构相似，且L-茶氨酸也可以抑制厚壁菌门，这可以解释为什么用L-茶氨酸长期处理会降低厚壁菌门的数量。 根际微生物群的结构和多样性与根际土壤中参与微生物循环的功能基因的丰度密切相关。施氮是提高作物生长和产量的重要手段。然而，过多的氮输入导致产生活性N气体，对环境和人体健康产生负面影响。与NO3--N相比，茶树更偏好NH4+-N，而施入氨肥后茶树新梢中氨基酸含量高于施入硝酸盐肥料。有趣的是，L-茶氨酸降低了与反硝化途径相关的narH、napA和napB基因的丰度，从而减少了根际土壤中的氮损失。完全硝化途径的主要功能是将氨转化为硝酸盐。添加L-茶氨酸后，与该途径相关的基因丰度降低，这可能有利于茶树对土壤中铵的利用。宏基因组分析表明，反硝化作用和完全硝化作用主要与Alicyclobacillus、Burkholderia、Dyella、Mycobacterium和Massilia相关(图S5)。与16S DNA测序结果一致，在1-μM L-茶氨酸处理14d后，Alicyclobacillus、Mycobacterium和Dyella的相对丰度降低(图S2B和C)。这些结果表明，L-茶氨酸抑制了Alicyclobacillus、Mycobacterium和Dyella的生长，这可能减少氮损失并提高氮利用效率。 磷是核酸、脂质和能量储存分子的重要元素，因此，它是生物体的主要元素之一。L-茶氨酸处理后，与多磷酸盐合成途径相关的基因富集，而与磷酸盐转运系统相关的基因pstA/B/C/S丰度降低，表明细菌(如Dyella和Mycobacterium)对有机磷和无机磷的利用被抑制(图S6)。 硫在生物体内含量丰富，因为它是多种维生素、辅因子和氨基酸的必需元素。硫在茶树的光合作用和碳水化合物代谢中也起着重要作用。基因soxA/B/X/Z(编码硫代硫酸盐氧化酶)可以将各种还原硫氧化成硫酸盐(SO42-)。与硫代硫酸盐氧化途径相关的基因soxA/B/X/Z的富集可能有利于茶树对养分的吸收。宏基因组分析显示，硫代硫酸盐氧化途径的功能基因主要与Bradyrhizobium、Magnetospirillum、Paraburkholderia、Rhodopila和Candidatus Sulfopaludibacter相关(图S7)，其中Magnetospirillum和Candidatus Sulfopaludibacter的相对丰度在1-μM L-茶氨酸处理下增加(图S2C)，表明L-茶氨酸可以通过招募Magnetospirillum和Candidatus Sulfopaludibacter来促进茶树对硫的吸收。综上，茶树根系分泌的L-茶氨酸可以通过影响根际微生物群落组装来调节土壤中的元素循环，但具体的微生物有待分离，其功能有待进一步研究。

结论

本研究系统地研究了茶树根系分泌的L-茶氨酸对根际微生物群的结构和与元素循环相关基因的丰度的影响。结果表明，茶树根系分泌物中的L-茶氨酸含量随温度的变化而显著变化。L-茶氨酸的处理浓度和处理时间会影响根际土壤中细菌多样性、群落结构和与元素循环相关的基因丰度。特别是在用1 μM L-茶氨酸处理14天后，根际土壤中与反硝化和完全硝化途径相关的Alicyclobacillus、Mycobacterium和Dyella的相对丰度下降，而与反硝化和完全硝化途径相关的基因丰度显著降低，这表明L-茶氨酸可能对土壤中的氮损失产生积极影响，这在未来的研究中还需进一步证明。