科研丨Gut: 弯曲菌肠炎感染后肠功能障碍的特征是微生物多样性降低和微生物群恢复受损

编译：微科盟Ellen，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

肠胃炎后持续性肠功能障碍(感染后(PI)-BD))已得到广泛认可，但微生物群的相关变化尚不清楚。本研究旨在确定由空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)引起的肠胃炎后的肠功能障碍变化，检查微生物群的动态变化和抗生素的影响。本研究通过155例空肠弯曲菌感染患者在感染后不久(第1次就诊，<40天)以及40-60天和>80天后(第2次就诊和第3次就诊)记录了初始疾病的特征以及当前的肠道症状和肠道微生物群组成。利用16S rRNA测序评估微生物群。在完成试验的99例患者中，有22例出现PI-BD。这些病例报告粪便明显变稀，身体和胃肠道症状增多。评估微生物菌群发现，与44例年龄和性别匹配的对照组相比，22例患者的微生物多样性显著降低，微生物群组成发生变化。此外，感染后60天，病例显示包括厚壁菌门，特别是梭菌目(Clostridiales)和瘤胃球菌科(Ruminoccocaceae)在内的23个分类群的丰度显著降低，变形菌门丰度增加，梭杆菌和γ变形菌的水平增加。微生物群的变化与饮食有关；较高的纤维消耗与较低水平的γ变形菌有关。本研究表明，与恢复患者相比，PI-BD患者的微生物群似乎更受初始感染的干扰。高纤维饮食的益生元作用可能会抑制PI-BD中的一些紊乱。  

论文ID

原名：Postinfective bowel dysfunction following Campylobacter enteritis is characterised by reduced microbiota diversity and impaired microbiota recovery

译名：弯曲菌肠炎感染后肠功能障碍的特征是微生物多样性降低和微生物群恢复受损

期刊：Gut

IF：31.793

发表时间：2022.9

通讯作者：Robin C Spiller

通讯作者单位：英国诺丁汉大学

DOI号：10.1136/gutjnl-2021-326828

实验设计

本研究是一项单中心队列研究，研究对象是弯曲杆菌检测呈阳性的患者。临床研究包括所有155名合格的受试者，在微生物诊断后收集第一份粪便样本，并在诊断后6周和12周进一步采集样本。患者被要求在每次就诊时收集粪便样本。如果第1次就诊发生在诊断后5周内，则要求患者在第6周(通常是1周后)再次进行第2次就诊，以提供进一步的粪便样本。在诊断后12周的第3次就诊时，患者需要完成肠道症状问卷，并提供进一步的粪便样本。随后测定样本微生物组成、多样性、SCFA浓度，并进行统计分析。

图1 实验流程图。

结果

1 临床研究

在99名完成试验的受试者中，有22名受试者报告他们的肠道在感染后没有恢复正常(病例)，77名受试者的肠道恢复正常(对照组)。如表1所示，病例明显更可能是青年、女性，在躯体化评估上得分明显更高。PHQ-12 SS记录的病例与对照组的主要特征是睡眠困难、头痛、背部和四肢疼痛和嗜睡(图2A)。BD的主要特征包括腹胀加剧，更频繁更急迫疼痛发作，大便更稀疏或水样症状加剧(见表1)。

表1 基线时患者的人口统计资料。

图2 胃肠炎后3个月患者症状的差异(A)，病例和对照组的PHQ-12S平均得分；(B)稀便和水样便的比例及含水量；(C) 消化道症状。

2 PI-BD特征

感染3个月后，病例的特征是大便明显稀疏(图2B和表2)。病例的粪便含水量显著高于对照组(病例，n=14，均值(SD) 77.95(6.70)%；对照组，n=23，均值(SD) 71.97(7.83)%，Fisher检验p=0.04，图2C)。此外，更多的病例报告有急迫感、腹胀和明显的腹部肿胀(表2)。10例(45%) IBS符合Rome III标准，与其余12例不符合标准(PI-BD)非常相似，年龄、焦虑、抑郁和PHQ-12 SS无显著差异。此外，PI-BD和PI-IBS之间胃肠炎严重程度的标记物没有显著差异，包括发烧、便血、呕吐和抗生素使用(见在线补充表S1)。

表2 感染后3个月的肠道功能紊乱的特征(病例vs对照)。

3 肠胃炎严重程度的标志

本研究发现，患者在肠胃炎期间更有可能发烧(82%的病例和55%的对照组，p=0.02)，但其他严重性标志，如便血、呕吐或体重减轻，在病例和对照组之间没有显著差异(见在线补充表S2)。

4 抗生素及伴随用药对疾病恢复的影响

服用抗生素的病例与对照组的比例无显著差异(分别为41%和32%，Fisher检验p=0.45)。在疾病初期，接受抗生素治疗的患者似乎未出现更严重的症状，并且与未接受抗生素治疗的患者没有明显的临床特征不同(见在线补充表S3)，然而，他们更有可能因这种疾病去看 全科医生(GP)不 止一次(50% vs 28%，Fisher检验p=0.05)。本研究的大多数患者都很健康，没有服用任何药物，这当然会影响菌群。少数患者和对照组都服用了一系列药物，两组之间没有一致的差异(见在线补充表S4)。

5 饮食习惯

在第2次和第3次随访中，评估了受试者(19例病例和31例对照)的饮食习惯以及粪便SCFA(短链脂肪酸)浓度(14例病例和23例对照)。病例和对照组之间或两个时间点之间的任何营养成分或粪便SCFAs均无显著差异。

6 微生物群研究

在机制研究中，病例和对照组的人口统计学和疾病严重程度与大型队列研究没有显著差异(分别见在线补充表S6和S7)。

7 肠胃炎后40天内收集的样品的菌群组成受感染影响

对菌群组成影响最大的是自初次感染以来的时间，在12周的研究中逐渐恢复。早期样本在报告感染后不到40天内收集，与后期样本有显著差异(MANOVA, p=0.001，图3A)。微生物群恢复的差异见在线补充表S8- S10。此外，与对照组相比，病例组的菌群恢复有显著差异(MANOVA, p=0.045，图3B,C)。这些显著变化是由于Collinsella属(病例中平均相对丰度10.7%，对照组为4.31%，负二项广义线性模型q≤0.001)和Eggerthella属(病例中1.82%，对照组为0.18%，负二项广义线性模型，q=0.06，(在线补充表S8)。此外，厚壁菌门许多类群的病例均显著减少，其中包括粪杆菌属(Faecalibacterium)(病例6.06% vs 对照8.45%，负二项广义线性模型，q<0.001)、肠球菌属(Enterococcus)(病例0.05% vs 对照0.39%，负二项广义线性模型，q=0.003)和瘤胃球菌科(病例11.66% vs 对照18.22%，负二项广义线性模型，q<0.001)。

图3 感染后病例和对照组的微生物菌群恢复。(A) 所有受试者基于Bray-Curtis差异的PCoA图；(B)逆辛普森多样性；(C) 梭菌、Coriobacteriia和梭杆菌占总数的比例。

8 微生物群恢复

本研究旨在研究病例和对照组之间微生物菌群恢复的差异，并集中研究报告感染后60天以上收集的晚期样本，因为不再排除服用抗生素的个体，此时我们的样本最多。在这些样本中，病例的α多样性(病例均值12.1 vs对照组15.8，ANOVA，p=0.015)和丰富度(病例均值132.1 vs对照组149.2，ANOVA，p=0.017，在线补充图S1)与对照组相比显著下降。此外，在报告感染后60天以上收集的样本中，病例和对照组之间几个类群的丰度存在显著差异(表3)。厚壁菌门的细菌丰度显著下降，特别是梭菌目的丰度与对照组相比减少了20.1%。属于梭菌目的类群，如瘤胃球菌科和克里斯滕森菌属(Christensenella)都在病例中显著减少。此外，病例中有两个Coriobacteria属(Eggerthella和Goronibacter)较丰富，在报告感染后60天以上采集的持久性BD患者中，Coriobacteriaceae的丰度增加了32.2%。此外，梭杆菌门和变形菌门的几个类群也有所增加，其中克雷伯菌(Klebsiella)(γ变形菌纲微生物)增加了35.4倍。

表3 在报告感染后60天以上收集的样本中，病例和对照组之间的分类群存在显著差异。

9 微生物群与膳食成分、短链脂肪酸和粪便含水量之间的关系

尽管病例和对照组在饮食习惯(共54个记录)或SCFA浓度(共52个记录)方面没有差异，但我们发现了与他们的微生物群特征的几个关联。用线性模型计算出菌群组成与测量的SCFAs之间有38个显著关联(在线补充表S11)，所有值也都得到了显著的斯皮尔曼相关性支持。其中包括丁酸与粪杆菌属呈正相关(线性混合效应(log)，q=0.09, r=0.384)，总SCFA浓度与γ-变形菌呈负相关(广义线性混合模型，q=0.01, r=−0.36)。此外，与膳食成分有23种关联。变形菌的水平与纤维(广义线性混合模型，q=0.03, r=−0.46，图4)、非淀粉多糖(广义线性混合模型，q=0.05, r=−0.47)和淀粉(广义线性混合模型，q=0.003, r=−0.43)的摄入量之间存在很强的负相关关系。粪便含水量的增加与β变形菌纲细菌水平的增加相关(广义线性混合模型，q=0.03, r=−0.23)。

图4. 纤维消耗量与γ变形菌丰度之间的相关性。

讨论

本研究证实了先前的发现，PI-BD继发弯曲菌感染的特征是大便稀松、腹胀和急症。决定这种功能变化的因素尚不清楚，但我们现在报道PI-BD患者的肠胃炎菌群恢复比对照组更慢且更不完整。可能与菌群多样性显著降低相关，并且在感染后的60多天内的报告中，无论是否使用抗生素，这一现象都持续存在。这很可能是由于炎症，因为类似的菌群多样性丧失已被报道与克罗恩病和诺如病毒感染有关，并且我们发现也与变形菌的增加有关。在我们的研究中，病例在抗生素使用和疾病严重程度方面与对照组没有区别，除了报告发烧的比例更高(94% vs 55%)。因此，菌群的变化很可能反映了原有菌群的恢复能力和患者对空肠弯曲菌的炎症反应的综合效应。这耗尽了正常的共生细菌，并通过减少定植抗性，允许病原体增殖。

成人肠道微生物群的特点是存在于一种稳定的状态，需要大的干扰(如一次肠胃炎)才能永久改变这种状态。在该队列病例中，表明这种转变的是主要细菌类别的巨大和持续性变化，如梭菌水平的下降。梭菌是一种通常与健康益处相关的分类群，如SCFA的产生。我们发现，与对照组相比，感染60多天后，梭菌的减少与γ-变形菌等类群的增加相对应。有趣的是，γ-变形菌的水平与总SCFAs和更具体的丁酸和丙酸呈负相关。此外，患者对纤维、不易消化多糖和淀粉的消耗与γ-变形菌的丰度呈负相关。大量证据表明，高纤维摄入对健康的好处部分是通过增加短链脂肪酸的产生来调节的，短链脂肪酸的产生降低了结肠中的pH值，抑制γ-变形菌的生长。综上所见，这表明高纤维饮食有助于纠正菌群紊乱和预防PI-BD，这一点应该在随机对照临床试验中进一步评估。

结果表明，微生物多样性和厚壁菌门总数均显著减少，尤其是梭菌目和瘤胃球菌科类群。这可能反映了持续的肠道转运障碍，特征为大便含水量增加和稀便或水样便。这与之前的研究结果一致，即即使在健康受试者中，粪便软硬度也与多样性降低有关。在该研究中，大多数粪便较硬的个体都具有瘤胃球菌-拟杆菌肠道型，表明不同的一致性对不同的物种有利。快速转运和粘膜炎症都扰乱了结肠环境的厌氧性，使严格的厌氧菌消耗殆尽，使兼性厌氧菌和γ-变形菌、梭菌等快速复制的厌氧菌增殖并占据了空缺的生态位。最近在因肠胃炎住院的秘鲁儿童中也报告了类似的厚壁菌门的减少，特别是那些感染了空肠弯曲菌、志贺氏菌和沙门氏菌等细菌的儿童。IBD中厚壁菌门的持续减少和变形菌门的增加被认为代表了炎症过程中产生的小分子的增加，如一氧化氮和活性氧，它们可以作为兼性厌氧菌(如变形菌)的电子受体。

在我们的PI-BD病例中，早期感染后Coriobacteriea科的几个成员就增加了，并且在整个研究过程中持续增加。之前有研究也将这个菌科与肠易激综合征（IBS）联系起来。Vich Vila等人用宏基因组学研究了412名肠易激综合征患者，结果显示肠易激综合征患者的Coriobacteria水平增加，尤其是Eggerthella属。这与包括瘤胃球菌科在内的几种重要梭菌物种丰度的下降相辅相成，在我们的病例中也发现了这种模式。在Roux-en-Y手术治疗肥胖症后，Coriobacteria、Proteobacteria和Fusobacteria的丰度也有类似的增加。与之前的研究结果和我们的PI-BD患者的共同之处可能是通过肠道更快地转运，这会以多种方式改变结肠环境，包括减少次生胆汁酸、提高pH值和减少SCFAs等。

虽然梭杆菌只占总细菌的一小部分，但在整个研究过程中，我们病例中梭杆菌的比例明显较高。梭杆菌也被注意到是在霍乱弧菌感染后立即增殖的一种特征生物体簇的一部分。厚壁菌门较低而梭杆菌增多的模式令人感兴趣，因为在母系分离的应激大鼠中也存在同样的模式，并且母系分离大鼠对直肠膨胀的过敏严重程度与梭杆菌数量相关。此外，当给大鼠灌胃时，梭杆菌引起内脏过敏。

先前的研究表明，PI-BD的风险与最初损伤的严重程度成正比。研究人员发现，发热是PI-BD发生的一个重要风险因素，可能是反映C. jejuni感染引起的通透性增加的严重标志。我们的结果与最近的一项荟萃分析不同，在该荟萃分析中，服用抗生素被认为是发生PI-IBS的风险因素。然而，我们确实发现，服用抗生素的患者更有可能去看他们的全科医生不止一次，尽管他们有相似的疾病严重程度标记，所以这可能反映了寻求医疗保健行为的潜在差异，而不是抗生素的直接影响。我们发现患者的PHQ12-SS显著升高，证实了其他研究的结果，即不良心理特征，如神经质、抑郁和多种非胃肠道躯体症状，会增加感染后肠易激综合征的风险。最近有报道，与男性相比，女性发生PI-IBS的相对风险增加，平均(95% CI) 2.2(1.6-3.1)。在我们的研究中，尽管男性和女性参与的人数相同，但相对风险为4.2，但原因尚不清楚，性别似乎没有影响菌群。

在1286名感染患者中，只有一小部分人选择参加，这引发了偏倚问题。然而，发展PI-BD的受试者比例，22%非常接近我们之前报道的22%实际上非常接近我们之前报告的要求较低的调查中报告的25%，在该调查中，反应率要高得多，为72%。这表明肠道紊乱的严重程度并不是决定参与程度的主要因素，而是许多其他因素，如利他主义、靠近研究地点和工作时间的能力。PI-BD患者确实表现出更大的躯体化，这在其他研究中已经发现，但其潜在机制尚不清楚。通过选择那些肠道恢复正常的个体做对照，我们旨在控制影响感染性胃肠炎的因素，包括就诊和向公共卫生实验室发送粪便样本，其中包括年龄、性别、严重程度，最重要的全科医生的治疗方法差异很大，以及抽样还可能受到行政障碍的限制。这意味着我们无法在变化可能更大的时候尽早获得样本。我们的关注点主要是长期影响，试图通过分析服用抗生素后至少60天采集的样本来避免抗生素的影响，这是一种妥协，因为排除所有9/22例服用抗生素的患者会严重影响我们的研究。

像我们这样的描述性研究的一个重要限制是，它不允许人们区分因果。对病例中较低的多样性的另一种解释是，那些初始多样性较低的个体适应力较差，因此容易受到更严重的感染和肠道功能紊乱。有趣的是，在一项关于屠宰场工人空肠弯曲菌感染的前瞻性研究中，预先存在的丰度较高的拟杆菌和大肠杆菌增加了发生弯曲菌肠炎的风险，这表明这种情况导致了较低的定殖抗性。我们的研究补充了现有的信息，并进一步研究来确认这些发现，同时也包括干预措施，如高纤维/益生元或药物减缓转运，可能使微生物群正常化和改善症状。

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