快报 | MfpD介导的分枝杆菌氟喹诺酮耐受机制

Mycobacterium Fluoroquinolone Resistance Protein D (MfpD), a GTPase-Activating Protein of GTPase MfpB, Is Involved in Fluoroquinolones Potency

Yu Huang，Shuangquan Yan，Yuzhu Li ，Xuefeng Ai，Xi Yu ，Yan Ge，Xi Lv ，Lin Fan，Jianping Xie.

Microbiol Spectr，2022：e0209822.

doi: 10.1128/spectrum.02098-22. 

近日，来自西南大学生命科学学院的谢建平教授和上海市肺科医院范琳教授团队发表了题为Mycobacterium Fluoroquinolone Resistance Protein D (MfpD), a GTPase-Activating Protein of GTPase MfpB, Is Involved in Fluoroquinolones Potency的文章。该论文在今年12月1日在线发表在     Microbiology Spectrium杂志上。本研究发现分枝杆菌氟喹诺酮抗性蛋白D（MfpD）可以作为MfpB的GTP酶激活蛋白（GAP）调控MfpA的活性，影响分枝杆菌对氟喹诺酮的耐受。 结核病是单一致病菌感染致死人数最多的传染病，是全球公共卫生的重大威胁。其中，耐药结核病的控制形势尤其严峻。氟喹诺酮是临床上治疗耐药结核病的重要药物之一。

目前，分枝杆菌的氟喹诺酮耐药机制可分为三大类。第一类是其主要靶标DNA促旋酶的突变，突变改变了靶标和氟喹诺酮结合的能力；第二类是外排泵等基因突变，突变降低了药物在细菌内的有效浓度；第三类则是由分枝杆菌氟喹诺酮抗性蛋白（MfpA）介导的药物耐受。尽管MfpA在分枝杆菌的氟喹诺酮耐受中起重要作用，但其调控机制尚不清楚。 为了探究MfpD在分枝杆菌氟喹诺酮耐受中的作用，作者首先在分枝杆菌中构建了mfpD的过表达以及缺失菌株，并将上述菌株用氟喹诺酮处理，发现MfpD会影响分枝杆菌对氟喹诺酮的耐受。随后，作者又通过共转录实验证明了mfpD的表型与mfpA存在关联，并且排除了极性效应在mfpD表型中的作用。

接下来，作者通过上位效应实验和分枝杆菌蛋白片段互补（M-PFC）实验证明了MfpD通过直接作用于MfpB发挥功能。 MfpB作为小G蛋白参与MfpA的调控，而小G蛋白一般会受到GTP酶激活蛋白（GAP）、鸟苷酸交换因子（GEF）、鸟苷酸解离抑制因子（GDI）的调控。随后，作者通过同源比对发现MfpD和黄色粘球菌的GAP（MglB）高度同源。作者设计了生化实验验证MfpD作为MfpB的GAP的推测。首先，作者通过测定GTPase的反应速率发现，MfpD虽然不具有GTPase活性，但其可以加速MfpB的GTPase速率。GDP形式的小G蛋白，在氟化铝存在时，可以与其对应的GAP形成稳定的复合物。作者利用GAP这一重要特征证明了MfpD作为MfpB的GAP发挥功能。 GAP一般通过精氨酸指（arginine finger）稳定其对应小G蛋白的过渡态结构从而达到加速其反应速率的作用。

为了初步探究MfpD的作用机制，作者构建了MfpD的精氨酸点突变蛋白，发现MfpD并不存在真核生物同源分子中常见的精氨酸指。为了探究MfpB的G蛋白作用模式，作者对MfpB的G1和G3区的保守位点进行了突变后，结果表明MfpB的作用模式趋近于真核生物小G蛋白的Rab家族。 生化实验的结果表明，MfpB并不会参与MfpA对DNA促旋酶的保护，而遗传实验却得到了相反的结果。为了解决这一矛盾，作者又构建了MfpA， MfpA/MfpB的缺失菌株，并通过遗传实验证明了MfpB的确是通过MfpA发挥功能。另外作者还构建了蛋白实验中对应的基因对（pairwise）点突变菌株，通过表型实验证明了MfpB作为G蛋白参与MfpA的调控，且MfpA是MfpB的效应蛋白。 最后，作者提出来MfpD作用机制的模型。在分枝杆菌中，MfpD作为MfpB的GAP发挥作用。当MfpD缺失时，MfpB不再受到GAP的调控，因此其GTPase反应速率下降并造成GTP形式的MfpB积累。而GTP形式的MfpB又会激活MfpA，使其帮助DNA促旋酶对抗氟喹诺酮。     

在真核生物中，小G蛋白是一种广泛存在的分子开关，他参与调节细胞的各种生化途径。如最常见的Ras蛋白主要参与细胞增殖和信号转导，而Ras蛋白的第12位甘氨酸的突变与细胞癌变息息相关。同样的，在原核生物中小G蛋白也扮演着重要功能。在原核生物中，G蛋白会参与细菌分裂（FtsY）、蛋白翻译（TufA）、核糖体成熟（HflX，Obg）和细菌运动（MglA）等。对于原核生物中G蛋白的调控模式却知之甚少，目前只在黄色粘球菌中报导了G蛋白MglA的调控模式。只提到过分枝杆菌的Ndk蛋白作为真核生物Rho-GTPase的GAP发挥作用以及分枝杆菌噬菌体SWU1的gp67蛋白可能具有GAP功能，并无分枝杆菌蛋白对自身G蛋白调控研究的相关报导。总之，该研究丰富了原核生物中G蛋白调控模式的研究，并为研发控制结核病的新药物提供了候选靶标。

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编辑：王   然   

审校：郭   萌

发布日期：2022-12-16    

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