【神麻人智】吸入和静脉麻醉药对小鼠海马GABA能神经元突触前钙动力学的不同影响

摘要

背景：全身麻醉对突触传递有显著影响，但其对神经元和回路水平的影响尚不清楚。吸入麻醉药异氟烷在特定的神经元亚型中抑制突触囊泡的胞吐作用有差异，但其他常见的麻醉药是否也具有神经元亚型特异性的作用尚不清楚。

方法：我们使用基因编码的荧光Ca2+传感器GCaMP6f比较异氟烷、七氟烷、丙泊酚和氯胺酮对海马谷氨酸能神经元和海马细小白蛋白、生长抑素和血管活性肠肽表达（分别为PV+、SST+和VIP+）GABA能神经元间突触兴奋性的药理作用。

结果：异氟烷和七氟烷以神经元类型特异性的方式抑制活性驱动的突触前Ca2+瞬变，与PV+和VIP+神经元突触前激活相比，它们对谷氨酸和SST+的抑制作用更强。相比之下，临床浓度的丙泊酚(1uM)或氯胺酮(15uM)对突触前激活没有显著影响。丙泊酚增强了PV+神经元间的Ca2+流入，但仅在临床上浓度(3uM)时。

结论：在静脉注射或吸入性麻醉介导的麻醉中，对突触前Ca2+流入的麻醉剂选择性作用对海马神经回路的功能有影响。海马间神经元对突触前Ca2+的挥发性麻醉作用具有明显的亚型特异性敏感性，这与异氟烷和七氟烷的敏感性相似。

关键词：Ca2+；中间神经元；异氟烷；氯胺酮；麻醉机制；突触前；丙泊酚；七氟烷

本文要点

lGABA能中间神经元具有多种形式的突触抑制作用，但他们对麻醉药的不同药理敏感性尚不清楚。

l作者发现，异氟烷和七氟烷都以细胞类型特异性的方式抑制活性驱动的突触前Ca2+瞬变，而静脉注射药物氯胺酮和丙泊酚在临床没有显示出显著的抑制作用或细胞类型特异性浓度。

l这些结果提高了吸入性和静脉麻醉药对突触前兴奋能力有不同影响的可能性，这需要在更完整的神经网络模型中进行验证。

尽管在解决全身麻醉药和关键神经元蛋白之间的药理学相互作用方面取得了重大进展，但将这些相互作用转化为网络水平现象的细胞和回路效应尚不清楚。有大量证据表明，大脑皮层和海马体中遗传和功能上不同的神经元在控制认知、记忆和意识转变方面具有特殊作用，但缺乏对皮质和海马抑制性神经元亚型的麻醉作用的药理学研究。

最近研究表明，海马GABA能神经元间亚型对异氟烷抑制突触囊泡胞吐作用具有不同的敏感性，部分原因是电压门控钠通道（Nav）亚型的不同表达。鉴于这种神经元特异性药理学源自麻醉靶点Nav的不同表达，我们假设对其他麻醉药的敏感性也因神经元间亚型而异。因此，我们使用基因编码的荧光钙（Ca2+）传感器GCaMP6f，比较了四种临床常用的麻醉药（异氟烷、七氟烷、丙泊酚和氯胺酮）对培养的海马谷氨酸能神经元和三种海马GABA能间神经元（小白蛋白、生长抑素和血管活性肠肽表达）突触前兴奋性的影响。

结果

突触前Ca2+瞬变的神经元类型特异性测量：

在小鼠特定神经元亚群中表达GCaMP6f，测量特定海马神经元的突触前Ca2+浓度瞬变。图1a显示了用于靶向神经元亚群的转基因杂交组合。

我们使用Nkx2.1-Cre、SST-Cre和VIP-Cre菌株来靶向表达细小白蛋白、生长抑素和血管活性肠肽的中间神经元（分别为PV+、SST+和VIP+）。Nkx2.1-Cre靶向PV和SST中间神经元的神经祖细胞，使PV+细胞能够在PV完全转录之前在培养物中表达GCaMP6f。通过PV免疫染色，PV的早期表达用于鉴定Nkx2.1标记神经元中的PV+中间神经元。

图1b显示了GFP免疫标记的Cre驱动的GCaMP6f表达亚细胞分布。对于谷氨酸能神经元中的Ca2+测量，CaMKII启动子的GCaMP6f表达结构从GAD2-Cre::Ai14杂交中被转染到培养的神经元中，用红色荧光蛋白td-Tomato标记所有GABA能间神经元。转染GCamp6f的谷质神经元通过缺乏td- Tomato表达进行鉴定(图1c)。

GCaMP6f的表达在神经元体细胞和树突中产生明亮的静息荧光，在20 Hz下随着20次电刺激（假设产生20 AP）而增加（图1d）。“珍珠串”轮廓明显为点状，具有非常暗淡的静息荧光，在电刺激后增加，代表突触前静脉曲张，暗淡的静息荧光反射高基础 Ca2+ 缓冲。随着离多霉素处理，所有隔室的荧光进一步增加，表明体细胞和树突状Ca2+信号不会因20 AP的刺激而饱和。

在刺激诱发的AP序列中，对GCaMP6f荧光的分析显示出不同的Ca2+动态(图1e)。为了分离细胞反应，将ɑ-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸和n -甲基- d -天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂CNQX和DL-2-氨基-5-膦戊酸添加到成像缓冲液中，以防止复发性间接兴奋。与点状/轴突的Ca2+瞬变相比，体细胞和树突状Ca2+变化的幅度一贯较小(图1f)。这种模式与转染GCaMP6f的培养海马神经元中Ca2+瞬变的先前特征相匹配，未被亚型特异性标记。因此可能是兴奋性的，显示不存在或微弱的树突瞬变，与同一神经元内的轴突瞬变相比，波形较慢。

突触前标记突触素1的事后免疫染色显示与“珍珠链”轮廓重叠(图2a)。通过对Nkx2.1+神经元进行定点免疫染色，可以确定PV+神经元间boutons是否具有小清蛋白免疫反应性(PV+)(图2b)。在表达GCaMP6f的突触前末梢中发生的Ca2+瞬变的形态和动力学特征使其在海马培养物中被识别出来。

图1

神经元类型特异性突触前Ca2+瞬变。

图2

通过免疫标记术后识别突触前 boutons和PV+ boutons。

吸入性麻醉药对诱发的突触前Ca2+瞬变有差异性抑制作用：

我们建立了一种测量去极化诱发的不同神经元间亚型的突触前Ca2+的方法后，比较了不同类型麻醉药的突触前效应。图3a显示了在没有或存在挥发性药物异氟烷和七氟烷的情况下，测试刺激诱发的突触前Ca2+进入的灌注和记录范式，每种药物的浓度都相当于1.5 MAC。为了解释重复刺激的影响，在没有麻醉药的情况下，对每种细胞类型进行了对照记录，以测量刺激对神经元功能和活力的时间依赖性影响。每个实验单元进行3列20 Hz的20 AP训练：对照组、药物组和洗脱液。通过灌注液的气相色谱法验证，平均异氟烷和七氟烷的浓度分别为0.46（0.11）和0.70（0.13）mM。图3b和c显示了来自SST+间神经元的具有代表性的Ca2+瞬变痕迹。挥发性麻醉药对峰值Ca2+浓度的影响通常通过洗脱来逆转。

图3d和e显示了异氟烷和七氟烷对峰值Ca2+振幅的神经元类型特异性影响，量化为峰值 GCaMP6f 与基线荧光（∆F/F0 或 [F-F0]/F0）。异氟烷抑制谷氨酸能神经元和除 PV+外的所有中间神经元亚型中的峰值 Ca2+（图3d）。标准化值的单因素方差分析证实，异氟烷对峰值 Ca2+的抑制因神经元类型而异 (ANOVA3,39=4.190; P=0.0116)。PV+中间神经元与谷氨酸能神经元和 SST+中间神经元相比有不同的作用，但 VIP+中间神经元没有。

七氟烷同样抑制大多数中间神经元中的峰值Ca2+浓度（图3e）。方差分析和归一化值的事后分析证实，七氟烷对Ca+进入有明显的影响，这取决于神经元类型，其模式类似于异氟烷，其中PV+不同于谷氨酸能和SST+，但与VIP+不同。此外，七氟烷对VIP+神经元的作用与谷氨酸能神经元和SST+神经元间效应显著不同。

我们假设，神经元类型之间的这些差异反映了控制突触前Ca2+进入的麻醉靶点的不同表达，两种挥发性麻醉药之间的效果相似。

图3

异氟烷和七氟烷以神经元特异性的方式抑制突触前Ca2+。异氟烷和七氟烷活细胞成像灌注实验设计。电刺激(20AP, 20Hz)每隔5分钟进行一次。对照记录中省略了麻醉以评估刺激与刺激之间的变化。

静脉麻醉药不会改变诱发的突触前Ca2+瞬变：

我们还分析了最常用的静脉注射药物丙泊酚和氯胺酮的突触前作用。图4a显示了20 AP在20 Hz下诱发的Ca2+峰值的一系列测量的实验范式，重复刺激分别与二甲亚胺（DMSO）和丙泊酚和氯胺酮的水平对照进行了比较。丙泊酚在1和3 uM下检测，与临床和临床上浓度相对应，氯胺酮在15 uM的高麻醉浓度下检测。用于归一化的DMSO和水平见补充图2和3。图4b显示了丙泊酚1uM对Ca2+瞬变的DMSO-标准化细胞类型特异性影响，显示为对照刺激的百分比。单因素方差分析显示丙泊酚1 uM对神经元类型的影响没有差异（ANOVA3，21=1.532；P=0.262）。图4c显示了丙泊酚3uM的效果。归一化为DMSO对照后，单因素方差分析显示神经元类型之间没有差异（ANOVA3，36=0.1.727；P=0.179）。图4d显示了氯胺酮（15uM）的归一化值。方差分析表明氯胺酮对Ca2+瞬变峰幅度也没有神经元型特异性影响（ANOVA3，32=0.056;P=0.982）。

图4

静脉麻醉药对突触前Ca2+动力学的影响。

讨论：

皮质和海马中间神经元发挥不同的亚型特异性神经抑制形式，这些神经抑制有助于了解镇静/催眠药物在镇静和全身麻醉期间的神经元回路。PV+间神经元，它参与了调节与认知相关的40hz伽马节律。通过轴-体抑制控制AP的产生，SST+间神经元控制树突输入，VIP+间神经元通过抑制其他间神经元控制网格去抑制。因此，神经元间亚型特异性麻醉作用有望在麻醉期间调节网络功能。

我们最近发现，异氟烷对海马PV+和SST+间神经元的突触囊泡胞吐作用产生了神经元亚型特异性的抑制作用。突触囊泡的胞吐作用严重依赖于活性驱动的Ca2+内流入突触前末梢，这表明突触前兴奋性和Ca2+内流也对异氟烷具有神经元亚型特异性的敏感性。这些异质性的突触前药理特性增加了其他麻醉药具有不同的神经元间调节模式的可能性。

异氟烷和七氟烷对突触前兴奋性的不同影响

异氟烷作为一种具有代表性的挥发性麻醉药被广泛应用于研究，但在发达国家，七氟烷正在临床上取代异氟烷。基于它们结构上的相似性，我们认为分子作用在很大程度上是保守的。儿童临床使用七氟烷与兴奋和躁动有关，并与运动和癫痫活动增加有关。七氟烷增加了在体内培养的皮质神经元和躯体感觉皮质的细胞内Ca2+。七氟烷和异氟烷对未分类的海马神经元间突触反应也有明显的影响。根据这些观察结果，我们假设异氟烷和七氟烷对海马神经元的突触前Ca2+瞬变有明显的影响。

我们确定了挥发性麻醉药对谷氨酸能神经元和特定 GABA能中间神经元中突触前 Ca2+浓度影响的神经元类型特异性模式，在异氟烷和七氟烷之间是保守的。与谷氨酸能神经元和 SST+中间神经元相比，PV+中间神经元对七氟烷或异氟烷具有对抗性。 VIP+中间神经元对异氟烷的敏感性中等，而对七氟烷对谷氨酸能和SST+中间神经元的影响的敏感性较低。因此，网络兴奋性的总体变化可能是药物特异性的。与异氟烷相比，VIP+中间神经元在突触前 Ca2+瞬变方面表现出更大的减少，这一发现可能与使用七氟烷观察到的行为兴奋发生率增加有关，因为VIP+中间神经元介导谷氨酸能神经元的神经去抑制。

丙泊酚和氯胺酮不会影响突触前Ca2+瞬变

丙泊酚通过与β3亚基的相互作用增强抑制性突触后γ-氨基丁酸A型（GABAA）受体介导的Cl-电流。然而，一般认定的分子作用位点包括电压门控Na+通道，超极化激活的环核苷酸门控（HCN）通道，分子运动蛋白和囊泡释放蛋白。这些靶细胞的多样性增加了神经元间异质作用的可能性。丙泊酚在锥体和GABA能神经元间改变细胞兴奋性不同，GABAA受体在锥体神经元和神经元间突触前表达，具有细胞类型特异性亚基组成。我们研究了丙泊酚对突触前功能的神经元类型特异性影响。丙泊酚在超临床浓度下增强中间神经元突触前Ca2+瞬变，但临床浓度不低，与先前的观察一致。丙泊酚对神经递质释放机制的直接作用以干扰突触囊泡胞吐作用实现，这已在谷氨酸能突触中报道；然而，我们使用Ca2+指示剂评估突触前兴奋性，其调节位于突触囊泡胞吐机制的上游。孤立性皮质神经末梢的生化研究也不支持抑制作用，因为丙泊酚增加去极化诱发的GABA释放。

氯胺酮的亚麻醉浓度改变了皮质PV+和SST+神经元间蛋白中的树突状Ca2+浓度，这种机制与氯胺酮的抗抑郁作用有关。这些复杂的树突状Ca2+动力学变化促使我们研究了氯胺酮在麻醉浓度下对突触前Ca2+瞬变的影响。我们观察到氯胺酮在麻醉浓度下对突触前Ca2+浓度没有显著影响，表明培养物中分离的海马神经元对突触前兴奋性没有直接作用，支持其对其他靶细胞（包括NMDA受体和HCN通道）的主要作用。

局限性

我们研究的局限性包括使用轴突形态学作为突触前标记，使用GCaMP6f作为突触前兴奋性的指标，以及使用初级培养神经元作为实验模型。通过配对免疫染色和功能活细胞成像，我们将表达GCaMP6f的突触前区可视化为具有突触蛋白-1免疫活性、低静息荧光和动力学上独特的诱发Ca2+瞬变。基于这些和其他观察，我们得出结论，bouton形态学和Ca2+ kinetics作为突触前标志物是有效的。

另一种测量突触前Ca2+信号的方法是使用突触素融合的GCaMP6f（syn- GCaMP6f），它运输到突触前终端，是基于转基因小鼠用于Cre-依赖的特定神经元间亚群中GCaMP6f的表达。虽然转染的syn- GCaMP6f优于突触前靶向和单个细胞的特异性测量，但我们表明，转基因GCaMP6f表达对稀少表达的神经元亚群的神经元类型特异性测量是有效的。

尽管基于GCaMP6的Ca2+测量准确地反映了神经元的活性，但外源表达的GCaMP对Ca2+的缓冲或隔离可以改变Ca2+的动力学。例如，转染GCaMP6m的扩展表达改变了Held花萼的突触囊泡释放概率和短期抑制；然而，这可能是由于病毒转染后GCaMP表达增加有关。

虽然初代神经元培养是突触前功能活细胞成像的理想选择，但解离会破坏原生回路组织和突触连接，这可能会影响我们的研究结果。与具有完整神经回路的组织相比，分离培养的神经元具有有限的转化影响。尽管与体细胞Ca2+动力学相比，突触前Ca2+的定量很困难，但最近的进展，包括轴突靶向GCaMP6f，可以促进进一步的研究。

结论：

异氟烷和七氟烷以一种神经元类型特异性的方式，减少活性依赖的突触前Ca2+瞬变，而丙泊酚和氯胺酮则没有显著的突触前效应。考虑到海马-皮层间神经元的一般回路作用与皮质间神经元的作用大致相似，我们推测异氟烷和七氟烷的神经元选择性作用可能也适用于皮质间神经元。我们观察到七氟烷以相似但独特的细胞模式改变突触前Ca2+，就像异氟烷一样，这可能与七氟烷对神经元兴奋性的独特影响有关。吸入性和静脉麻醉药对细胞影响之间的重要差异具有功能意义，这应该在更完整的模型中进行验证。不同细胞类型之间的网络动力学和回路关系正在成为神经功能的一个关键方面；了解不同麻醉药对特定细胞相互作用的影响对于将突触机制与行为结果联系起来非常重要。

编译：陈荣民 黄燕若    

审校：罗猛强

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