快报 | 结核分枝杆菌新型表位疫苗ACP的构建及其免疫保护效率和免疫保护机制研究

Beginning of Winter

作者：龚文平，梁艳，米洁，薛勇，王杰，王兰，周育森，孙世惠，吴雪琼

第一作者及单位：龚文平，中国人民解放军总医院第八医学中心结核病医学部（原解放军第三〇九医院结核病研究所）

通信作者及单位：吴雪琼，中国人民解放军总医院第八医学中心结核病医学部（原解放军第三〇九医院结核病研究所）

A peptide-based vaccine ACP derived from antigens of Mycobacterium tuberculosis induced Th1 response but failed to enhance the protective efficacy of BCG in mice 

Gong W, Liang Y, Mi J, Xue Y, Wang J, Wang L, Zhou Y, Sun S, Wu X.

Indian J Tuberc, 2022, 69(4):482-495.

doi: 10.1016/j.ijtb.2021.08.016.

PMID: 36460380.

研究背景

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的一种传染病，已成为单一传染性病原体导致死亡的主要原因之一，仅次于新型冠状病毒肺炎（COVID-19）。从地理上看，大多数结核病新发患者来自东南亚、非洲和西太平洋地区。全世界2/3的结核病患者发生在以下8个国家，包括印度 (27%)、中国 (9%)、印度尼西亚 (8%)、巴基斯坦 (6%)、菲律宾 (6%)、孟加拉国 (4%)、尼日利亚 (4%)和南非 (3%)。令人担忧的是，这些国家都是发展中国家。当地经济水平和医疗卫生条件远远落后于发达国家，结核病的防治十分困难。作为唯一获得许可并广泛使用的结核病疫苗，卡介苗 (Bacille Calmette-Guérin，BCG) 已被153个国家推荐为国家儿童免疫规划的一部分，包括上述结核病高负担国家。BCG在预防儿童重症结核病方面具有一定的保护效果，但是对成人肺结核的预防保护效果不佳。因此，研发更加有效的新型疫苗是终结结核病的重要任务之一。

本研究采用生物信息学技术预测候选表位，采用酶联免疫斑点 (ELISPOT) 技术筛选和鉴定出了Th1免疫显性肽。在此基础上构建了一种新的结核表位疫苗并将其命名为ACP。此外，我们还在人源型和野生型C57BL/6小鼠中评价新疫苗的疗效，并在离体脾细胞中探索其潜在的免疫机制。

研究方法

本研究选择结核分枝杆菌H37Rv标准株的4个抗原Ag85A、Ag85B、CFP21和PPE18，采用生物信息学技术在IEDB数据库中预测潜在的免疫优势Th1表位。采用分子生物学技术人工体外合成上述预测的Th1表位，采用ELISPOT技术在HLA A11/DR1（HLA-A11+/+DR1+/+H-2-β2m-/-/IAβ-/-1) 人源化C57BL/6小鼠模型上筛选优势表位，选择能够诱导小鼠脾细胞产生显著高水平斑点数的表位为疫苗候选表位。随后，将这些动物实验鉴定出的表位用连接子连接后构建一个结核新型表位疫苗并将其命名为ACP。采用ACP免疫人源化C57BL/6小鼠和野生型C57BL/6小鼠，从细胞免疫和体液免疫两个方面评价其诱导的免疫学特性；通过体质量变化情况、脏器指数、病理分析、脏器菌落计数等方法评价其免疫保护效率。

研究结果

一、Th1优势表位筛选及ACP疫苗构建

通过生物信息学技术，我们从4个候选抗原中预测并筛选除了25个对HLA-DRB1*0101等位基因具有较高亲和力的表位。进一步通过ELISPOT实验鉴定出其中3条Th1多肽来构建新型表位疫苗ACP：Ag85B12-26 (GRRLMIGTAAAVVLP)、CFP2112-26 (VVVATTLALVSAPAG)和PPE18149-163 (AAAMFGYAAATATAT)。在此基础上，对ACP进行空间结构的预测（图1）。

图1  免疫显性肽筛选、ACP疫苗分子构建及其空间结构预测

二、ACP接种可使菌落形成单位(CFU)略有下降，但未能增强BCG的保护效果

免疫攻毒流程图见图2。在人源化小鼠中，我们的结果表明，接种BCG (P = 0.0032或P = 0.0194) 和BCG+ ACP (P = 0.0124) 的小鼠肝脏中的CFU明显低于接种ACP或PBS的小鼠 (图3A)。BCG免疫组 (P = 0.0379或P = 0.0441) 和BCG+ ACP免疫组 (P = 0.0092或P = 0.0110) 肺CFU均明显低于PBS或ACP免疫组 (图3B)。令人惊讶的是，虽然ACP接种小鼠肝脏或肺部的CFU低于PBS接种小鼠，但两组间差异无统计学意义。此外，ACP增强免疫对BCG的免疫保护作用没有显著增强。在野生型小鼠中，BCG、ACP和BCG + ACP接种小鼠的CFU均值均低于PBS免疫小鼠，但肝脏 (图3C) 和肺部 (图3D) 的CFU在各组间差异均无统计学意义。

图2  ACP免疫及攻毒流程示意图

图3  ACP免疫保护效率评价

三、单次ACP接种可轻微减少病理病变

在本研究中，我们采用组织病理学分析单次ACP疫苗接种及其增强疫苗接种的保护效果 (图4A)。研究结果表明，在人源化小鼠中，BCG+ACP免疫小鼠肺脏组织中淋巴细胞炎性浸润的严重程度评分明显低于PBS免疫小鼠 (图4B, P=0.0442)， ACP (P=0.0346)或BCG+ACP免疫小鼠 (P=0.0165) 肺脏组织肺泡壁增厚程度评分明显低于PBS免疫小鼠 (图4C)，BCG (P=0.0008)、ACP鼠 (P=0.0317)或BCG+ACP (P=0.0029) 免疫小鼠肝脏组织中肉芽肿数量均明显低于PBS免疫小鼠 (图4D)。相反，在野生型小鼠中，各组间淋巴细胞炎性浸润的严重程度评分 (图4E) 和肺脏组织肺泡壁增厚程度评分 (图4F) 的差异均无统计学意义，BCG+ACP免疫小鼠采集的肝脏肉芽肿数量明显高于PBS免疫小鼠 (图4G, P=0.0390)。

图4  ACP多表位疫苗免疫小鼠的组织病理学特征分析

四、ACP疫苗可诱导高水平的IFN-γ+ T淋巴细胞

虽然构成ACP疫苗的每一肽都能诱导脾细胞分泌高水平的IFN-γ，但目前尚不清楚这些肽串联组成的ACP是否具有相同的能力。因此，在本实验中，我们采用ELISPOT技术评估了不同抗原 (PBS, BCG, ACP, BCG+ACP) 免疫的人源型和野生型小鼠诱导APC特异性IFN-γ产生的能力。结果显示，ACP疫苗诱导人源化小鼠 (图5A, P = 0.0043) 和野生型小鼠 (图5B, P = 0.0066) 脾脏中IFN-γ+ T淋巴细胞增多。

图5 ELISPOT技术检测ACP诱导的IFN-γ+ T淋巴细胞数目

五、ACP单独接种或BCG+ACP接种可刺激Th1型细胞因子水平升高

在人源化小鼠中，BCG + ACP免疫小鼠脾细胞分泌的IL-2水平明显高于PBS、BCG或ACP免疫小鼠（图6A，P值均<0.0001），但BCG + ACP免疫小鼠的IL-6 (图6B, P = 0.0002)、IFN-γ (图6C, P = 0.0286) 和肿瘤坏死因子-α (TNF-α，图6D, P = 0.0001) 水平均低于PBS免疫小鼠。此外，ACP免疫小鼠IL-6水平高于BCG或BCG+ ACP免疫小鼠 (图6B, P = 0.0082或P<0.0001)。有趣的是，ACP免疫小鼠的IFN-γ水平高于PBS (图6C, P = 0.0361) 或BCG + ACP免疫小鼠 (图6C, P = 0.0286)。ACP免疫小鼠TNF-α水平高于BCG或BCG + ACP免疫小鼠 (图6D, P = 0.0014或P<0.0001)。

在野生型小鼠中，BCG + ACP免疫小鼠IL-2 (图6E, P = 0.0241)、IL-6 (图6F, P = 0.0058)、IFN-γ (图6G, P = 0.0269)、TNF-α (图6H, P = 0.0286) 水平均明显低于PBS免疫小鼠。相比之下，ACP免疫小鼠的IL-2 (图6E, P = 0.0263或0.0063)、IL-6 (图6F, P = 0.0036或0.0009)、IFN-γ (图6G, P = 0.0164或0.0106) 和TNF-α (图6H, P = 0.0286) 的水平均高于BCG或BCG + ACP免疫小鼠。此外，其他细胞因子 (IL-4、IL-10和IL-17A) 在4组人源型小鼠和野生型小鼠之间的差异均无统计学意义。

图6 ACP疫苗在人源化和野生型小鼠模型上诱导的细胞因子分析

六、ACP疫苗可诱导人源化小鼠产生高水平抗体，但对野生型小鼠无明显影响

ELISA检测PBS、ACP或BCG + ACP免疫小鼠血清中ACP特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体水平。在人源化小鼠中，第一次免疫后第14天，ACP或BCG + ACP免疫小鼠的IgG (图7A, P<0.001)、IgG1 (图7B, P<0.01) 和IgG2a (图7C, P<0.05) 抗体水平均明显高于PBS免疫小鼠。之后，IgG、IgG1、IgG2a抗体水平开始逐渐下降，在第28天达到低谷，在第56天反弹至峰值，之后开始下降。但野生型小鼠组间抗体水平的差异无统计学意义，野生型小鼠未观察到抗体水平与人源化小鼠相似的趋势 (图7D～7F)。有趣的是，在人源型小鼠 (图7G) 和野生型小鼠 (图7H) 中，IgG2a与IgG1的比值均高于1，表明ACP诱导的免疫反应倾向于Th1型免疫。

图7  ACP特异性IgG, IgG1和IgG2a抗体检测

研究结论

综上所述，目前的研究发现了3种可以刺激脾细胞分泌高水平IFN-γ的免疫优势肽，并通过将这些免疫优势肽线性连接制备了一种新的结核表位疫苗ACP。我们的研究表明，ACP疫苗可诱导小鼠Th1型免疫应答明显升高，并可轻微减少小鼠肺脏结核分枝杆菌菌载量和病理损伤。然而，当使用它作为BCG初免后的加强免疫时，ACP疫苗并没有明显增强BCG对人源型或野生型小鼠的保护效力。这些数据提醒我们，今后在设计结核病疫苗时，不仅要考虑CD4+ T淋巴细胞的作用，还要考虑CD8+ T淋巴细胞和B淋巴细胞的作用。

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供稿：龚文平

编辑：孟    莉

审校：范永德

发布日期：2022-12-15

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