科研丨南宁师大: 气候和营养物质调节红树林生境中抗生素抗性基因组的生物地理格局和健康风险(国人佳作)

编译：李楠，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

红树林生境易受到污染，并充当抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的汇。然而，关于大尺度范围内，红树林生态系统中ARGs的人类健康风险及其影响因子的认识仍然有限。本研究结合高通量测序技术与ARG风险评估框架，调查了我国华南红树林湿地ARGs的分布特征及其公共健康风险。结果显示，共检测到456个ARG亚型，其中71个为高风险ARGs，占ARG总丰度的0.25%。ARGs和细菌群落都表现出距离-衰减的生物地理关系，但ARGs斜率更大。共发生网络特征与高风险ARG丰度之间的线性回归分析表明，网络中的连接数增加会导致更高的健康风险。结构方程模型表明，地理距离和可移动遗传元件(mobile genetic elements，MGEs)是ARG分布格局最主要的影响因素，ARGs和MGEs对红树林生态系统中ARG的健康风险状况影响最大。本研究为红树林生态系统中ARG的生物地理格局及其健康风险评估提供了新见解，并对红树林环境管理中的ARG风险控制具有深远的意义。

图文摘要

论文ID

原名：Climate and nutrients regulate biographical patterns and health risks of antibiotic resistance genes in mangrove environment

译名：气候和营养物质调节红树林环境中抗生素抗性基因的生物地理格局和健康风险

期刊：Science of the Total Environment

IF：10.753

发表时间：2022.9

通讯作者：李楠

通讯作者单位：南宁师范大学北部湾环境演变与资源利用教育部重点实验室

DOI号：10.1016/j.scitotenv.2022.158811

实验设计

图1.红树林沉积物七个采样区的分布。

结果

1 红树林生态系统中抗生素抗性基因和细菌群落的分布格局 

本研究对105个样本(7个站点×5个样地×3个重复=105个)进行了宏基因组测序(图1)。这七个站点之间的环境因子差异显著(表S2)。此外，ARGs和MGEs的总丰度在7个站点之间也有显著差异(p < 0.001)。ARG和MGE的丰度在L6站点最高(分别为140.53/Gb和61.88/Gb)，而在L7站点最低(分别为11.79/Gb和4.28/Gb)(图2A和图S1)。在检测到的456个ARG亚型中，有70个分布于红树林生态系统的所有站点。其中，最丰富的ARGs为vanR(万古霉素)、bcrA(杆菌肽)、vanS(万古霉素)和macB(大环内酯-林可酰胺-链阳霉素B，MLS)，分别占ARG总丰度的11.78%、8.62%、8.42%和6.99%。 为了进一步描述ARGs的组成，本研究根据ARGs的24种靶标抗生素分析了ARG的丰度比例。在这24种ARG抗性类型中，多样性最高的ARG亚型是Beta-Lactam(β-内酰胺类抗生素，154个)，之后是multidrug(多重耐药，77个)、MLS(MLS抗生素，52个)、tetracycline(四环素抗生素，42个)和aminoglycoside(氨基糖苷类抗生素，38个)。在每个站点，ARG亚型数量在113—321个之间(表S3)。所有24种ARG抗性类型的丰度在各站点间存在显著差异(p < 0.01)。主要的ARG抗性类型包括万古霉素(24.65%)、多重耐药 (13.19%)、MLS抗生素(11.26%)、杆菌肽抗生素(9.40%)和四环素抗生素(7.57%)。这些ARGs包含人类和动物常用的抗生素类型，且在所有样本中都能检测到(图2A和图S1)。此外，在红树林样品中共鉴定出55个MGE亚型。其中，丰度最高的MGEs为TnpA(转座酶，47.23%)、IS91(插入序列，20.58%)、intI1(整合酶，5.48%)、ISCR8(插入序列共同区，4.22%)和orf513(插入序列共同区，3.72%)，它们分布于所有站点，共占MGEs总丰度的81.23%(图2A)。

在红树林沉积物中，共发现3191个属。细菌群落主要由10个纲主导：γ-变形菌纲、δ-变形菌纲、α-变形菌纲、ε-变形菌纲、芽孢杆菌纲、放线菌纲、β-变形菌纲、黄杆菌纲、拟杆菌纲和硝化螺旋菌纲。其中，γ-变形菌纲占细菌总丰度的35.31%，δ-变形菌纲占16.18%(图2B和图S2A)。在不同站点中，所有纲所占比例都存在显著差异(p < 0.05)。

图2.ARG和MGEs分布格局(A)以及细菌群落分布格局(B)。 

2 红树林生态系统中ARGs的健康风险评估

本研究共检测到71个高风险ARGs：57个I级ARGs和14个II级ARGs。这些高风险ARGs占ARG亚型总数的比例在0.199%(L5)至0.429%(L7)之间(图3A)。高风险ARGs丰度在0.045/Gb(L7)至0.292/Gb(L6)之间(图3B)。高风险ARGs占红树林湿地ARG总丰度的0.25%，在单个站点占比为0.17%(L5)至0.39%(L1)(图3B)。在所有站点中，I级ARGs比II级ARGs丰度更高，占高风险ARG丰度的72.68%(L3)至93.94%(L7)(图3B)。gadX(I级)、qnrS(I级)、fosB(I级)、vatE(II级)和tetW(II级)是丰度最高的高风险ARGs。其中，gadX和tetW分布于所有红树林站点。

图3.单个风险ARGs的百分比(A)以及ARG的分布格局(B)。 

3 细菌群落与ARGs的生物地理多样性 

根据Shannon指数，最低纬度L1站点的ARG α多样性最高(范围为3.96-4.31)，而最高纬度L7站点的α多样性最低(范围为3.67-4.25)(图S3A和表S3)。ARGs的α多样性随纬度增加而下降，且在不同站点间有显著差异(图S3A)。与ARGs不同，细菌Shannon指数随纬度增加而增加，高纬度(L6和L7)的细菌Shannon指数比低纬度(L1和L2)高(图S3B和表S3)。基于Bray-Curtis距离进行了PCoA分析(图S3C)，前两个轴分别解释了ARG组成变化的27.53%和20.34%。上述结果表明，不同站点中的ARGs分布格局是不同的，且ANOSIM(p < 0.01)分析也支持这一结果。同样，细菌群落的PCoA分析(图S3D)也表明细菌群落根据不同的地理位置各自聚类(ANOSIM, p < 0.01)。 线性回归分析表明，细菌和ARG的α多样性变化与空间距离呈正相关(p< 0.001)(图4A)。细菌的斜率比ARGs更大(图4A)，表明在地理大尺度范围内细菌的α多样性比ARGs的变化更大。对于β多样性，在细菌群落和ARG组成结构中都有显著的(p < 0.001)线性距离-衰减关系(图4B)，且ARGs的斜率比细菌更大(图4B)，这表明与细菌群落相比，历史过程(如地理隔离)对ARG组成的影响更大。

图4.空间距离与多样性(A)及Bray-Curtis相似性(B)(ARGs和细菌群落)的线性回归。 

4 红树林生态系统中ARGs、MGEs和细菌群落的共发生模式

细菌属、ARG和MGE亚型之间的共发生网络包括143个节点和1017条边，聚类系数为0.662，平均度为14.224，模块化指数为0.237(图5A和表S4)。正相关的边在网络中占主导地位(图5A和表S4)，表明ARG、MGE和细菌之间存在很强的共发生关系。 相对丰度高于0.01%的4个细菌属(芽孢杆菌属、Methyloceanibacter、Hyphomicrobium和拉布伦氏菌属)与11个ARGs显著相关，是ARGs的潜在细菌宿主(图5A)。int2、int3、intI1、ISBf10、ISCR8和Tn916是与ARGs最频繁相关的MGEs(至少六个直接连接的边)(图5A)。整合酶基因int3与超过33个ARGs显著相关(图5A)。这些MGEs有通过水平基因转移传播ARGs的潜在重大风险。在ARGs的所有类型中，多重耐药基因在网络中出现频率最高，其次是MLS抗性基因(图5A)，表明这些丰富的ARG抗性类型对共发生关系有重要的贡献。此外，在共发生网络中，细菌属中的小红卵菌属、鲁杰氏菌属、拉布伦茨氏菌属、Rhodobacter以及假鲁杰氏菌和MGEs中的int3、intI1、int2、ISBf10以及ISCR8是各自组内度(degree)最高的节点(图5A和表S5)。

为检验网络结构是否决定了ARG风险模式，本研究构建了每个采样点的子网络(图S4)，并对网络拓扑特征和高风险ARG丰度进行了线性回归分析。三个拓扑特征——总边数、正相关边数和模块化——对高风险ARG丰度有显著影响(p < 0.05)(图5B)。总边数与正相关边数正相关，与模块化负相关。

图5.ARGs与MGEs和细菌群落的共发生网络(A)。关键理化性质与高风险ARGs丰度的线性回归(B)。

5 解释抗性和健康风险的多驱动因子 

Mantel检验表明气候、营养盐、土壤性质以及空间因素与细菌群落、MGE、ARG组成以及高风险ARGs显著相关(表S6)。PO43−(r = 0.472, p <0.001)和MAP (r = 0.391,p < 0.001)是与细菌群落呈显著正相关的两个最重要因素，而SO42-(r = 0.696, p <0.001)是影响MGE组成的最重要营养因素。土壤温度和三种营养物质SO42-、TIC和NO2--N与ARG组成显著相关(p < 0.05)。高风险ARG组成与温度(r = 0.236, p < 0.01)，SO42-(r= 0.241, p < 0.01)、C/N (r = 0.196, p< 0.05)、NO2--N (r = 0.168,p < 0.05)和MAT (r = 0.144, p < 0.01)呈显著正相关。只有MAT显示出与MGE、ARG、高风险ARGs的组成以及细菌群落有显著相关性。

结构方程模型分析结果(图6A)表明，模型分别解释了红树林沉积物中ARGs及其健康风险总方差的85%和41%。土壤性质与细菌群落(λ = 0.131, p < 0.05)以及MGEs (λ = 0.029, p < 0.05)正相关，与ARG组成负相关(λ = -0.032, p > 0.05)。营养物质与ARG组成(λ = 0.012, p < 0.01)和MGEs (λ = 0.298, p < 0.001)正相关，与细菌群落负相关(λ=-0.183, p > 0.05)。气候因素与细菌群落(λ=0.330, p < 0.001)显著正相关，但与ARGs (λ=-0.189, p < 0.01)和MGEs (λ = -0.128, p < 0.001)负相关。空间因素显著影响细菌群落(λ = -0.051, p < 0.05)、MGEs (λ = 0.530, p < 0.001)和ARGs (λ = 0.210, p <0.001)。最后，这些环境和地理因素通过细菌群落(λ = 0.050, p > 0.05)、MGEs (λ = 0.009, p<0.001)和ARGs (λ = 0.586, p<0.001)影响红树林的ARG健康风险。如结构方程模型的标准总效应所示，ARG组成(λ = 0.623)是红树林沉积物中高风险ARGs的最重要影响因素，其次是MGEs (λ = 0.416)(图6B)。只有气候因素与红树林中高风险ARGs呈负相关，且它的相关性比土壤性质和营养物质更高(图6B)。

图6.非生物和生物因素对红树林生态系统中高风险ARGs模式多重影响的结构方程模型(SEM)分析(A)，它们的标准化总效应(B)以及不同因素及其相应潜在变量之间的路径系数(C)。

讨论

本研究中，红树林沉积物共发现456个ARG亚型，这说明ARGs在红树林生态系统中普遍存在。其中，万古霉素抗性基因是红树林生态系统中最主要的ARG基因(图2A和S1)。它被认为是最有效的“最后防线”抗生素，这种抗性通常是未受干扰环境样本的内在特征。此外，放线菌能产生万古霉素，它们广泛分布于红树林环境中。本研究中，放线菌是最丰富的细菌门之一，分布于所有红树林站点(图2B和图S2B)。因此，推测在红树林沉积物中观察到的万古霉素耐药性，可能是源于丰富的放线菌产生的选择压力以及它们自身的万古霉素抗性基因。多重耐药抗性基因是丰度第二的ARG，也是其他红树林中常见的丰富抗性基因类型。红树林生态系统中如此丰富的多重耐药抗性基因可能是由于人为活动造成的，因为中国红树林环境常受到水产养殖的影响。例如，在中国南方高桥红树林的水体和沉积物中就检测到多种水产养殖中使用的抗生素。多重耐药ARGs的富集可能有助于细菌宿主在人为影响环境中的耐受性。除了L6站点(140.53/Gb)之外，红树林采样区的ARG丰度在11.79/Gb~55.25/Gb之间(图2A和表S1)，这与中国中部一个大型饮用水湖泊巢湖的水样(15.2/Gb~57.79/Gb)相似。低于更受ARG污染的环境，例如城市河流(107.7/Gb~1004.1/Gb)和猪、鸡以及人类粪便废水入水口(高达7762/Gb)。这些结果表明，与人为污染环境的ARG负荷相比，自然环境的ARG负荷相对较轻。与先前研究结果一致，红树林中的低ARG负荷可能与红树林环境减少ARG的能力有关。 不同地区的气候、抗生素消耗、法规、发育水平和其他方面的差异可能导致ARG差异，并产生不同的抗性基因地理格局。本研究中，ARGs和细菌群落的Shannon指数沿采样区显著变化(p < 0.05)(图S3A和图S3B)，这表明红树林采样区之间ARGs和细菌多样性存在差异。另外，Shannon指数在ARGs和细菌中表现出相反的纬度趋势(图S3A和图S3B)，表明气候变化沿纬度对ARG和细菌多样性的影响是不同的。本研究中，发现ARGs和细菌群落都存在显著的距离-衰减关系(图4B)。这与之前对澳大利亚土壤和中国饮用水源等自然环境中ARGs和细菌群落的大尺度研究类似，表明了扩散限制对其分布有关键的影响。然而，ARGs的距离衰减斜率比细菌群落更大(图4B)，这意味着扩散限制对ARGs和细菌群落的影响在不同生境中有所不同。综上所述，尽管ARG和细菌群落在空间大尺度上表现出相似的生物地理学特征，但ARG受扩散限制的影响更大，这并不完全是由细菌的扩散限制造成的，这在一定程度上反映了红树林生态系统中ARG与细菌群落之间的异步或解耦关系。 随着科学研究进入了分子监测的时代，重要的是解释环境中ARGs的风险，而不仅仅是记录它们的存在和浓度。在红树林环境中检测到71种高风险(即I级和II级)ARGs。它们仅占ARG总丰度的0.25%，远低于III级和IV级ARGs丰度(图3B)。近年来，张彤教授课题组(2021)在医院收集的116个宏基因组中发现了145种高风险ARGs，并发现其丰度显著(p< 0.01)高于III级和IV级ARGs。此外，在香港污水处理厂的废水中检测到72种I级ARGs，占ARG丰度的1.01% - 3.86%。与这些临床和废水处理厂环境相比，高风险ARGs的多样性和丰度相对较低，表明与人为污染的环境相比，红树林生态系统的抗性基因健康风险更低。与此一致，最近对地球微生物基因组的ARGs分析表明，在陆地、水生和空气环境的自然生态系统中存在较少的高风险ARGs。 以往研究通过分析ARGs、MGEs和细菌群落之间的共发生模式，推断复杂环境中ARGs的潜在宿主。本研究发现芽孢杆菌属、Methyloceanibacter、生丝菌属和拉布伦茨氏菌属是中国华南红树林沉积物中ARGs的主要潜在宿主(图5A)。芽孢杆菌属和拉布伦茨氏菌属是此前沿海海水养殖系统中发现的耐药细菌分离株。而另一基于宏基因组组装的研究表明，生丝菌属是饮用水处理厂中携带ARG的主要细菌。本研究结果表明，红树林环境受到一定程度的人为ARG污染。与此一致，ARGs和网络中intI1之间有高度连接(图5A)，该MGE被认为是人为污染的代表。此外，发现作为ARGs潜在宿主的Methyloceanibacter是红树林沉积物中的主要甲烷利用细菌，这表明ARGs的广泛分布可能会影响红树林湿地的生物地球化学循环。网络中MGEs和ARGs的共发生关系可以反映ARGs在不同细菌宿主中的HGT风险。与之前的研究类似，本研究还发现了ARGs、MGEs和细菌群落之间的复杂关系，这意味着在红树林生境中，MGEs在ARGs经HGT增殖的过程中有重要作用。此外，线性回归分析表明，总边数和正相关边数两个拓扑特征显著增加了高风险ARGs的丰度(图5B)，表明ARGs、MGE和细菌群落之间共发生关系的强度增加将提高健康风险。相比之下，模块化表现出负相关关系(图5B)：随着网络中模块的数量减少，风险增加。这些发现表明，随着共发生网络中的连接增加(即ARGs、MGEs和细菌群落之间的关系更加紧密)，红树林生态系统的健康风险将增加。 在本研究中，多种环境因素与细菌群落、ARGs、MGEs和高风险ARGs显著相关(表S6)。结构方程模型已被用于确定不同环境中ARGs的关键影响因素。本研究也进行了结构方程模型分析，以进一步研究多种非生物和生物因素对高风险ARG的影响，以及阐明变量之间的直接和间接关系。如图6A所示，营养物质、气候和空间因素通过MGEs和ARGs影响高风险ARG，而土壤性质仅通过MGEs影响高风险ARG。如结构方程模型的标准化总效应所示，对高风险ARG影响最大的因素是ARGs和MGEs(图6B)，表明它们对红树林湿地ARG健康风险的贡献最大。此外，我们的结果显示，MGEs而不是细菌群落对ARGs有显著贡献(p < 0.001)(图6A)。这与河口、沉积物和河流微塑料的几项研究结果相似。这可能是因为质粒和整合子等MGEs可以通过HGT在不同生境不同细菌分类群中传播ARGs。事实上，在农业土壤和废水中发现细菌群落对ARGs变化的影响大于MGEs，这表明在这些环境中，与MGEs介导的HGT相比，细菌群落的进化是ARG分布的主要驱动因素。换言之，我们的结果表明红树林环境中的ARG健康风险格局与MGEs和ARGs的分子生物学机制更相关。总之，在大的地理尺度范围内，气候和营养物质是调节ARGs和MGEs分布的主要因素，也能进一步影响红树林生态系统的ARG健康风险格局。考虑全球气候变化的影响以及限制富营养化污染物的人为排放，有助于环境管理者制定控制环境ARG的措施。

结论

利用宏基因组学方法，本研究探索了中国华南七个沿海红树林湿地ARGs的生物地理格局及其人类健康风险。红树林生态系统中普遍存在多种ARGs，但与人为污染环境相比，其含量和健康风险相对较低。ARG、MGE和细菌群落之间的共存关系对ARG风险有潜在影响，共发生网络中的连接越多，红树林生态系统中的健康风险越高。非生物因素(包括土壤性质、营养物质、气候和空间因子)通过MGE和ARG影响高风险ARG。生物因素ARGs和MGEs对红树林生态系统的ARG健康风险格局贡献最大。细菌群落对ARGs及其风险无显著影响，表明ARGs与细菌群落之间存在异步和解耦关系。总之，研究结果促进了沿海人类活动影响和气候变化背景下红树林生态系统中ARG风险的理解，并有助于改善抗生素抗性的环境管理，以维护人类健康。