科研丨港中大(IF:31.7): 香烟烟雾通过调节肠道菌群和相关代谢物促进结直肠癌(国人佳作)

编译：微科盟听雪斋，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

吸烟是结直肠癌(CRC)的主要风险因素。本研究旨在调查香烟烟雾是否通过改变肠道微生物群和相关代谢物来促进CRC。经偶氮甲烷处理的C57BL/6小鼠每天暴露于香烟烟雾或清洁空气2小时，持续28周。同时对小鼠粪便进行鸟枪法宏基因组测序和液相色谱-质谱分析，以研究微生物群和代谢物的变化。用来自暴露于烟雾和无烟对照小鼠的粪便移植无菌小鼠。结果表明，与无烟对照小鼠相比，暴露于香烟烟雾的小鼠肿瘤发病率和细胞增殖显著增加。在暴露于烟雾的小鼠中观察到肠道菌群失调，其中细菌种类的丰度存在显著差异，包括Eggerthella lenta的富集以及Parabacteroides distasonis和Lactobacillus spp.的减少。代谢组学分析显示，暴露于烟雾的小鼠结肠中胆汁酸代谢物增加，尤其是牛磺脱氧胆酸(TDCA)。暴露于烟雾的小鼠中E. lenta与TDCA的相关性最强。此外，暴露于烟雾的小鼠表现出致癌MAPK/ERK(丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶1/2)信号传导增强(TDCA的下游靶标)和肠道屏障功能受损。此外，移植了烟雾暴露小鼠粪便的无菌小鼠(GF-AOMS)结肠细胞增殖增加。同样，GF-AOMS显示肠道E. lenta和TDCA的丰度增加，MAPK/ERK通路激活，结肠上皮的肠道屏障受损。综上所述，香烟烟雾引起的肠道菌群失调在CRC中起着促肿瘤作用。烟雾引起的肠道菌群失调改变了肠道代谢物并损害肠道屏障功能，这可能会激活结肠上皮中的致癌MAPK/ERK信号传导。

论文ID

原名：Cigarette smoke promotes colorectal cancer through modulation of gut microbiota and related metabolites

译名：香烟烟雾通过调节肠道菌群和相关代谢物促进结直肠癌

期刊：Gut

IF：31.793

发表时间：2022.4

通讯作者：于君

通讯作者单位：香港中文大学

DOI号：10.1136/gutjnl-2021-325021

实验设计

结果

1 香烟烟雾促进小鼠结直肠肿瘤发生    

为了研究吸烟对结直肠肿瘤发生的影响，我们将经AOM处理的C57BL/6小鼠暴露于清洁空气或香烟烟雾中(图1A)。香烟烟雾暴露小鼠的结直肠肿瘤数量和肿瘤大小均显著大于无烟对照小鼠(p<0.01；图1B)。病理学家通过显微镜组织学检查证实了结肠腺瘤和腺癌的存在(图1C)。暴露于香烟烟雾显著增加了结肠肿瘤的发病率(p<0.05)(图1D)。我们观察到与无烟对照小鼠相比，香烟烟雾暴露小鼠结肠上皮细胞增殖增加，表现为Ki-67阳性细胞数量显著增加(图1E)和细胞增殖蛋白标志物增殖细胞核抗原(PCNA)的表达水平增加(图1F)。

图1. 吸烟会增加小鼠的结直肠肿瘤发生率。

(A)为香烟烟雾暴露而设计的吸烟或清洁室和AOM诱发癌症模型的示意图。混合的新鲜空气和烟雾吸入吸烟室，新鲜空气吸入洁净室。每天2小时将小鼠放入室中，持续28周。从第0天起连续6周每周一次腹腔注射AOM(10 mg/kg)。在第28周结束时处死小鼠(AOM组，n=15；AOM+吸烟组，n=15)。(B)处死时结肠的代表性图像。AOM和AOM+吸烟组小鼠的肿瘤数量和肿瘤大小。(C)AOM组腺瘤和AOM+吸烟组腺癌H&E染色的代表性图像。(D) AOM处理小鼠结肠腺瘤和腺癌的发病率。统计显著性由Fisher精确检验确定。(E) Ki67阳性细胞免疫组化染色的代表性图像和结肠中Ki67阳性细胞的比例。(F)通过蛋白质印迹法检测AOM处理小鼠结肠中PCNA的蛋白质表达。数据表示为平均值±SD。AOM，偶氮甲烷；PCNA，增殖细胞核抗原。    

2 香烟烟雾改变小鼠肠道菌群组成和微生物相互作用    

由于小鼠长期生活在一起，我们首先使用16S测序方法评估了微生物群落是否存在笼效应，我们发现笼效应对不同时间点的微生物群落没有影响(p>0.05，PERMANOVA)。然而，吸烟对微生物群落的显著影响发生在实验结束时(结束时间点)(在线补充图1)，表明长期吸烟是影响微生物群的主要因素。然后，对粪便样本进行鸟枪法宏基因组测序分析，以确定香烟烟雾暴露引起的肠道微生物群的潜在改变。在基线时(初始时间点)，在α和β多样性方面，暴露于烟雾和无烟对照小鼠之间的微生物组没有显著差异(在线补充图2A、B)。28周后，我们观察到与无烟对照小鼠相比，暴露于香烟烟雾的小鼠的α多样性显著降低(图2A和在线补充图2C)。PCoA分析(β多样性)显示，与无烟对照小鼠相比，吸烟小鼠的肠道微生物群的聚类有显著差异(p<0.01，PERMANOVA；图2B)。20种细菌(p<0.05，FC>1.5)在暴露于香烟烟雾的小鼠中发生了显著变化(图2C)。其中，E. lenta和Staphylococcus capitis在暴露于香烟烟雾的小鼠中富集，而包括罗伊氏乳杆菌、Parabacteroides distasonis和Bacteroides dorei在内的肠道有益细菌因暴露于香烟烟雾而减少。通过定量PCR证实暴露于香烟烟雾的小鼠中E. lenta丰度更高(p<0.01；图2D)。我们使用我们发表的数据集进一步评估了E. lenta与人类CRC的关联。与正常受试者(n=204)相比，CRC患者(n=185)中E. lenta明显更丰富。在这些CRC患者中，吸烟者(n=30)与不吸烟者(n=87)相比具有更高的E. lenta丰度(p<0.05)(在线补充图3A，B)。    

微生物之间的相互作用可能有助于疾病进展。我们调查了暴露于烟雾的小鼠和无烟对照小鼠之间差异丰度细菌之间相互作用的生态网络(图2E)。我们观察到，在暴露于烟雾的小鼠和无烟对照小鼠之间，细菌之间的共发生和共排除相互作用存在显著差异。在E. lenta和两种益生菌(Lactobacillus jensenii和Lactobacillus crispatus)之间观察到了共同的相关性(图2D)，表明在香烟烟雾暴露的小鼠中富集的E. lenta与减少的保护性细菌之间存在拮抗关系。

图2. 香烟烟雾调节小鼠的肠道微生物群。

(A) AOM+吸烟和AOM组的Fisher统计(α多样性)和(B) PCoA分析(β多样性)。分别通过双尾Mann-Whitney U检验和PERMANOVA获得α和β多样性的显著性。(C) AOM+吸烟组和AOM组之间的细菌差异。使用多元统计模型检测丰度差异(p<0.05(FDR校正)，FC>1.5，MaAsLin2)。(D) AOM+吸烟组和AOM组之间的Eggerthella lenta物种丰度通过定量PCR验证。(E) AOM+吸烟组和AOM组差异细菌的生态网络。通过SparCC方法测定相关性。选择AOM+吸烟组和AOM组之间相关性强度差异>0.6的相关性进行可视化。AOM，偶氮甲烷；FC，倍数变化。    

3 香烟烟雾会改变粪便中肠道微生物相关代谢物    

通过液相色谱-质谱(MS)/MS分析小鼠粪便确定了暴露于烟雾后粪便代谢物的变化。正交偏最小二乘判别分析表明，暴露于烟雾的小鼠的粪便代谢谱与无烟小鼠有显著差异(图3A)。与无烟对照小鼠相比，香烟烟雾暴露小鼠粪便中的41种代谢物(校正后p<0.05)发生了改变(图3B)。改变的代谢物在不同的代谢组学信号通路中富集或减少(图3C)。与无烟小鼠相比，胆汁酸生物合成是香烟烟雾暴露小鼠中最丰富的途径。在肠道中，细菌将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸，后者部分被回肠末端和结肠吸收。在这些次级胆汁酸中，已知TDCA具有致癌性。暴露于烟雾的小鼠中TDCA的丰度显著增加(图3B)。靶向MS进一步证实了香烟烟雾暴露小鼠的粪便TDCA升高(p=0.0094)(图3D)。    

为了确定微生物群与代谢物的潜在关联，我们通过partial Spearman相关性进行了细菌和代谢物之间的相关性分析。我们观察到E. lenta与TDCA的正相关性最强，而两种益生菌(L. jensenii和L. crispatus)在香烟烟雾暴露小鼠中减少，与TDCA呈负相关(图3E)。E. lenta具有解偶联初级胆汁酸的能力并表达胆汁酸差向异构酶3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSDH)；因此，它参与次级胆汁酸的合成，并影响粪便中TDCA的水平。因此，我们测量了编码3β-HSDH酶的基因丰度，并观察到与无烟小鼠相比，吸烟小鼠的基因丰度明显更高(在线补充图3C)。与此一致，我们进一步证实了E. lenta的丰度与粪便中TDCA的浓度呈正相关(图3F)。因此，肠道微生物失调和代谢物改变可能共同促进结肠肿瘤的发生。

图3. 香烟烟雾会改变粪便中与肠道微生物群相关的代谢物。

(A)通过OPLS-DA方法，AOM+吸烟组和AOM组的粪便代谢谱显著不同，OPLS-DA方法是一种监督多元回归分析，用于识别不同组间的可识别模式。x轴捕捉组之间的变化，而y轴捕捉组内的变化。(B) AOM+吸烟组和AOM组之间的差异代谢物，p<0.05，双尾Mann-Whitney U检验。(C) AOM+吸烟组和AOM组差异代谢物的富集分析。(D)通过靶向质谱法测定AOM+吸烟组和AOM组粪便中TDCA的浓度，p<0.05，双尾Student’s t检验。(E)通过partial Spearman相关分析细菌与差异代谢物的关联。(F) TDCA和Eggerthella lenta之间的线性关联，通过线性模型进行校正(暴露烟雾/无烟雾)。AOM，偶氮甲烷；OPLS-DA，正交偏最小二乘判别分析；TDCA，牛磺脱氧胆酸。    

4 香烟烟雾损害肠道屏障功能    

为了研究吸烟对肠道屏障功能的影响，我们分析了结肠紧密连接蛋白、claudin-3和Zonula occludens-1(ZO-1)的表达水平，以及血清脂多糖(LPS)的水平。通过蛋白质印迹(图4A)和免疫荧光染色(图4B)显示，香烟烟雾显著降低了Claudin-3和ZO-1的水平。在电子显微镜(EM)检查下进一步证实了受损的紧密连接(图4C)。同时，我们发现与无烟对照小鼠相比，烟雾暴露小鼠的血清LPS水平显著升高(图4D)。这些结果共同表明，香烟烟雾会导致肠道屏障功能受损。    

图4. 香烟烟雾会损害肠道屏障功能。

(A)通过蛋白质印迹法检测AOM处理小鼠结肠中claudin-3和ZO-1蛋白表达。(B)免疫荧光染色检测AOM处理模型结肠中Claudin-3和ZO-1蛋白表达情况。(C) AOM处理小鼠结直肠肠道屏障结构的代表性图像。箭头指向电子显微镜下的细胞-细胞连接。(a)紧密连接；(b)粘附连接；(c)桥粒；(d)间隙连接。星号表示被破坏的细胞连接。(D) AOM和AOM+吸烟组小鼠血清中LPS浓度。数据表示为平均值±SD。统计显著性由未配对Student’s t检验确定。AOM，偶氮甲烷；DAPI，4',6-二脒基-2-苯基吲哚；LPS，脂多糖。    

5 香烟烟雾增强结肠上皮中的致癌MAPK/ERK信号传导    

为了从分子角度了解吸烟的促肿瘤作用，我们使用Mouse Cancer Pathway Finder PCR Array分析了结肠上皮中癌症相关基因的表达。与无烟对照小鼠相比，我们在暴露于烟雾的小鼠中观察到19个上调基因和7个下调基因(图5A，在线补充表2)。富集分析表明丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路是香烟烟雾激活的最多通路(图5B)。先前的研究报道称，TDCA可以激活MAPK通路的ERK亚家族，因此，我们评估了暴露于香烟烟雾的小鼠结肠上皮中MAPK/ERK的激活，并与对照小鼠进行比较。MAPK/ERK通路中的关键介质蛋白phospho-ERK1/2水平升高证实了吸烟对MAPK/ERK信号传导的激活(图5C)。此外，我们观察到ERK磷酸化水平与TDCA水平呈正相关(在线补充图4A)。这些结果表明，香烟烟雾诱导ERK1/2磷酸化，激活MAPK/ERK信号通路，促进结肠肿瘤的发生。        

图5. 香烟烟雾增强了结肠上皮中致癌MAPK/ERK通路和促炎通路的表达。

(A) Mouse Cancer Pathway Finder PCR Array分析AOM+吸烟组与AOM组结肠上皮差异表达基因(FC=AOM+吸烟/AOM，正log2(FC)=AOM+吸烟组高表达和负log2(FC)=AOM组高表达)。(B)通过富集分析，与AOM组相比，AOM+吸烟组的癌症信号通路改变。箭头表示富集方向，通过比较通路中上调和下调的基因来计算。MAPK信号通路中差异表达的基因在网络中显示。(C)通过蛋白质印迹检测AOM处理小鼠结肠中ρ-ERK1/2蛋白表达。(D)通过小鼠炎症反应和自身免疫阵列分析，与AOM小鼠相比，AOM+吸烟小鼠结肠上皮的差异表达基因。(E)通过富集分析，与AOM组相比，AOM+吸烟组炎症信号通路的改变。TNF和IL-17信号通路中的差异表达基因在网络中显示。(F)定量RT-PCR检测Cxcl2、Il-17a和Il-10的基因表达。数据表示为平均值±SD。**p<0.01，*p<0.05；统计显著性由双侧未配对Student’s t检验确定。AOM，偶氮甲烷；ERK，细胞外信号调节激酶；FC，倍数变化；Il，白细胞介素；MAPK，丝裂原活化蛋白激酶；TNF，肿瘤坏死因子。    

6 香烟烟雾增强促炎信号基因的表达    

肠道细菌失调与炎症密切相关，炎症与致癌因素和肿瘤发生有关。因此，我们使用小鼠炎症反应和自身免疫PCR阵列分析了促炎基因的表达。与无烟对照小鼠相比，我们在香烟烟雾暴露小鼠中观察到27个上调基因和5个下调基因(图5D，在线补充表3)。香烟烟雾诱导包括促炎白细胞介素17(IL-17)信号通路和肿瘤坏死因子(TNF)信号通路的改变(图5E)。定量逆转录PCR(RT-PCR)证实，与无烟对照小鼠相比，香烟烟雾暴露小鼠体内促炎因子Il-17a、Cxcl2的表达增加，抗炎因子Il-10的表达降低(图5F)。此外，Il-17a的相对mRNA表达与结肠中E. lenta的丰度呈正相关(在线补充图5)。这些结果表明，香烟烟雾促进结肠肿瘤发生中的炎症。    

7 无菌小鼠粪便菌群移植概括了暴露于烟雾的常规小鼠肠道菌群的变化    

为了证实香烟烟雾改变的肠道微生物群对结直肠肿瘤发生的直接作用，我们在无菌小鼠中进行了粪便微生物群移植。用暴露于香烟烟雾或无烟常规小鼠的粪便对无菌小鼠进行灌胃。20周后收获并检查小鼠(图6A)。我们进行了鸟枪法宏基因组测序分析，以探索香烟烟雾改变的微生物群的定殖。与常规AOM小鼠模型相似，与用无烟小鼠粪便灌胃的无菌小鼠(GF-AOMS)相比，用香烟烟雾暴露小鼠粪便灌胃的无菌小鼠(GF-AOM)的α多样性显著降低(图6B和在线补充图2C)。β多样性分析再次显示这两组无菌小鼠(GF-AOMS与GF-AOM，p<0.01，PERMANOVA)的肠道微生物群存在显著分离(图6C)。进一步分析揭示了34种差异丰富的细菌(图6D)。在GF-AOMS小鼠中，E. lenta的丰度显著增加，而P. distasonis的丰度显著降低(p<0.05，FC>1.5)。通过定量PCR证实GF-AOMS组中E. lenta的丰度显著高于GF-AOM组(p<0.001，图6E)。    

进一步测试了两种小鼠模型(无菌小鼠和常规AOM小鼠)之间微生物群变化的一致性。我们发现，与无烟AOM小鼠相比，暴露于烟雾的AOM小鼠中丰度增加的细菌在GF-AOMS小鼠体内持续增加，而暴露于烟雾的AOM小鼠中丰度降低的细菌在GF-AOMS小鼠中持续减少(图6F)。重要的是，我们观察到暴露于烟雾的AOM小鼠和GF-AOMS小鼠中E. lenta的丰度增加，而益生菌P. distasonis的丰度降低。相关性分析显示，与供体小鼠相比，无菌小鼠粪便移植后生态网络模块得到保存(图6G)。此外，与GF-AOM小鼠相比，GF-AOMS小鼠的粪便TDCA水平也显著升高(图6H)。

图6. 从暴露于烟雾的常规小鼠中移植粪便微生物群改变无菌小鼠的肠道微生物群。

(A)无菌小鼠模型的示意图。无菌小鼠经口灌胃AOM+吸烟组和AOM组(n=8/组)的粪便。在第20周结束时处死小鼠。(B) GF-AOMS和GF-AOM组的Fisher统计(α多样性)和(C)PCoA分析(β多样性)。分别通过双尾Mann-Whitney U检验和PERMANOVA检验获得α和α多样性的显著性。(D) GF-AOMS和GF-AOM组之间的差异细菌。(E)定量PCR验证GF-AOMS和GF-AOM组之间Eggerthella lenta物种丰度。(F)两种小鼠模型(无菌小鼠和AOM小鼠)中细菌丰度的一致变化(p<0.05，暴露于烟雾的小鼠vs无烟小鼠；GF-AOMS小鼠vs GF-AOM小鼠)。计算了吸烟和不吸烟之间的丰度FC。红点代表无菌小鼠模型，黄点代表常规小鼠模型。(G)与供体相比，无菌小鼠灌胃喂养后网络模块保持不变。(H)通过靶向质谱测定法测定GF-AOMS和GF-AOM组之间粪便中TDCA的浓度，p<0.05，双尾Mann-Whitney U检验。    

8 香烟烟雾改变的微生物群增加了无菌小鼠的结肠细胞增殖和肿瘤发生    

与GF-AOM小鼠相比，GF-AOMS小鼠结肠上皮细胞增殖增加，这表现为Ki-67阳性细胞比例较高(图7A)和PCNA表达水平较高(图7B)。此外，我们对无菌小鼠进行了AOM处理，并用暴露于香烟烟雾(GFAOM-AOMS)或无烟小鼠(GFAOM-AOM)的粪便灌胃(在线补充图6A)。与GFAOM-AOM小鼠相比，GFAOM-AOMS小鼠的结肠肿瘤数量(p<0.05)和肿瘤大小(p<0.05)增加(在线补充图6B)。这些在无菌小鼠中的结果与在常规小鼠中的观察结果一致，表明香烟烟雾改变的微生物群和代谢组可以直接促进结肠细胞增殖和肿瘤发生。

图7. 香烟烟雾改变的微生物群会增加结肠细胞增殖，损害肠道屏障功能，并增强无菌小鼠中致癌MAPK/ERK和促炎基因的表达。

(A)无菌小鼠结肠中Ki67阳性细胞的免疫组化染色代表性图像和Ki67阳性细胞比例。(B)通过蛋白质印迹法检测无菌小鼠结肠中PCNA的蛋白表达。(C)通过蛋白质印迹法检测无菌小鼠结肠中claudin-3和ZO-1蛋白表达。(D) GF-AOM组和GF-AOMS组小鼠血清中的LPS浓度。(E)电子显微镜显示无菌小鼠结肠肠道屏障的结构。箭头指向细胞-细胞连接。(F)通过Mouse Cancer Pathway Finder PCR Array分析，与GF-AOM组相比，GF-AOMS组结肠上皮细胞差异表达基因。(G)通过富集分析，与GF-AOM组相比，GF-AOMS组癌症信号通路的改变。箭头表示富集方向，通过比较通路中上调和下调的基因来计算。MAPK信号通路中差异表达基因在网络中显示。(H)通过蛋白质印迹法检测GF-AOM和GF-AOMS组小鼠结肠中ERK1/2蛋白表达。(I)通过小鼠炎症反应和自身免疫阵列分析，与GF-AOM组相比，GF-AOMS组结肠上皮细胞差异表达基因。(J)通过富集分析，与GF-AOM相比，GF-AOMS组炎症信号通路改变。TNF和IL-17信号通路中的差异表达基因在网络中显示。(K)定量RT-PCR检测Il-17a、Cxcl2和Cxcr2基因表达。(a)紧密连接；(b)粘附连接；(c)桥粒；(d)间隙连接。星号表示被破坏的细胞连接。数据表示为平均值±SD。*p<0.05；统计显著性由双尾非配对Student’s t检验确定。    

9 香烟烟雾改变的微生物群会损害无菌小鼠的肠道屏障功能    

接下来，我们研究了香烟烟雾改变的微生物群是否会影响无菌小鼠的肠道屏障功能。我们观察到GF-AOMS小鼠中claudin-3和ZO-1的表达降低，血清LPS水平升高(图7C，D)。EM也证实了GF-AOMS小鼠肠道屏障功能受损，其显示结肠顶端连接复合体的细胞间连接和细胞旁间隙变宽(图7E)。这些无菌小鼠的结果与常规小鼠一致，因此表明香烟烟雾对微生物群和代谢组的改变可能会损害肠道屏障功能，从而进一步促进肿瘤发生。    

10 香烟烟雾改变的微生物群增强了无菌小鼠结肠上皮中的致癌MAPK/ERK通路    

为了确认香烟烟雾改变的微生物群促进结肠细胞增殖的分子机制，我们对灌胃的无菌小鼠的结肠上皮细胞进行了Cancer Pathway Finder Array分析。与GF-AOM小鼠相比，我们在GF-AOMS小鼠中鉴定出9个上调基因和3个下调基因(图7F，在线补充表4)。这些差异表达基因主要富集在MAPK/ERK信号通路中。与GF-AOM小鼠相比，GF-AOMS小鼠中磷酸化ERK1/2蛋白表达升高证实了MAPK/ERK信号传导的激活(图7G和H)。此外，我们观察到ERK磷酸化水平与TDCA水平呈正相关(在线补充图4B)。同样，使用炎症反应和自身免疫PCR阵列，我们发现与GF-AOM小鼠相比，GF-AOMS中有16个促炎基因上调(图7I，在线补充表5)，这些基因也主要富集在TNF和IL-17信号通路中(图7J)。通过定量RT-PCR，与GF-AOM小鼠相比，在GF-AOMS小鼠中TNF和IL-17通路中关键促炎基因上调，包括Il-17a和C-X-C基序趋化因子配体2(Cxcl2)和C-X-C基序趋化因子受体2(Cxcr2)(图7K)。常规和无菌小鼠模型的一致发现表明，香烟烟雾改变的微生物群直接诱导结肠促炎TNF和IL-17信号通路和致癌MAPK/ERK信号通路。因此，改变的肠道微生物群有助于香烟烟雾在结直肠癌发生中的促肿瘤作用。    

讨论

本研究首次建立了一种新的肠道微生物群介导的香烟烟雾诱导结直肠肿瘤发生的机制。吸烟是CRC的风险因素。然而，对吸烟引起的CRC的机制理解是有限的。尽管有几项研究表明肠道微生物群与吸烟之间存在关联，但仍不清楚因吸烟而改变的微生物群是否在CRC的发生和进展中起重要作用。为了填补这一关键空白，我们使用AOM诱导的CRC小鼠模型和移植了香烟烟雾改变的微生物群的无菌小鼠进行了涉及小鼠长期暴露于香烟烟雾的实验。    

本研究证明了吸烟可以通过调节肠道菌群的组成和诱导肠道菌群失调来促进结肠肿瘤的发生。特别是，据报道与CRC相关的E. lenta在暴露于香烟烟雾的小鼠中显著富集。另一方面，已证明在暴露于香烟烟雾的小鼠中减少的P. distasonis会增加结肠紧密连接蛋白的表达并减弱结直肠肿瘤的发生。已知的乳杆菌(L. reuteri、L.jensenii和L. crispatus)由于其抑制病原菌感染或增殖的能力，在暴露于香烟烟雾的小鼠中丰度较低。我们进一步证明了在暴露于香烟烟雾的小鼠中富集的E. lenta和减少的乳杆菌物种之间的拮抗关系。总而言之，致病菌的增加和保护性细菌的减少一起促成了吸烟诱导的CRC肿瘤发生。    

本研究还发现，胆汁酸生物合成途径是烟雾暴露小鼠粪便中最显著富集的代谢途径。初级胆汁酸在肝脏中合成并通过胆管分泌到肠道中。肠道共生菌群将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸，然后大部分被回肠末端和结肠吸收，少数随粪便排出。由于其促进肿瘤的特性，胆汁酸正受到越来越多的关注。在肠道微生物群衍生的次级胆汁酸中，我们证实暴露于烟雾的小鼠粪便中TDCA显著增加。以前的研究表明，TDCA可以促进结直肠和食管腺癌的发生。TDCA灌注到结肠腔增加了N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱导的结直肠肿瘤的发生频率。我们进一步发现，粪便代谢物的变化与肠道微生物丰度的变化显著相关，其中TDCA与E. lenta正相关最为显著。这一结果得到了先前研究的支持，这些研究表明E. lenta具有解偶联初级胆汁酸并表达胆汁酸差向异构酶3β-HSDH的能力。这些特性使其能够参与次级胆汁酸的合成，从而影响粪便中的TDCA浓度。    

进一步评估了小鼠的肠道屏障功能，并确定暴露于香烟烟雾的小鼠肠道屏障功能受损。Claudin-3和ZO-1这两种重要的紧密连接蛋白的表达在暴露于香烟烟雾的小鼠中降低。肠道紧密连接受损可增加结肠通透性，从而使更多肠道有害代谢物(如TDCA)进入结肠上皮细胞的细胞间隙，激活MAPK/ERK信号通路。    

接下来研究了香烟烟雾促进结肠肿瘤发生的分子机制，并揭示了香烟烟雾诱导的MAPK/ERK通路的显著富集和激活。这一结果与TDCA作为配体激活MAPK/ERK通路的功能一致。MAPK/ERK通路的激活对细胞增殖很重要，并被证明参与人类CRC发病机制、进展和肿瘤发生。此外，我们发现香烟烟雾诱导促炎IL-17和TNF通路；IL-17已被证明可促进结肠癌的发展。先前的研究表明E. lenta在IBD患者中富集，它可以通过心苷还原酶2诱导IL-17a，支持我们的结果，即E. lenta可能会激活促炎细胞因子IL-17途径以诱导肿瘤发生。TNF-α通路的激活诱导结肠炎和结直肠癌的发生。这些发现共同表明，由烟雾相关的肠道菌群失调和代谢物改变触发的致癌MAPK信号通路和促炎IL-17和TNF信号通路的激活有助于香烟烟雾相关的结肠肿瘤发生。    

在进行粪便微生物群移植的无菌小鼠中进一步研究了烟雾改变的肠道微生物群在肿瘤发生中的直接作用。仅香烟烟雾改变的肠道微生物群就可以增加无菌小鼠结肠上皮细胞的增殖。受体无菌小鼠的肠道微生物组成与供体暴露于烟雾的常规小鼠的肠道微生物组成相似。特别是，E. lenta在暴露于烟雾的AOM小鼠和GF-AOMS小鼠中均显著富集。香烟烟雾改变的肠道微生物群也增加了粪便TDCA水平，并诱导GF-AOM小鼠结肠上皮细胞中MAPK/ERK、IL-17和TNF信号通路的激活。这些发现共同表明，香烟烟雾改变了肠道微生物群，从而通过增加结肠中的TDCA水平并进一步激活结肠上皮中的致癌MAPK/ERK、IL-17和TNF信号通路来促进结肠肿瘤的发生。此外，香烟烟雾改变的肠道微生物群损害了结肠上皮细胞，这可以通过紧密连接蛋白claudin-3和ZO-1的表达减少来证明。肠道屏障功能受损可能促进致癌的TDCA进入结肠上皮细胞间隙，进一步激活致癌的MAPK/ERK信号通路。    

本研究通过调节肠道微生物群的组成证明了吸烟对CRC的促进作用。与持续吸烟者相比，戒烟与改善CRC特异性生存率相关。因此，戒烟至少是通过重建健康的肠道微生物组来预防CRC的实用方法之一。综上所述，本研究首次证明，香烟烟雾通过诱导肠道菌群失调来促进结肠肿瘤的发生。烟雾引起的肠道菌群失调会增加结肠中TDCA水平，进而激活结肠上皮中的致癌MAPK/ERK、IL-17和TNF信号通路。此外，肠道菌群失调引起的肠道屏障功能受损可能进一步促进TDCA激活MAPK/ERK信号通路。