Nature系列综述：如何巧妙应对CAR-T治疗实体瘤的脱靶毒性？

靶向CD19或B细胞成熟抗原的嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法已被批准用于治疗某些B细胞恶性肿瘤。然而，在实体瘤中CAR-T细胞对表达靶抗原的非肿瘤组织的识别，往往导致临床严重的非肿瘤靶向毒性，简称OTOT（on target，off-tumor toxicity），当前有多种正在开发的用于提高实体肿瘤中CAR - T细胞特异性并减轻临床OTOT风险的巧妙设计，具体请看下文。

CAR-T细胞疗法作为一种有效治疗肿瘤的方法 ，依赖于对病人来源的T细胞进行转基因改造，使其可以表达识别肿瘤表面特异性抗原的CAR元件。CAR元件有多种组分组成。抗体来源的单链可变区（scFv）识别肿瘤表面特异抗原，胞内共刺激分子结构域（如CD28，4-1BB）控制CAR-T细胞增殖、分化和生存，CD3ζ对于CAR-T细胞激活是必需的（见下图）。

图1：CAR构造

B细胞瘤表达丰富的肿瘤抗原CD9和BCMA，因此对于CAR-T疗法效果较好。但是在实体瘤的应用中，由于大部分肿瘤抗原广泛的表达在正常组织中，因此容易误伤正常组织而带来并发疾病。本文讲述CAR-T细胞疗法在临床应用中的OTOT现象以及对应的CAR-T细胞工程化的改造。 非肿瘤靶向毒性的风险和机制 非肿瘤靶向毒性来自于CAR-T细胞介导的对表达靶向抗原的正常组织的识别和裂解。 其主要机制是CAR-T细胞释放的穿孔素和颗粒酶介导的细胞毒性。同时也包括CAR-T细胞上调诱导靶细胞凋亡的膜分子 （如FAS ligand） 、分泌细胞因子 （IFNγ，TNF） 导致的组织破坏。

图2：CAR-T细胞的毒性机制和旁分泌效应

为了获得有效且安全的靶向实体瘤的CAR-T细胞，肿瘤抗相关原的选择至关重要 。此类抗原可能来自肿瘤特异性非同义突变、细胞表面蛋白氨基酸序列的插入或缺失、癌胎抗原的异常表达或肿瘤特异性翻译后修饰。然而这些肿瘤突变的抗原往往在非肿瘤组织中也广泛表达。下图为一些在非肿瘤中表达的肿瘤相关抗原丰度。

图3：目前可用的肿瘤相关抗原在非肿瘤组织中的表达丰度

CAR-T相关的肿瘤外毒性的证据 1. 临床表现 晚期CEACAM5阳性实体瘤患者发现严重不良事件 （呼吸急促，肺部浸润或呼吸窘迫） 。研究人员在八名患者中的五名 （63%） 的非恶性肺切除样本中发现了中到强的CEACAM5表达。晚期实体瘤患者中靶向HER2的CAR-T细胞测试中，单次输注高剂量 （10 10 ） 抗HER2 CAR T细胞导致一名39岁的转移性结肠癌患者急性呼吸窘迫，输注后5天死亡。尽管EGFR在组织中广泛表达，但是抗EGFR的CAR-T细胞副作用是可控的。

总的来说，这些1期临床数据表明，接受CAR-T细胞的实体瘤患者存在发生严重非肿瘤毒性的可能性 。这强调了解肿瘤相关抗原在非恶性组织上表达的重要性，以便准确地找到CAR- T细胞相关的不良反应的原因。这些数据表明，非肿瘤毒性可能受到多种因素的影响，包括输入细胞的数量、肿瘤和非恶性组织的抗原表达丰度、CAR设计和给药方式。 2. 非肿瘤靶向毒性的临床前可预测性 CAR-T细胞的非肿瘤毒性风险已在临床前模型中进行了研究 。可以对小鼠器官进行组织学分析，以检查CAR-T细胞的浸润、肿瘤和正常组织坏死的程度以及肿瘤周围和远端炎症部位的肿瘤相关抗原的表达水平，从而提供非肿瘤毒性的明确证据。由于人和小鼠抗原结构、靶抗原表达模式、不同的组织微环境和解剖学生态位的差异，因此利用小鼠预测临床非肿瘤毒性还需谨慎。 缓解非肿瘤靶向毒性的策略 接下来介绍几种已有的更好地限制CA1R-T细胞非肿瘤细胞毒性的策略。 1.CAR 元件的改造 修改CAR的scFv的亲和力使其可以拥有足够的识别肿瘤细胞的亲和力 ，同时减少对TAA表达有限的非恶性细胞的杀伤力。高亲和力的CAR-T细胞虽然对低表达TAAs的肿瘤细胞较好的反应，但也会造成非肿瘤细胞的“误伤”。同样的低亲和力的CAR-T细胞抗肿瘤活性比较低。除了scFv的亲和力调节外，对Hinge结构和跨膜结构域 （H / T） 进行修改或者改变免疫受体酪氨酸激活基序 （ITAM） 的数量，可以改变CAR元件识别肿瘤抗原丰度的阈值，从而减少非肿瘤细胞毒性。 2. 逻辑门控 CAR-T 细胞 我们说的逻辑门控开关，指的是数学运算符“IF/THEN”，“AND”，“OR”和“NOT” 。这些逻辑开关被很巧妙地用于控制CAR-T细胞的激活。其中一些方法可用于提高细胞杀伤的特异性并降低非肿瘤细胞毒性的概率 （图4) 。

图4：控制非肿瘤毒性的逻辑门控原理

1) “ AND ”逻辑开关解除 CAR-T 信号激活 CAR-T细胞活化的共刺激分子信号和ITAM信号分别融合在两个TAA识别CAR元件上 （图4a） 。只有当肿瘤细胞上的两个抗原同时被CAR-T细胞识别之后才能激活细胞杀伤功能，而仅连接一个受体会导致信号传导减弱，这样就降低了对非肿瘤细胞的识别几率，从而减少了非肿瘤组织的毒副作用。除了在第二个CAR元件上靶向识别TAA，也可以靶向肿瘤的其他特征。例如在胰腺癌肿瘤微环境特异性出现的肿瘤抗原PSCA和抑制炎性细胞因子TGFβ和IL-4。以上这些策略虽然增加了肿瘤靶向特异性并降低非肿瘤毒性，但其中一个包含CD3ζ的CAR元件仍存在脱靶风险。

2) IF/THEN  逻辑门控在肿瘤微环境中的应用

IF/THEN是基于肿瘤微环境的逻辑门控， CAR-T细胞只有在某些肿瘤微环境的特异性特征时才能被激活 （图4b） 。 a. 利用肿瘤内微环境为酸性这一特征，设计在低pH环境下识别TAA的CAR元件就是一个例子。具有pH限制结合结构域的靶向HER2的 CAR元件优先在酸性TME中结合HER2，这使得CAR-T细胞得以快速扩增并消灭肿瘤细胞。 b. TME的缺氧环境也可以被应用于这一策略中。在抗CD-19的CAR元件C段融合缺氧感受器HIF-1α亚基。利用常氧环境下HIF1α片段被泛素化降解这一特点，这种设计使得CAR元件只有在缺氧环境下的稳定表达，从而降低系统性非靶向肿瘤的毒副作用。 c. 另一个方法是将可被蛋白酶特异性识别并切割的肽段附着到抗EGFR CAR的抗原结合位点。CAR的抗原结合位点仅通过蛋白酶对这一肽段特异性切割所释放。由于TME具有高局部浓度的蛋白酶，该策略将CAR功能限制在TME中，因此更具选择性。 值得注意的是，某些非肿瘤组织可能也具有TME的特征，导致依赖TME的CAR-T细胞在远离肿瘤的其他组织位置被激活。这就要求CAR-T细胞识别的TAA避免在这些有类似肿瘤微环境的组织细胞中出现。

图5：逻辑门控在CAR-T中的精妙设计

3) SynNotch 电路使用 IF/THEN 逻辑门控促进多抗原检测

将合成的Notch （synNotch） 应用于IF/THEN逻辑门控可以兼顾亲和力和特异性，从而减少非肿瘤细胞毒性 （图4d） 。合成Notch （SynNotch） CAR-T细胞由起始和应答CAR元件组成。起始CAR元件的受体识别结合肿瘤抗原后导致Notch片段被切割进入细胞核促进另一个应答CAR元件的转录表达。该CAR可以识别另一个抗原并触发细胞毒性反应 （图5c） 。

4) 外源性开关控制 AND 逻辑门控 CAR-T 细胞

在CAR-T细胞上表达一段亮氨酸拉链作为细胞外结合结构域。这个亮氨酸拉链可以和一个融合了识别肿瘤抗原的scFV片段的亮氨酸拉链adaptor结合，因此赋予了CAR-T细胞针对特定靶标的抗原识别能力。由于adaptor-scFv独立地作用于CAR-T细胞，因此输注识别不同TAA的scFv可以 在体内更换CAR的靶标。也可输入竞争性结合适配器–scFv以阻断CAR-T细胞信号传导 （图5d） 。 在依赖于多种低亲和力CAR-抗原相互作的免疫应答中，设计一种亲和力控制CAR （AvidCAR） 系统，只有当两个低亲和力CAR独立识别靶抗原并在特定的小分子二聚体存在下变得二聚时，才能实现活化。这样也可以实现小分子化合物对CAR-T细胞活化的控制 （图5e） 。

以上两种CAR设计提供了一种降低非肿瘤毒性风险的方法。同时还提供了外源性控制元素，这样可以在出现任何毒性时做出反应。

5) NOT 逻辑门控阻断 CAR-T 细胞激活

NOT逻辑门控包含诱导细胞毒性反应的激活性CAR和触发有效抑制信号的抑制性CAR （iCAR） ，该抑制性信号受非肿瘤细胞抗原控制 （图 4c） 。当抑制性CAR识别正常组织抗原CAR-T细胞活性便被抑制。 另外研究人员还开发了一种称为Co-LOCKR的方法 （图5f） 。CAR-T细胞与中间蛋白 （称为“笼子”和“钥匙”） 结合。只有两个中间蛋白共同识别TAA后，“笼子”的Bim结构域才会暴露，被CAR识别并触发CAR-T细胞毒性。此外，可以用非恶性组织上表达的特定抗原block CAR-T细胞对Bim结构域的结合，就可以避免CAR-T细胞活化对非肿瘤细胞的杀伤。 限制肿瘤脱靶毒性的其他策略 当前还有其他的CAR-T修饰策略，以 避免或降低输注后 肿瘤脱靶毒性的严重程度。尽管大多数仅限于临床前模型，但一些策略已经在临床上进行了测试。

1. 使用临床批准的药物进行控制 在出现急性CAR-T副作用，尤其是神经毒性时，可以使用酪氨酸激酶抑制剂dasatinib抑制 CAR-T细胞下游CD3ζ信号。该抑制剂可作为CAR-T细胞信号传导的即时关闭开关，而不影响细胞活力 （图6a） 。 但停药后，CAR-T细胞活性仍然存在，因此该方式不是一个长期消除OTOT的理想策略。

2. 自杀开关 在CAR-T细胞中表达一段可诱导的caspase9自杀元件 （icaspase9） ，该元件可以被小分子药物AP1903激活并诱导CAR-T细胞凋亡 （图6b） 。也可以在CAR-T细胞表面表达额外可以被抗体识别的细胞表面分子，这样可以使用单克隆抗体靶向该分子清除CAR-T细胞 （图6c） 。

3. 控制 CAR 表达和毒性 在完全根除肿瘤之前使用自杀开关不可逆地消除CAR-T细胞可能会限制临床疗效。另一种选择是设计可逆的关/开开关，允许对CAR-T细胞活化进行时间控制并保持抗肿瘤功能。在CAR元件C段融合一个蛋白酶靶位点、蛋白酶和降解因子，在缺乏蛋白酶抑制剂阿舒那匹韦Asunaprevir时，蛋白酶可以将自身和降解因子从CAR中切割出来，防止CAR降解并保持其在细胞表面的表达 （图6d） 。而Asunaprevir的存在可以抑制蛋白酶的切割，从而 导致CAR功能的关闭 。也可以将膜结合的NS3蛋白酶整合到CAR中。注射蛋白酶抑制剂格拉唑匹韦grazoprevir抑制了CAR信号结构域的组成型降解，从而控制了CAR功能的开启。也可以利用药物控制CAR的可变剪切来调控CAR的表达水平达到减少OTOT风险 （图6e） 。

图6：CAR中的开关控制

4.声/光控开关

将CAR的转录表达置于热休克蛋白 （HSP） 的调节控制之下，利用超声产生局部的，瞬时的温度升高，从而激活了HSP上调CAR转录和表达 （图7b） 。在CAR-T细胞中表达一段感光元件，该元件经蓝光照射可以暴露出核定位并入核触发CAR的表达 （图7b） 。

使用声控或光控开关实现了对CAR空间和时间上的诱导表达，可能会阻止全身性CAR-T细胞活化，从而降低OTOT的可能性。

5.局部注射CAR-T细胞

传统上，CAR-T细胞是全身给药的，这给充分地将CAR-T细胞运输到肿瘤部位和尽量少的向非恶性组织运输带来了挑战。在可能的情况下，局部递送CAR-T细胞可以帮助克服这些挑战。例如，靶向中枢神经肿瘤的CAR-T细胞的脑室内和鞘内给药已取得较好的临床前和早期临床结果 （图7c） 。

图7：CAR - T细胞活性的区域限制

总结

在实体瘤CAR-T细胞的开发应用中，非肿瘤的靶向毒性再所难免。通过各种策略在增加CAR-T细胞效用的同时要限制其副作用。大量的研究集中在开发更具体的CAR系统，包括各种逻辑门控开关、允许外源性控制T细胞功能或存活的系统、调整scFvs的亲和力并改变CAR架构和局部递送CAR-T细胞等策略，这些策略都可以潜在地降低OTOT的风险。但是实体瘤中CAR-T细胞疗法的应用中仍存在许多副作用。