2bRAD-M揭示单侧肾结石患者肾盂泌尿系生物群落

Hong SY, Yang YY, Xu JZ, Xia QD, Wang SG, Xun Y. The renal pelvis urobiome in the unilateral kidney stone patients revealed by 2bRAD-M. J Transl Med. 2022 Sep 24;20(1):431. doi: 10.1186/s12967-022-03639-6. PMID: 36153619; PMCID: PMC9509602.

肾结石病 (KSD) 的发病机制尚不完全清楚，潜在的促成因素仍有待探索。几项研究表明，使用 16S rRNA 基因测序，结石形成者的尿液微生物组（urobiome）不同于健康个体的尿液微生物组，其中大多数仅提供属水平的微生物鉴定。微生物组 2bRAD 测序 (2bRAD-M) 是一种新型测序技术，能够以物种分辨率准确表征低生物量微生物组。我们的目的是应用 2bRAD-M 来分析单侧肾结石患者的肾盂尿路生物组，并比较有结石和无结石的尿路生物组。

方法： 共纳入30例单侧肾结石患者，采集其双侧肾盂尿液。将输尿管镜插入装有结石的肾盂，将输尿管导管置入输尿管镜，收集肾盂尿液。使用新设备再次重复此过程以收集另一侧的尿液。进行2bRAD-M表征单侧结石形成者的肾盂尿路生物组，以探讨结石侧和非结石侧之间是否存在微生物差异。

结果： 结石侧微生物群落组成与非结石侧相似。配对比较显示结石侧棒状杆菌增多，普氏菌和乳酸杆菌减少。四种物种（Prevotella bivia、Lactobacillus iners、Corynebacterium aurimucosum 和 Pseudomonas sp_286）在非结石侧的数量过多。通过线性判别分析效应大小 (LEfSe)，还确定了两组之间的 24 个差异类群。在相关分析中观察到属和种之间广泛而密切的联系。此外，利用特定的富集物种构建了一个随机森林分类器，可以以 71.2% 的准确率区分石方和非石方。

结论： 这项首次 2bRAD-M 微生物组调查为尿液生态失调在 KSD 中的潜在作用提供了重要提示，并提供了对结石形成机制的更好理解。

肾结石病（KSD）是一种常见的泌尿系统疾病，患病率越来越高，复发风险也很高，给患者带来了巨大的医疗负担。尽管在结石切除手术技术方面取得了巨大进展，但由于结石形成的详细机制尚不清楚，用于治疗和预防KSD的有效医疗药物的开发仍然停滞不前。草酸钙（CaOx）是最主要的结石类型，其次是磷酸钙（CaP）、鸟粪石、尿酸和胱氨酸[3]。高钙尿和高草酸尿是结石形成的主要危险因素，尿液的过饱和是结晶的驱动力[4]。然而，特发性CaOx结石形成者在尿液化学成分上与健康个体相似[5]。此外，大多数患者患有单侧结石病，这表明单过饱和不一定会引发结石形成。因此，必须有其他因素促成KSD。

随着测序和培养组学方面的先进技术，人们发现尿路含有大量多样的微生物[6-8]。尿微生物组（尿生物组）被证明与几种泌尿系统疾病有关，如尿失禁、膀胱过度活动和泌尿系统肿瘤[9，10]。因此，尿生物群落在KSD中的作用吸引了越来越多的研究兴趣。一些研究人员通过16S rRNA基因测序分析了结石形成者的尿液生物群落，并观察到结石形成者和健康个体之间的明显微生物差异[11-14]。此外，Dornbier等人使用16S rRNA基因测序和增强定量尿液培养（EQUC）发现，同一患者的成对膀胱尿液和结石匀浆中有几种细菌占优势[15]。这些研究表明，尿生物群落可能与结石形成有关。

KSD中所有当前的尿生物学相关研究都进行了16S rRNA基因测序，以研究尿液中的微生物群落组成。由于这种测序技术仅对细菌的16S rRNA基因进行测序，因此它通常提供高达属级的分类分类，这很难在物种级实现精确可靠的微生物鉴定。尽管全元基因组鸟枪测序允许从样本中对整个基因组进行测序，以解决物种级别的分类问题，但其成本要高得多，通常需要大量的DNA作为起始材料。然而，与肠道微生物组相比，尿生物组的生物量相对较低。因此，我们试图应用一种能够产生准确和物种分辨率分类剖面的方法来表征KSD中的低生物量尿生物群落。微生物组的2bRAD测序（2bRAD-M）是研究微生物组的一种新的测序方法[16]。该方法使用IIB型限制性酶消化样品的基因组DNA，以产生等长度DNA片段[17，18]。扩增片段进行测序，并将其映射到物种特异性2bRAD标记物中，用于微生物鉴定和定量。2bRAD-M已证明其在物种水平上以高保真度和低成本描绘低生物量微生物组的能力[16]。本研究招募了单侧结石患者，并从两侧收集肾盂尿液。我们进行了2bRAD-M来描绘肾盂尿生物群落，并旨在确定肾盂内的尿生物群落在有结石和无结石的肾脏之间是否不同。据我们所知，这是首次尝试使用2bRAD-M在物种分辨率下探索单侧成石动物的骨盆尿生物群落。

图。1

肾盂尿液收集的图形表示。

将输尿管镜轻轻插入结石侧肾盂，输尿管镜置入输尿管导管收集肾盂尿液。然后，使用新的输尿管镜和新的输尿管导管重复此过程以收集同一患者非结石侧的肾盂尿液

KSD 是一种复杂的疾病，具有涉及环境和遗传因素的多因素病因。16S rRNA 基因测序和EQUC的应用表明，健康个体的泌尿道中栖息着复杂多样的微生物群落 [ 6-8 ]。从那以后，尿路生物组被证实与一些泌尿系统疾病有关 [ 9 , 10 ]。越来越多的注意力集中在 KSD 中的 urobiome 的作用上。众所周知，鸟粪石结石，即感染性结石，是由产生尿素的细菌引起的，例如奇异变形杆菌[ 25 ]]. 然而，临床研究发现，从所有类型的结石中分离出的细菌大多数是非尿素产生菌，而从患者的尿液和结石样本中分离出的细菌中最常见的是大肠杆菌，这表明代谢性结石（CaOx、CaP、尿酸等）也与尿液细菌有关[ 26、27 ]。最近，在结石形成者和健康个体之间观察到微生物群落组成的明显差异，进一步暗示了尿路生物组在结石形成中的潜在重要性 [ 11 – 14]. 但所有这些研究都应用了 16S rRNA 基因测序来分析 urobiome，结果大多没有解决属级以下的分类群。此外，大多数研究对结石形成者和健康对照者的膀胱尿路生物组进行了比较分析。然而，就解剖位置而言，肾盂尿液比膀胱尿液更能反映定植于肾脏的微生物群。一些研究人员收集了结石形成者的肾盂尿液进行测序 [ 11 , 13 , 28]，但目前还没有大样本研究比较单侧结石形成者有无结石的肾盂尿路生物组。在此，我们旨在使用 2bRAD-M（一种可以描绘该物种微生物群落景观的新型测序技术）来表征单侧结石形成者的肾盂尿路生物组，以探索结石侧和非结石侧之间是否存在微生物差异具有高精度和低成本的水平。

α多样性和β多样性均表明，结石肾盂尿液的总体微生物组成与无结石肾盂尿液的微生物组成相似。这些结果可能有多种可能性。首先，尿液收集过程中膀胱的污染可能导致结石侧和非结石侧之间的高度相似性。其次，虽然我们招募了初始结石发作的单侧结石形成者，但我们不能排除患者之前可能有双侧结石形成并且小结石可能从尿液中排出的可能性。由于非石方之前可能会形成结石，因此很容易理解双方具有相似性。第三，13]. 刘等人。采集肾结石患者四种尿液样本，包括膀胱消毒前吸出的膀胱尿、膀胱消毒后新形成的膀胱尿、膀胱消毒后结石侧肾盂尿和膀胱后非结石侧肾盂尿。消毒。他们对膀胱进行了仔细的消毒以防止污染，但他们发现四种类型的尿液样本具有相似的微生物丰富度和多样性。因此，我们假设石方的多样性与自然界中非石方的多样性相似，因为它们都来自同一主题。两组之间可能存在一些差异分类群，但两组的整体微生物群落没有显着差异。虽然杨等人。28 ]。

丰度概况表明，两组之间不同分类水平的优势细菌组成非常相似。一些细菌属，包括不动杆菌属、假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属和葡萄球菌属，之前也被报道为结石形成者肾盂尿液中的优势属[ 13、28 ]。值得注意的是，不动杆菌属、假单胞菌属和葡萄球菌属是可引起 UTI 的重要机会致病菌。一些研究表明，与对照组相比，不动杆菌在结石形成者的膀胱尿路生物组中的比例过高 [ 11 ], 12 ]。发现石匀浆中以假单胞菌和葡萄球菌铜绿假单胞菌和表皮葡萄球菌 ]。尽管在之前关于 KSD 尿路生物组的任何研究中都没有报道主要的Cupriavidus属，但它与其他泌尿系统疾病有关。例如，Cupriavidus在膀胱癌组织中比在癌旁组织中更丰富 [ 30 ]。本研究鉴定出 451 种细菌，数量最多的前 5 种是C. pauculus通过 EQUC [ 15 , 29、A. junii、A. sp_CIP_110321、S . paucimobilis和A. ursingii。这些物种主要存在于自然环境中，在人类感染中很少见报道。

通过配对比较和LEfSe，我们发现Corynebacterium属和P. disiens种增加，Prevotella属和Lactobacillus和P. bivia，P. timonensis，L. iners，C. aurimucosum，F. magna，P . . 结石侧与非结石侧相比，sp_286和P. sp_S150在肾盂尿生物组中减少。先前也曾观察到伴有结石的肾盂尿液中棒状杆菌水平升高[ 13 ]。此外，棒状杆菌 spp. 培养并从石匀浆中分离出来 [ 15 , 31 ]。Corynebacterium urealyticum以其分解尿素的强大能力而得名，已被证实与尿路结石有关 [ 32，[。Corynebacterium matruchotii是口腔中的居民，与牙结石形成有关，并在体外诱导钙沉淀和磷灰石沉积 [ 34 ]。人们普遍认为，大多数 CaOx 结石形成于称为 Randall 斑块的间质磷灰石沉积物底部 [ 35 ]。这些线索指出了棒状杆菌在 KSD 中的潜在致病作用。不过值得注意的是，C. aurimucosum富集在非石侧。

之前曾有报道称，乳酸杆菌和普雷沃氏菌在结石形成者的膀胱尿路生物组中的代表性不足[ 11、14 ]。乳酸杆菌是阴道的常见居民，可以提供健康的阴道环境，并通过产生乳酸和抗菌化合物来防止病原体定植 [ 36 ]。乳酸杆菌也是健康膀胱尿路生物组的主要成员，它同样可以抑制尿路病原体的生长 [ 8 , 37 ]。属于乳酸菌的益生菌 spp. 已被用于通过阴道内治疗预防尿路感染，以及乳酸菌在阴道内的稳健定植观察到复发率降低 [ 38 ]。L. iners是一种常见的乳杆菌属。在阴道微生物组和膀胱尿路微生物组中，发现阴道和膀胱之间有 99.99% 的相似性 [ 39 ]。由于其良好的适应性，惰性乳杆菌可以在波动的环境条件下保持相对恒定的丰度，而其他乳杆菌属。可能无法存活 [阻止病原体获得重要的营养物质，并通过激活阴道上皮细胞的先天免疫系统来抑制其生长 [ 42 ]。研究还表明，UTI 风险与L. iners的消耗有关 40 , 41 ]。此外，L. iners[ 43 ]。以上证据表明惰性乳杆菌可能在KSD中发挥保护作用。]. SCFAs 是细菌发酵的主要代谢产物，可维持肠道屏障的完整性并发挥抗炎作用，并可通过肠-肾轴调节氧化应激以预防急性和慢性肾损伤 [ 45 , 46 ]。由于氧化应激与结石形成密切相关，因此结石形成者的肠道微生物组普氏菌水平下降也就不足为奇了[ 47 , 48 ]。P. bivia、P. timonensis和普氏菌广泛存在于不同的身体部位，包括阴道、胃肠道和泌尿道。一些普氏菌属。是短链脂肪酸 (SCFA) 的熟练生产者 [ 44P. disiens是阴道中含量丰富的物种，所有这些都与阴道生态失调有关 [ 49]. 然而，它们在泌尿系统疾病中的作用尚未见报道，需要进一步探索。

相关分析揭示了不同属和种之间广泛而密切的联系。正相关表明一些细菌可能支持彼此的生长和定植，而负相关表明一些细菌可能与同一生态位中的其他居民竞争以阻碍它们的生长。此外，从前 30 个最丰富的物种中选择 20 个物种作为最佳标记集来构建随机森林模型，该模型区分石方和非石方的准确率为 71.2%。基于 20 个物种标记的 POD 也具有强大的分类潜力。由于物种标记可能是预测结石群的潜在有效工具，因此这些物种的群落可能与结石形成有关。

根据对尿路生物组的现有研究，单一病原体不太可能导致 KSD。肾盂可能藏有不同的微生物群落，这些微生物群落不断地相互作用。致病菌可能会改变尿液化学成分以创造结石环境，通过表面结构促进 CaOx 晶体生长和聚集，并诱导肾小管上皮细胞中促炎蛋白和结石基质蛋白的表达，从而加剧结石形成的进程 [ 29， 50 ] , 51]. 保护性细菌可能具有抗炎功能，并抑制致病菌定植以维持平衡的微生物组组成，有利于抗结石环境。我们假设肾脏中保护性细菌的丧失和随之而来的致病菌增加（称为尿液生态失调）可能是 KSD 过程中的关键步骤。

我们的研究有几项局限。首先，样本量不大，40%的样本缺乏结石成分的数据，这限制了普适性、比较和亚组分析。需要更多的研究人群来扩展结石类型的尿路生物组学知识。其次，2bRAD-M 无法预测 urobiom 的潜在功能通路。宏基因组学的应用将有助于深入了解微生物群落的结构和功能信息。最后，与大多数 urobiome 研究一样，我们的研究本质上只是描述性的，未能直接探索 urobiom 的功能。因此，很难确定 urobiome 和 KSD 之间的因果关系。细菌是否是贡献者、旁观者、

结论

总之，我们的研究是第一个应用 2bRAD-M 的研究，2bRAD-M 是一种新型微生物测序技术，可以为低生物量样本提供物种水平的准确分类学概况，以表征单侧结石形成者肾盂尿液的尿路生物组。总的来说，有结石和没有结石的肾盂尿路生物组具有相似的微生物组成。在石头侧观察到棒状杆菌水平升高，普雷沃氏菌和乳杆菌水平降低，以及P. bivia、L. iners、C. aurimucosum和P. sp_286在非石方面得到丰富。属和种之间的联系在 urobiome 中广泛存在, 一些物种可以用来高精度地区分石方和非石方。我们推测尿液生态失调可能在结石形成中起重要作用。然而，需要进一步研究以更深入地了解 KSD 和尿路生物组之间的关联。

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