全面认识TCR-T细胞治疗：(6)TCR-T细胞治疗研究进展

上一期 //全面认识TCR-T细胞治疗// 中介绍了TCR-T细胞临床试验及TCR-T细胞治疗存在的问题。本期，也是该 //全面认识TCR-T细胞治疗// 专题的最后一期，我们将进一步学习TCR-T细胞治疗各个方面的研究进展。从这6期的内容，大家也可能对TCR-T细胞治疗有了进一步的认识，希望对大家有所帮助！

TCR-T细胞治疗研究进展

在临床研究中，TCR-T细胞治疗在安全性和有效性方面暴露出较大的问题。为了解决这些问题，在TCR-T细胞研究领域，寻找安全且有效的靶抗原、提高TCR亲和性与表达效率等是一直努力的方向。但值得注意的是，近年来以新抗原为靶点、寻找新抗原反应性TCR的研究越来越多，并取得了良好的效果。此外，CD4+ TCR-T细胞的肿瘤控制能力也日益受到关注。现将目前增强TCR-T细胞治疗疗效的方法简介如下：

一、新抗原反应性TCR的鉴定

新抗原是由于基因突变产生的异常肽段，这类抗原往往具有肿瘤特异性，因而是很好的治疗靶点。近年来，随着测序技术的进步，可以对肿瘤组织和正常组织进行高通量测序来寻找新抗原。确定新抗原突变位点后，可以利用递呈细胞表达突变表位处于不同位置的多个抗原肽，通过与肿瘤浸润T细胞共孵育，找到新抗原反应性TCR。另外，共抑制分子PD-1的表达也有助于寻找新抗原反应性TCR。靶向新抗原是一个十分诱人的治疗策略，但是该方案属于个体化治疗范畴，且成本较高，目前还不是TCR-T细胞治疗的主流内容。但针对新抗原的TCR-T细胞治疗将是未来的发展趋势，甚至是主要的研究方向。

二、CD4+ TCR-T细胞的治疗作用

传统认为CD8+ T细胞是主要的肿瘤杀伤细胞。因而，CD4+ T细胞在肿瘤治疗中的作用一直未受关注。然而，近年来发现CD4+ T细胞在肿瘤杀伤中也发挥了重要作用。在TCR鉴定中，一直以来都是在寻找MHC-I类分子限制性的TCR序列。此类TCR转导入CD4+ T细胞后，也能促进后者功能的发挥。但是，由于缺少CD4分子的稳定作用，这类CD4+ T细胞在体内很难发挥长效作用。通常，人们认为TCR识别抗原是MHC限制性的，即要么识别MHC-I类分子递呈的抗原，要么识别MHC-II类分子递呈的抗原。但是，有研究证明某些TCR既能识别MHC-I类分子递呈的抗原，又能识别MHC-II类分子递呈的抗原。这也就意味着这类TCR可能既能被CD8稳定，也能被CD4稳定。利用这类TCR进行治疗，将提高CD4+ TCR-T细胞的治疗效果。CD4+ T细胞控制肿瘤的作用也被临床试验直接证明。在患者接受新抗原反应性CD4+ T细胞后，观察到瘤荷降低。

三、TCR α链和β链连接序列的选择

TCR由α链和β链组成。在天然T细胞中，α链和β链分别由2个基因座编码，各自转录翻译后再组装起来。但是在TCR-T细胞中，如果要合成有功能的外源性TCR，就必须考虑同时将α链和β链基因转入同一个T细胞中。在这个过程中，可以考虑用2个载体或用同一个载体中的2个启动子分别表达α链或β链。但是这样的话，可能会导致外源TCR的α链和β链表达失衡，增加TCR错配概率。因而，一个较好的解决办法是利用连接序列使α链和β链受一个启动子的控制，保证蛋白质分子翻译的平衡。内部核糖体进入位点序列（internal ribosome entry site，IRES）是一种被广泛应用的双顺反子连接序列，可以使IRES前后基因共同表达，但是IRES介导的翻译效率较低，导致位于IRES序列后方的基因表达水平不高。如果利用IRES序列连接TCR的α链和β链，则依然可能导致错配发生。在TCR表达系统中，源于小核糖核酸病毒或猪肠病毒的2A肽序列是一个较好的选择。2A肽具有自我切割功能，也就是说，利用2A序列连接α链和β链时，二者一同转录翻译，翻译后断裂成为独立的肽段。利用2A序列可以使TCR链等物质的量（摩尔）表达，降低错配发生概率。值得注意的是，2A连接序列尽管给TCR的α链和β链增加了额外的几个氨基酸，但TCR的功能未受影响。

四、提高TCR膜表面表达效率

当足够数量的TCR识别并结合pMHC后，T细胞才被激活发挥功能。通过共刺激可以降低T细胞活化所需的TCR数量，但是T细胞的持续激活仍依赖于细胞表面的TCR数量和亲和性。TCR的组装及细胞膜表面定位是个复杂的过程。翻译的α链和β链组装形成异二聚体后，与多个CD3亚型分子结合（γ、δ、ε和ζ）。在细胞中，CD3分子，尤其是ζ亚型的含量是一定的。如果不能与CD3分子形成完整的复合物，则多余的TCR被降解。在TCR-T细胞中，这一问题尤为严峻。利用强启动子与2A序列能够保证外源TCR在宿主细胞中的高效表达，但是能够与CD3结合的TCR数量有限，而且还要与内源性TCR竞争结合，这就会导致大量TCR转基因产物被降解，不能形成有功能的TCR-CD3复合物。为了解决这一问题，可以通过共同表达TCR与CD3分子的方法解决。动物实验证明，当TCR与CD3亚型分子共同表达时，TCR在T细胞表面的表达增加数十倍，增加了T细胞与靶抗原的亲和性，提高了肿瘤清除效率和更有效的记忆反应。此外，对TCR编码序列进行合适的修饰，如删除mRNA不稳定序列和剪接位点等，也能使TCR转基因表达上调，增强TCR-T细胞的抗癌活性。

五、TCR恒定区（C区）的选择

TCR的C区在α链和β链正确配对中发挥重要作用。如果能够使外源TCR的C区不同于宿主自身的C区，就能够保证外源TCR形成正确的异二聚体。实验观察显示，在人类T细胞中，小鼠TCR的表达效率比人类TCR要高，提示鼠源TCR能够被正确组装且与CD3分子结合。在这一现象中，小鼠TCR的C区发挥了巨大的作用。基于这一方向，包含人类V区和小鼠C区的混合型TCR被开发并研究，结果显示，在人类T细胞中，混合型TCR的功能强于完全人源性TCR。这个结果说明小鼠C区保证了外源性混合型TCR自身的优先配对以及混合型TCR-CD3复合物的稳定性，提高了TCR的膜表面表达效率。尽管小鼠C区的引入会诱发免疫排斥，但是通过修改小鼠C区的几个氨基酸就能显著降低混合型TCR的免疫原性。针对C区的修饰，除了引入小鼠序列外，还可以对C区的氨基酸序列进行修饰以提高TCR配对准确率。半胱氨酸在TCR α链和β链配对和稳定中发挥了重要作用。利用点突变技术，将α链48位的苏氨酸和β链57位的丝氨酸替换为半胱氨酸，在C区之间形成了额外的二硫键。这一改变增强了外源性α链和β链的配对效率和稳定性，降低了错配的发生，使外源性TCR在细胞表面的表达增加，增强了抗原特异性反应。研究证明，这一策略可降低TCR错配引起的自身免疫病理反应。

六、其他降低TCR错配的策略

利用siRNA或CRISPR/cas9技术可以降低内源性TCR表达，这样既能避免TCR错配的发生，也能降低TCR与CD3分子结合的竞争。多项研究已经证明这一策略的可行性。例如，研究人员在T细胞中共表达了MAGE-A4特异性TCR（TCR序列经过密码子优化，其C区与野生型不同）与靶向野生型TCR C区的保守序列的siRNA，结果显示，转导MAGE-A4-TCR/siRNA载体的人T淋巴细胞中TCR转基因膜表面表达上调。此外，将TCR基因转导入γδT细胞也能避免内源TCR的错配。但是，γδT细胞不表达CD4和CD8分子。如果使用γδT细胞表达有功能的α/βTCR就必须同时转导CD4或CD8分子，以提高γδT细胞的抗原特异性免疫反应。

七、增强T细胞活化信号

直接影响TCR-T细胞活性的信号分子主要是CD3ζ和共刺激或共抑制分子。通过改变CD3ζ和/或共刺激/共抑制分子的表达和功能将影响TCR-T细胞的功能。通过将CD3ζ与TCR α链和β链串联共表达，能够提高TCR的膜表面表达，增强抗原特异性T细胞的功能。此外，还可以将共刺激信号CD28引入TCR序列中，以增强TCR信号转导。这种方法需要将C区完全删除，用CD28的跨膜区取而代之。因此，此类TCR不会与内源性TCR配对，同时具有更强的激活能力。但是，该方法是将Vα和Vβ通过柔性序列直接相连，破坏了TCR原有序列，可能不适应所有的TCR序列，限制了该类修饰的应用范围。近年来，PD-1受到了极大关注，如果能够解除它对T细胞的抑制作用，就能有效提高TCR-T细胞的功能。目前，可以利用CRISPR/cas9敲低PD-1表达或者表达特异抗体阻断PD-1，使TCR-T细胞具备肿瘤杀伤特异性的同时，还阻断了免疫共抑制信号，避免肿瘤杀伤功能受到抑制。

八、提高TCR亲和性

TCR与抗原的亲和性决定了T细胞识别杀伤肿瘤细胞的能力，这一部分内容是TCR-T细胞研究领域的主要方向。很多肿瘤抗原在正常组织中也有表达。因此，对这些抗原高亲和的T细胞已经通过耐受过程清除，能够分离的反应性T细胞的亲和力通常较低，难以获得高亲和力TCR。为了克服难以分离出对肿瘤相关抗原高亲和性的T细胞这一障碍，研究人员转向使用新的系统，期望从中筛选出高亲和性TCR。

1、从人造非耐受环境中分离出高亲和性TCR

这种方法利用了人源化小鼠产生高亲和性T细胞。人体中对肿瘤相关抗原p53有高亲和性的CD8+ T细胞经常被删除。对表达人类HLA-A2的转基因小鼠进行人p53肽免疫后，可引起对人p53高亲和性的小鼠CD8+ T细胞的扩增。将这些高亲和性TCR序列分离后，可用于人CD8+或CD4+ T细胞的重定向。利用相同的方法，已分离出了对其他肿瘤相关抗原高亲和性的T细胞克隆，包含MDM2、癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）和gp100。

2、从MHC不匹配的供者分离出高亲和性同种异体MHC限制性TCR

在HLA-A2阴性的供者的天然淋巴细胞库中，能够分离出对HLA-A2递呈抗原高亲和性的T细胞克隆。此方法最初用于小鼠。利用这种方法，分离出对肿瘤相关抗原，如cyclinD1、WT1和MDM2高亲和性的人T细胞克隆，再将这些高亲和性TCR基因克隆到载体中用于基因治疗。在小鼠模型中，同种异体HLA-A2抗原特异性TCR基因转导的人T细胞被证明能够清除肿瘤细胞。

3、修改TCR序列以提高亲和性

通过修改TCR序列提高亲和性是改善TCR-T细胞治疗效果的有效途径。负责与pMHC结合的CDR区决定了TCR的亲和性，修饰CDR区就有望提高T细胞的功能。研究表明，替换TCR中107位点的一个氨基酸就能提高CDR3β环状结构的稳定性，并且增强TCR的抗原特异性。在筛选高亲和性突变TCR中，可以通过点突变技术，构建含多种突变的TCR α链和β链库，然后利用噬菌体、酵母或T细胞展示装配后的TCR，并进行亲和力筛选。在亲和力筛选中，MHC-多肽四聚体（tetramer）是重要的研究工具。利用四聚体甚至可以从天然TCR中筛选出高亲和性TCR。筛选出的高亲和性TCR在理论上能够增强T细胞的抗原反应性，然后部分研究却证明转导了高亲和性TCR的T细胞对抗原无反应，甚至是发生负性反应。另外一个需要担心的问题是，高亲和性TCR会错误识别抗原，发生脱靶效应。

九、依赖MHC-I类分子限制性TCR的CD4+ T细胞

早期TCR-T细胞的研究内容主要是如何构建抗原特异性CD8+ T细胞。目前，CD4+ T细胞的影响和作用也被考虑。CD4+ T细胞识别MHC-II类分子递呈的抗原肽。与CD8+ T细胞主要发挥细胞毒效应不同，CD4+ T细胞的功能主要是调节适应性免疫系统，增强CD8+ T细胞的功能，以及诱导T细胞的长期记忆。虽然分离的肿瘤抗原高亲和性TCR大多是MHC-I类分子限制性的，在存在CD8共受体时功能最佳，但是研究表明，这些TCR在缺少CD8共受体时也能在CD4+ T细胞中发挥功能。用MHC-I类分子限制性TCR能够产生肿瘤特异性的CD4+ T细胞，增强特异性CD8+ T细胞的肿瘤杀伤能力。之所以产生这种现象，可能与CD4+ T细胞分泌多种免疫因子有关。另外，利用抗原特异性CD4+ T细胞单独治疗肿瘤患者也取得了不错的效果。这些结果提示，应该重视CD4+ T细胞在TCR-T细胞治疗中的作用。

十、延长TCR-T细胞的体内存活时间

过继性细胞治疗面对的一个共同挑战就是输注细胞在体内的存活时间。对TCR-T细胞和CAR-T细胞的研究均证实输注T细胞能够在体内形成记忆性并长期生存。然而，此类细胞的数量太少，在实体瘤治疗中难以发挥作用。目前，常用的维持T细胞生存的方式包括给予外源性IL-2和利用放疗或化疗清除体内淋巴细胞等。其中，IL-2注射具有较为明显的毒性，尤其是高剂量应用时的不良反应更为明显。IL-2的不良反应限制了它的使用。为了绕过这种限制，研究人员尝试在T细胞中表达IL-2，但是结果并不理想。另一种方法是利用放化疗清除淋巴细胞，降低内源性T细胞的数量，避免内源性T细胞竞争细胞生长因子。动物实验证明，若不进行预处理，输注的T细胞不能生存更不能清除肿瘤。淋巴细胞清除性预处理已经成为包括TCR-T细胞在内的输注细胞治疗的标准操作。

除了上述方法外，还可以通过将TCR序列转导入分化程度较低的T细胞或记忆性T细胞中。除了直接处理T细胞外，还可以将TCR转导入造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）。转基因修饰的HSC可以通过阳性选择发育为成熟CD8+ T细胞，产生快速抗原特异性反应。此外，还可能通过代谢调节药物，例如二甲双胍（metformin）影响T细胞分化，延长TCR-T细胞的体内生存。

总之，TCR-T细胞治疗肿瘤的可行性已经被证明。目前，尽管TCR-T细胞治疗还存在一些问题，但是更应该注意到该类疗法强大的临床应用前景。随着肿瘤免疫学和基因工程技术的进步，TCR-T细胞治疗将更加个体化。目前，TCR-T细胞主要针对“通用靶点”进行治疗，TCR-T细胞用于治疗时仅考虑抗原及MHC分子的表达，当这两项条件符合时，即被用于多个患者的治疗。但是，这些患者的实际情况千差万别，TCR-T细胞治疗的这种低选择性可能与治疗反应不佳或者无效等有关。研究显示，以细胞内抗原为靶点开发针对某种肿瘤的TCR-T癌症免疫疗法，也已经成为近年的研究热点。如果能够根据患者的肿瘤相关抗原甚至是新抗原的表达情况设计个体化TCR-T细胞，将有可能明显提高治疗的有效性和安全性。测序技术的成熟和细胞培养技术的进步为这一设想奠定了基础。另一方面，利用低分化T细胞或造血干细胞生产具有更长体内生存时间的TCR-T细胞也将提高此类治疗的效果。另外，通过与免疫检查点阻断药物的联合使用也有利于TCR-T细胞治疗效果的提升。总而言之，TCR-T细胞将在肿瘤治疗中发挥越来越重要的作用，它的发展将为肿瘤患者带来更多希望。