七氟醚通过抑制细胞焦亡减轻蛛网膜下腔出血后早期脑损伤

付瑶 李林

北部战区总医院麻醉科，沈阳 110016

国际麻醉学与复苏杂志,2022,43(11):1128-1135.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20220124-00668

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【论著】

本研究旨在探讨七氟醚对蛛网膜下腔出血（SAH）患者细胞焦亡途径激活和炎症反应的影响。

1 材料与方法      

1.1　实验动物及分组

将小鼠按随机数字表法分为3组（每组36只）：假手术组（A组）（30%氧气和70%空气）、模型组（B组）（SAH+30%氧气和70%空气）、模型+七氟醚组（C组）（SAH+3%七氟醚+空气）。

1.2　实验动物模型制备及处理

所有小鼠在动物室中适应1周。采用颈内动脉穿刺法建立小鼠SAH模型。随机取72只实验小鼠，给予戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉后，放置在加热毯上，将温度维持在（37.0±0.5） ℃。显露小鼠左侧颈总动脉，找到左侧颈总动脉分叉处及左侧颈内动脉、左侧颈外动脉。结扎左侧颈外动脉近端，从远端处经左侧颈外动脉向左侧颈内动脉插入尼龙线，直至感觉阻力，继续向前推进3~5 mm，刺破动脉，持续10 s，制作SAH模型。

A组：取未造模的36只实验小鼠，不刺破大脑中动脉，其余操作同上述方法处理。

B组：随机取36只SAH模型小鼠。

C组：取剩余36只SAH模型小鼠，造模后1 h用小动物呼吸机持续吸入3%七氟醚和空气1 h。

1.3　实验材料

吸入用3%七氟醚。一抗：紧密连接蛋白［闭合小环蛋白‑1（ZO‑1）、咬合蛋白（occludin）、靠停蛋白‑5（claudin‑5）］（1∶500）和基质金属蛋白酶9（MMP‑9）（1∶500），炎症类受体蛋白-3（NLRP3）、IL‑1β、IL‑18（1∶500），裂解半胱氨酸蛋白酶（caspase‑1）（1∶1 000），凋亡相关斑点样蛋白（ASC，1∶200）、甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶（GAPDH）、β‑actin，NeuN。BCA蛋白检测试剂盒，伊文思蓝（EB）试剂盒，PVDF膜，RIPA裂解液，TUNEL染色试剂盒，caspase‑1活性检测试剂盒，实时荧光定量PCR试剂盒。

1.4　神经功能评分

每组取6只小鼠，在SAH后24 h，采用改良Garcia评分评判神经功能，包括6项测试：自发活动、四肢运动、前肢伸展、攀登、敲击一侧肢体和对胡须刺激的反应，前三项每次得分0~3分，后三项每次得分1~3分。每次评分，小鼠得分为0~18分或3~18分，计算连续3次测试的平均得分。分数越高，表示神经功能越好。

1.5　SAH分级

做完神经功能评分后的小鼠立即断头处死，取出脑组织，通过分级法对SAH进行评估。

Willis动脉环将大脑腹侧分为6个部分。根据蛛网膜下腔血凝块的多少，各部分评分0~3分，总分为18分（0分，蛛网膜下腔无血凝块；1分，蛛网膜下腔微量血凝块；2分，蛛网膜下腔可见中等量血凝块；3分，蛛网膜下腔大量血凝块）。6个部分得分相加为该标本的最后评级。所有步骤均采用双盲法进行。SAH分级分为3级：轻度，0~7分；中度，8~12分；重度，13~18分。SAH分级评分≤7分的小鼠不在研究范围内。

1.6　脑水含量测定及血脑屏障通透性评估

每组取6只小鼠用于检测脑水含量。诱导SAH 24 h后，麻醉并断头处死小鼠，快速取出脑组织，并将其分为左、右大脑和小脑。快速称重（湿重）并记录，然后在100 °C的烘箱中烘干24 h，重新称重（干重）并记录。计算脑水含量［（湿重−干重）/湿重×100%］。

EB渗出量在SAH 24 h后检测，以评估血脑屏障的通透性。每组取6只小鼠，处死前1 h麻醉小鼠，尾静脉注射EB4 ml/kg。用PBS对小鼠进行心内灌注，断头取脑。分别将小鼠的左、右大脑和小脑组织在三氯乙酸（生产批号：M002395，江苏普乐司生物技术有限公司）中匀浆以沉淀蛋白质。5 min后，将组织离心（15 000 r/min，离心半径 4.8 cm，20 min），用酶标仪在620 nm处测量光密度值，根据EB标准曲线计算EB浓度，从而计算EB渗出量。

1.7　Western blot实验

每组取6只小鼠断头处死，取同侧大脑半球，4 ℃下RIPA缓冲液裂解脑组织30 min，然后12 000 r/min 离心（离心半径6.2 cm）10 min。参照说明书使用BCA蛋白检测试剂盒测定总蛋白浓度。用10% SDS‑PAGE凝胶分离蛋白质,然后转移到PVDF膜。PVDF膜在室温下用5%脱脂奶粉封闭，4℃下孵育一抗［ZO‑1、occludin、claudin‑5、MMP‑9、NLRP3、ASC、裂解caspase‑1、IL‑1β、IL‑18、GAPDH（1:1 000）］过夜。0.05%Tween‑20的PBS溶液洗涤3次，每次10 min。然后，在室温下用辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠IgG（二抗，1∶5 000）孵育1 h。最后，使用凝胶成像系统检测蛋白条带。用Image J软件分析条带灰度值，以GAPDH为内参，以目的蛋白与GAPDH的比值为目的蛋白的相对表达量。

1.8　实时荧光定量PCR实验

每组取6只小鼠断头处死，取出脑组织进行实时荧光定量PCR实验。用SYBR Green One‑Step qRT‑PCR试剂盒进行。NLRP3引物序列为正向5'‑TCACAACTCGCCCAAGGAA‑3'和反向5'‑AAGAGACACCAGGAGCTAG‑3'；caspase‑1引物序列为正向5'‑AGTCCTGGAAATGTGCCATC‑3'和反向5'‑TCAGTCCATCAGCTAAC‑3'；β‑actin引物序列为正向5'‑TGCTGGAAGGTGGAGG‑3'和反向5'‑CATTGTGAGAGAGAGAGGAGG‑3'。NLRP3 mRNA的相对定量使用公式进行计算分析（比率=2−ΔΔCt，以β‑actin为标准）。

1.9　caspase‑1活性的测定

根据试剂盒说明书，使用caspase‑1活性检测试剂盒检测caspase‑1活性。405 nm处测量其光密度值。

1.10　TUNEL阳性神经元细胞数量的测定

每组取6只小鼠断头处死，取出脑组织，根据说明书，SAH后24 h，将神经元进行TUNEL和NeuN双重染色。脑组织切片与NeuN抗体（1∶200）在4 ℃下孵育过夜，然后在室温下与TUNEL染液孵育1 h，再用4'，6‑二脒基‑2‑苯基吲哚染色液室温孵育染色。光学显微镜下观察细胞焦亡情况。每组选取6张片子，按随机抽签法选取5个高倍视野。手动计算同侧皮质TUNEL阳性神经元细胞数量反映细胞焦亡情况。

2 结 果      

2.1　神经功能评分和SAH分级比较

与C组比较，B组的神经功能评分明显降低（P<0.05，图1Ⓐ）。与A组比较，B组的SAH分级明显增高；与B组比较，C组SAH分级明显降低（P<0.05，图 1Ⓑ）。

2.2　脑水含量和血脑屏障通透性比较

2.3　紧密连接蛋白和MMP‑9的表达比较

与A组比较，B组的紧密连接蛋白ZO‑1、occludin和claudin‑5蛋白表达水平明显降低（P<0.05）；与B组比较，C组的紧密连接蛋白ZO‑1、occludin和claudin‑5蛋白表达水平明显增高（P<0.05，图3Ⓐ~Ⓓ）。与A组比较，B组的MMP‑9表达水平明显增高；与B组比较，C组的MMP‑9表达水平明显降低（P<0.05，图3Ⓔ）。

2.4 脑组织中NLRP3、ASC、裂解caspase‑1、IL‑1β和IL‑18表达情况比较

与A组比较，B组的NLRP3、ASC、裂解caspase‑1、IL‑1β和IL‑18表达水平明显增加（P<0.05，图4）；与B组比较，C组的NLRP3、ASC、裂解caspase‑1、IL‑1β和IL‑18表达水平明显降低（P<0.05，图4）。

2.5　NLRP3 mRNA、caspase‑1 mRNA的表达及caspase‑1活性检测情况比较

与A组比较，B组的NLRP3 mRNA和caspase‑1 mRNA水平明显升高；与B组比较，C组的NLRP3 mRNA和caspase‑1 mRNA水平明显降低（P<0.05，图5Ⓐ~Ⓑ）。与A组比较，B组的caspase‑1活性明显增加；与B组比较，C组的caspase‑1活性明显减少（P<0.05，图5Ⓒ）。

2.6　脑组织神经细胞焦亡情况比较

与A组比较，B组的TUNEL阳性神经元细胞数量明显升高（P<0.05）。与B组比较，C组TUNEL阳性神经元细胞数量明显降低（P<0.05）。见图6。

3 讨 论      

本研究发现，3%七氟醚可以减轻小鼠脑出血、脑水肿，降低血脑屏障的通透性，并改善小鼠SAH后的神经功能评分。七氟醚增加了紧密连接蛋白（occludin、claudin‑5、ZO‑1）的表达；此外，七氟醚降低了炎症因子IL‑1β和IL‑18的表达水平。七氟醚改善SAH后早期脑损伤（EBI），可能与上述机制有关。本研究发现，NLRP3、ASC、裂解caspase‑1、IL‑1β和IL‑18的表达水平在SAH后升高，七氟醚可以抑制NLRP3炎症小体相关蛋白的表达。本研究发现七氟醚减低了MMP‑9的表达，增加了紧密连接蛋白（occludin、claudin‑5、ZO‑1）的表达，减轻了血脑屏障通透性的破坏和脑水肿，改善了SAH后的神经功能。七氟醚能减轻SAH后EBI的神经元细胞焦亡。综上所述，七氟醚能够抑制SAH后NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡，改善SAH后EBI情况。

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