DNA甲基化在脓毒症急性肺损伤中的研究进展

李佩1 于明懂2 张英立2 任万陆1 余剑波3

1天津市天津医院麻醉科，天津 300211；2天津医科大学第二医院麻醉科，天津 300211；3天津市南开医院麻醉科，天津 300100

国际麻醉学与复苏杂志,2022,43(11):1197-1201.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20220516-00681

 基金项目 

国家自然科学基金（82074153）；

天津医科大学第二医院青年科研基金（2020ydey11）

REVIEW ARTICLES

【综述】

脓毒症是指机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍，其特点是炎症、代谢、分解代谢及免疫抑制等途径同时恶化，持续时间较长且很难恢复基础稳态。脓毒症发病过程中，最易受损的是肺，其病理特征主要是中性粒细胞聚集、促炎细胞因子的大量释放、肺内皮细胞和肺毛细血管屏障破坏以及失控的炎症反应等。

表观遗传学是指在环境因素的变化下，通过简单的化学修饰来调控基因的表达，以决定细胞命运及其表型的变化，整个过程并不涉及DNA序列的改变。表观遗传学揭开了多种疾病的基因表达模式，成为最有前途和最具发展前景的领域之一。表观遗传学主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调控，其中DNA甲基化在基因表达调控和细胞分化过程中发挥重要作用。近些年来，表观遗传因素对肺损伤的影响越来越被相关领域的学者所关注。本文对近年来DNA甲基化在脓毒症急性肺损伤（acute lung injury, ALI）发病过程中的研究进展进行综述，以期为脓毒症肺损伤的发病机制和防治策略提供理论基础。 

1 DNA甲基化概述     

在哺乳动物中，DNA甲基化主要是指DNA分子在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase, DNMTs）的作用下将甲基转移到胞嘧啶环的5号碳位上，形成5‑甲基胞嘧啶，进而改变局部染色质的结构来调控基因表达。DNA甲基化主要发生在基因启动子区域的CpG岛（CpG含量超过55%，长度大于200 bp的碱基序列），它在维持正常的细胞功能、基因组结构稳定、染色体失活及遗传印记中发挥重要的作用。DNA甲基化在生物体内是一个可逆的过程，甲基化与去甲基化之间的动态平衡在维持机体内环境的稳定中具有不可替代的重要意义。

DNA甲基化由DNMTs催化，目前发现的具有生物学活性的DNMTs主要包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。其中，DNMT1的主要作用是确保子链DNA按照模板链DNA已有的甲基化模式进行复制，进而将DNA甲基化信息传递给子代细胞；而DNMT3a和DNMT3b则负责催化核酸链上新的DNA甲基化位点发生反应，建立新的DNA甲基化模式。DNA去甲基化有两种方式：一是DNMTs的活性或浓度降低，不足以维持既有的DNA甲基化状态，甲基化的胞嘧啶在复制的过程逐渐被稀释；二是在TET（ten eleven translocation）蛋白家族和胸腺嘧啶‑DNA糖基化酶的催化下，将甲基化的胞嘧啶转化为其衍生物，再经碱基切除修复而完成主动去甲基化的过程。

一般情况下，启动子区域CpG的低甲基化与基因转录激活有关，而高甲基化会导致基因沉默，抑制其表达。目前，DNA甲基化主要通过两种途径抑制基因表达：一种是阻碍转录因子与甲基化的CpG岛结合，直接抑制基因表达；另一种是通过招募DNA甲基结合蛋白及一些阻碍复合物，阻止转录因子与特定DNA序列结合，间接抑制基因表达。病理状态下，DNA高甲基化大多发生于各种疾病抑制基因（抑癌基因、抑炎基因）启动子区域的CpG岛。

DNA甲基化的化学稳定性、时间稳定性及检测方法的可行性和可靠性奠定了其作为生物学标记物用于疾病的风险预测、早期诊断、靶向治疗及药物耐药性机制研究的基础。DNA甲基化相关的临床研究在癌症、自身免疫性疾病、代谢性疾病、精神障碍等方面取得了显著的成果，其在脓毒症发病过程中发挥的作用也成为近年来研究的热点。

2 脓毒症肺损伤的机制      

ALI是脓毒症患者死亡的主要原因之一，在我国其病死率可高达35%。目前认为ALI发病的关键环节是过度失调的全身炎症反应综合征，病理表现以血管内皮损伤和炎症细胞浸润为主。脓毒症时，肺泡巨噬细胞表面Toll样受体，通过识别病原微生物的病原相关分子模式或组织损伤释放的损伤相关分子模式，激活p38丝裂原激活蛋白激酶、Janus激酶及NF‑κB等信号通路，促进TNF‑α、IL‑6及IL‑1等炎症因子的合成，导致炎症级联放大，炎症反应失衡。炎症反应过程中释放的大量细胞因子和炎症介质产生大量氧自由基，可直接作用于肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞（endothelial cells, EC），导致水肿、白细胞浸润和血栓形成，进一步加重局部和全身炎症反应。EC是循环血液和周围组织之间的半选择性屏障，在优化气体交换方面以及控制屏障完整性和功能方面起着关键作用，血管屏障完整性的破坏可导致低氧血症和急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS），氧自由基引起的氧化应激也可进一步引起线粒体和高尔基体的结构改变和功能障碍，加重肺组织的损伤。

脓毒症相关免疫紊乱的特征之一是内毒素耐受。脓毒症的起始事件是病原体入侵宿主，许多人类病原体使用表观遗传机制来操纵宿主对感染的反应，从而有利于其生存。在炎症或感染初期，免疫系统短时间内做出迅速的调整来影响免疫细胞的反应性，并通过在不同水平上调控信号通路，触发固有免疫和获得性免疫来保护机体，在脓毒症后期，则因免疫系统功能失调而出现免疫耐受的现象。

3 DNA甲基化与脓毒症肺损伤      

在脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的ALI/ARDS大鼠模型中，通过对正常与ALI/ARDS肺组织全基因组的DNA甲基化分析发现，1 721个基因的启动子区和990个基因的CpG岛存在异常的DNA甲基化，其中14个甲基化的基因已经被证明参与ALI/ARDS的发病过程。在一项以人体血液为标本的基因表达综合数据库分析中，通过对脓毒症ALI患者与单纯脓毒症患者血液的DNA芯片数据比较，分析出差异表达的基因序列与肺损伤和免疫应答有关，而DNA甲基化水平的改变与它们的差异表达相关。对重症肺炎患者全血样本的分析确定了在脓毒症早期DNA甲基化水平发生了明显的改变。而ARDS患者的血液样本检测也发现了若干与炎症或免疫功能、内皮功能、上皮功能和（或）凝血功能失衡有关的DNA甲基化位点。

3.1　DAN甲基化与炎症反应

DNA甲基化与炎症反应之间的关系密切。核受体协同抑制因子（nuclear receptor corepressor, NCOR）是一种核转录抑制因子，在炎症反应的启动和进展过程中发挥着重要作用。研究发现在LPS诱导的巨噬细胞模型中，DNMTs的表达水平及NCOR启动子区域的DNA甲基化水平升高，而NCOR的表达显著下降，伴随着TNF‑α和IL‑1β表达水平升高。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator‑activated receptor, PPARγ）是核受体超家族的一种配体依赖性转录因子，通过调节中性粒细胞迁移和活化、增强巨噬细胞吞噬功能、调节炎症介质及激活氧/氮物质等来发挥强大的抗炎作用。在LPS诱导的ALI小鼠巨噬细胞中，PPARγ启动子甲基化水平升高，而抑制PPARγ启动子甲基化则可缓解ALI。烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase, NAMPT）是一种能促进B细胞成熟和抑制中性粒细胞凋亡的细胞因子，是肺损伤的生物标志物，血液中的NAMPT蛋白通过连接Toll样受体4激活NF‑κB信号，在LPS处理的人肺动脉内皮细胞及ALI小鼠的肺组织中，NAMPT基因启动子区域DNA甲基化水平降低伴随着基因转录增加，也揭示了DNA甲基化在脓毒症ALI发生、发展中的关键作用。

3.2　DNA甲基化与肺血管屏障

DNA甲基化通过影响基因组转录来发挥关键作用，调控EC的功能，对肺损伤过程中的血管功能障碍造成影响，用DNMTs抑制剂治疗，降低了LPS诱导的ALI小鼠的死亡率，并改善了肺血管细胞的完整性。糖萼是一种富含多糖的、由EC合成并分泌的一种多糖‑蛋白复合物，具有维持血管通透性、抑制细胞间黏附等作用。在LPS诱导的小鼠肺损伤模型中，DNMTs抑制剂预处理可明显改善糖萼的完整性，通过降低肺血管的通透性来减轻肺损伤，提示DNA甲基化参与了脓毒症肺损伤发病过程中的血管内皮破坏。肌球蛋白轻链激酶的非肌肉亚型是由肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase, Mylk）基因编码的一种细胞骨架蛋白，在调控EC基质和细胞间黏附、血管完整性和通透性、肺部炎症等关键病理生理作用中发挥重要作用。在ARDS人群的肺内皮细胞中，Mylk基因启动子区甲基化水平降低，肌球蛋白轻链激酶的非肌肉亚型表达水平增加，阻断CpG位点的遗传变异则显著升高Mylk基因启动子区甲基化水平，降低肌球蛋白轻链激酶的非肌肉亚型表达水平，证实了DNA甲基化可以作为调控Mylk基因表达的靶点，以减轻炎症诱导的血管通透性增加和炎症性肺损伤。

3.3　DNA甲基化与免疫紊乱

脓毒症早期以广泛的炎症为主，晚期则以全身抗炎反应综合征和免疫抑制为主，内毒素耐受是脓毒症相关免疫抑制的标志之一。在人类内毒素模型中，3 714个基因在转录水平上发生了变化，这些基因的表达改变与基因的DNA甲基化水平改变有关，并且这些基因的表达改变与免疫系统的耐受性和后续感染的易感性增加相关。体外证据表明，在静息的单核细胞中，最初暴露于内毒素的TNF启动子迅速去甲基化，导致核小体重新定位并暴露出NF‑κB结合位点，激活炎症反应，而随着细胞对内毒素的耐受，TNF启动子反复甲基化导致其对内毒素的刺激不再敏感，发生免疫抑制。

在免疫系统分化和形成的过程中，DNA甲基化调控确保免疫细胞呈现出合适的基因表达模式，DNA甲基化能通过调节B细胞的命运和功能、控制T细胞的分化和记忆反应、调控调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）的分化和数量参与机体的免疫激活和免疫抑制过程。Tregs是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，在肺损伤免疫调控中发挥重要的作用，转录因子叉头框转录因子家族蛋白3（forkhead box protein 3, Foxp3）是Tregs特异性调节标志，在LPS诱导的ALI小鼠模型中，接受DNA甲基化抑制剂治疗后的ALI小鼠肺组织中Tregs数量增加，表现为Foxp3表达增强、活化状态、抑制表型和增殖能力增强，这提示改变Foxp3基因的DNA甲基化水平能通过调控Tregs的数量以及分化，在肺损伤的发生、发展过程过发挥一定的作用。

3.4　DNMTs抑制剂与脓毒症ALI

医学界一直在不断探索脓毒症ALI的治疗方法，近年的一些研究表明DNMTs抑制剂对脓毒症ALI有一定的治疗作用，这为脓毒症ALI的治疗提供了一个新的方向。在LPS诱导的ALI小鼠模型中，肺组织中DNMT1和5‑甲基胞嘧啶水平均明显升高，伴随着肺泡水肿、出血和中性粒细胞浸润等ALI的病理学改变，应用DNMTs抑制剂可以减轻小鼠肺病理性损伤，降低肺湿干重比，降低炎症因子TNF‑α、IL‑1β的表达水平，降低氧化应激产物髓过氧化物酶和丙二醛的水平，这说明DNA甲基化参与了脓毒症ALI时的炎症反应和氧化应激反应。

在ALI小鼠模型中，DNMTs抑制剂可以减少巨噬细胞的炎症、迁移和黏附，通过减轻肺损伤降低盲肠结扎穿刺模型小鼠的死亡率。对内毒素诱导的ALI小鼠应用DNMTs抑制剂和组蛋白脱乙酰化酶抑制剂trichostatin A进行联合治疗，可降低丝裂原活化蛋白激酶活性，抑制组蛋白去甲基化酶‑信号转导与转录激活因子3信号通路，促进M2巨噬细胞表型的分化，恢复巨噬细胞线粒体膜的完整性，逆转其细胞凋亡，从而减轻ALI的炎症反应。

4 总结与展望      

近年来研究发现，DNA甲基化这一表观遗传学方式参与多种人类疾病的发病过程，DNA甲基化的可调控性提示我们可以通过逆转基因表达的方法来治疗疾病。如本文所述，DNA甲基化参与了脓毒症ALI时的炎症反应、氧化应激反应、免疫抑制、血管及肺内皮/上皮屏障的破坏等病理过程，并且对DNA甲基化进行干预可以阻断或逆转与脓毒症肺损伤相关的基因表达变化，有望成为治疗脓毒症ALI的有效手段。近来年关于内源性保护系统在脓毒症ALI中的研究获得了较为可靠的证据，但表观遗传机制是否在其中发挥作用，仍然具有较为广泛的研究空间。由于目前的DNA甲基化调控药物不具有特异性，在改变致病基因的过程中有可能会伴随着其他基因表达的改变，因此，筛选出脓毒症肺损伤高度相关的DNA甲基化差异基因，并寻求其特异性的干预药物意义重大。