预处理对缺血再灌注肝细胞自噬的影响

高晓沛郑凯月 高露月 王娜 汪芳俊

川北医学院附属医院麻醉科，南充 637000

国际麻醉学与复苏杂志,2022,43(11):1218-1222.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20220202-00685

 基金项目 

四川省卫生健康委员会科技基金资助项目（17PJ215）

REVIEW ARTICLES

【综述】

肝缺血再灌注损伤（hepatic ischemia reperfusion injury, HIRI）是指肝细胞的超微结构、能量代谢及肝功能等在缺血期发生一系列损伤性变化，当缺血组织在重获血供后，其功能不仅未恢复，反而相关损伤性改变进一步加重的现象。预处理是指在缺血前或缺血启动后的数分钟内，采用短暂的缺血再灌注或药物进行干预从而减轻再灌注损伤的手段。随着对HIRI相关机制探究的逐渐深入，药物预处理、缺血预处理和远隔缺血预处理等手段已被证实可改善HIRI。

HIRI的相关机制很复杂，主要涉及：① 内皮细胞功能障碍；②活性氧（reactive oxygen species, ROS）的大量生成；③ 钙超载；④ 细胞间相互作用（如免疫细胞等）；⑤ 线粒体通透性转换孔的开放。

1 HIRI的病理学机制

缺血初期，肝细胞损伤轻微，活检仅可见肝细胞轻度变性；缺血晚期，有氧代谢向无氧代谢转化，肝细胞内ATP耗竭，导致线粒体内氧化磷酸化障碍、乳酸和酮体等的堆积，最终导致代谢性酸中毒。由此所致的pH下调可抑制蛋白水解酶及磷质酸酶等的活性，削弱其对肝细胞及其他细胞的损伤性效应；再灌注期血供迅速恢复后酸中毒被纠正，氧化应激及微循环障碍反而加剧，肝细胞损伤加重。此外，酸性环境导致线粒体内Ca2+显著增多，损伤线粒体的结构与功能，并且氧自由基生成增多。肝细胞膜可直接被氧自由基破坏，导致内容物的释放，促进炎症反应中氧自由基的生成；此外氧自由基也可损伤内皮细胞，引起微循环屏障的破坏及血流量的减少。

再灌注过程会加重肝细胞的缺血性损伤，这种损伤与细胞内ATP耗竭、能量依赖性新陈代谢和物质转运过程受抑相关，再灌注过程还可导致机体内促炎与抑炎反应间的平衡失调。再灌注早期，活化的肝原位巨噬细胞及Kupffer细胞生成大量ROS，导致线粒体氧化应激加剧，自噬过度激活对机体产生损伤；再灌注6~24 h后，内皮细胞和肝细胞中的细胞核激活因子和激活蛋白‑1共同作用于Kupffer细胞，致其线粒体内膜膜性损伤，同时中性粒细胞诱导炎症介质（如氧化剂及弹性蛋白酶等）的释放引起粒细胞聚集及微循环紊乱。此外，活化的Kupffer细胞还释放ROS和炎症因子（如TNF‑α、IL‑1等）；TNF‑α可诱导中性粒细胞NF‑κB、促分裂素活化的蛋白激酶等表达，促进ROS产生。TNF‑α与肝细胞表面的特异性受体结合，使趋化因子［如细胞间黏附因子‑1（intercellular cell adhesion molecule‑1, ICAM‑1）、血管细胞黏附因子‑1和选择素等］表达上调，激活炎症级联反应，导致HIRI。也有研究发现，体内一氧化氮和内皮素（endothelin, ET）的含量失调也是再灌注造成肝损伤的重要因素，一氧化氮通过其直接的舒血管作用对机体的特异性及非特异性免疫功能造成影响，实现对微循环、白细胞和血小板的调节；ET则作用于磷脂酶及细胞的离子通道发挥其呈剂量性缩血管效应，在再灌注阶段，ET的合成及分泌增多，这可能是由缺氧及Ca2+浓度的增高刺激内皮细胞产生ET及再灌注过程中由门静脉进入肝内的肠源性毒素刺激内皮细胞分泌ET共同所致。此外，有研究表明，热休克蛋白对HIRI可发挥保护性效应，在肝缺血早期即有热休克蛋白mRNA的表达，再灌注后其表达增强；且当缺血时间延长、损伤加重时，其表达增多；在损伤修复后其表达又下调，但损伤极重时，其表达不增高且迅速消失。

2 HIRI与细胞自噬     

2.1　肝缺血对细胞自噬的影响

肝缺血早期，血供受限导致氧供需失衡，ATP生成减少，进而引起肝细胞功能障碍诱发肝功能障碍。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP‑activated protein kinase, AMPK）是一种敏感的胞内能量传感器，常在肝缺血及能量危机时的自噬激活中发挥重要作用。缺血早期ATP含量降低可激活AMPK，活化的AMPK直接或间接地对UNC‑51样激酶1进行修饰，促进自噬的启动。

能量缺乏时，叉头框（forkhead box, Fox）O的乙酰化由去乙酰化酶（sirtuin 1, SIRT1）介导，可促进自噬‑溶酶体的合成，自噬活性增强；相反，当FoxO1去乙酰化被抑制或表达量减少时，自噬活性减弱。在缺血阶段，SIRT1‑FoxO信号转导通路对自噬的调节起重要作用。此外，还有研究表明，缺氧诱导因子‑1可在缺血阶段诱导自噬的启动，提示缺血引起的缺氧环境也参与自噬活性的调节。

磷脂酰肌醇3‑激酶/苏氨酸蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白是细胞经典的存活信号转导通路，在自噬的调节中发挥重要作用，活化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白可直接阻断自噬相关基因的表达，抑制自噬启动。有研究表明，部分中药可通过激活磷脂酰肌醇3‑激酶/苏氨酸蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号转导通路、抑制Toll样受体4/中性粒细胞NF‑κB通路减轻HIRI。

2.2　肝缺血再灌注对细胞自噬的影响

在再灌注阶段，自噬的增强伴Beclin1表达增多；也有研究表明，Beclin1过表达可增强体外缺血再灌注阶段自噬的活性，而在采用siRNA敲除或抑制Beclin1表达后，再灌注期间肝细胞自噬活性明显下降，提示Beclin1在再灌注阶段自噬的调节中起关键作用。ROS则作为强诱导因子在Beclin1介导的再灌注自噬中发挥重要作用，再灌注期间氧化应激加剧伴随ROS生成增多、Beclin1过表达，采用抗氧化剂干预后，Beclin1表达显著减少，提示ROS可促进Beclin1表达以增强自噬活性；ROS除调节Beclin1的表达外，也可使自噬相关基因（autophagy‑related gene, ATG）4活性受到抑制，促进轻链3（light chain 3, LC3）脂质化以启动自噬。

2.3　细胞自噬对HIRI的影响

在体和离体模型研究已证实缺血再灌注后细胞自噬水平增高。此外，在再灌注早期，自噬活性增强发挥保护性效应，而在晚期表现为损伤性效应。机体可对自噬降解所产生的游离小分子物质再利用合成ATP以弥补能量匮乏。有研究表明，应用自噬抑制剂3‑甲基腺嘌呤（3‑methyladenine， 3‑MA）后，ATP含量下降，心肌细胞死亡加重。正常生理状态下，肝细胞通过自噬与泛素‑蛋白酶体系统（ubiquitin proteasome system, UPS）清除长寿及受损的蛋白质，以控制蛋白质质量；但在缺血再灌注期间，UPS功能紊乱，导致肝蛋白泛素化及蛋白质的聚集增多，自噬被激活后，其部分功能用于清除细胞毒性泛素化蛋白。Oliva‑Vilarnau等研究表明，自噬增强可抑制肝中的蛋白质聚集。以上结果均提示：在缺血再灌注期间，自噬活性的增强可补偿受损的UPS功能，防止蛋白沉积对机体造成损伤。

Ca2+超载及后续Calpain‑1、Calpain‑2的激活可使肝细胞自噬受损，引起线粒体渗透性转变，最终导致细胞死亡。在线粒体内膜之间的区域中，常发生缺血引起的氧化磷酸化不全和促凋亡因子释放导致的细胞凋亡；此外，线粒体渗透性转变也可作为信号分子引起自噬活性减弱，导致机体对功能损伤的线粒体清除不全及细胞死亡。研究表明，在缺血阶段可经SIRT1/线粒体融合蛋白（mitofusin, MFN）2轴对线粒体自噬和其功能进行调控，SIRT1可增强线粒体自噬并促进线粒体修复以减轻HIRI。

3 预处理对缺血再灌注损伤肝细胞自噬的影响      

3.1　缺血预处理（ischemia preconditioning, IP）

肝IP是指通过在肝蒂处夹闭肝动脉及门静脉实现短暂的肝缺血再灌注，使肝能更好地适应长时间的缺血状态。动物研究表明，IP组细胞因子释放减少、腺苷生成增多、细胞内ATP水平上调、肝细胞再生能力增强；IP还可活化抗凋亡基因或通路，抑制凋亡介质表达进而减少缺血再灌注所致的肝细胞凋亡。肝移植物经过IP后，细胞因子Beclin1和LC3表达升高，且LC3阳性细胞数量和肝细胞坏死指数呈反比；此外，与未经IP的肝移植物相比，IP后的肝移植物在受者体内发生急性和慢性排斥反应的发生率均显著降低。也有研究表明，在半肝切除术中预先行IP（缺血和再灌注各10 min），随后对肝血流进行30 min阻断，与对照组比较，IP组转氨酶水平明显降低。研究表明，在肝移植或肝切除手术中并未观察到IP具有显著益处，因此IP是否可减轻HIRI及其相关信号转导的机制有待进一步探究。

3.2　远隔IP

远隔IP是指通过对距靶器官较远的部位进行短暂的缺血再灌注从而使靶器官更好地耐受长时间缺血。动物研究表明，对心脏局部冠状动脉进行短暂的缺血能使心肌的其他区域更易耐受长时间缺血；在肝远隔IP中，常采用下肢进行IP。已有研究证实，在肝缺血前，采用远隔IP能改善肝微循环、减轻损伤，且预处理组血中一氧化氮浓度显著高于对照组。也有研究表明，远隔IP是通过改善肝微循环来改善HIRI，并考虑与血红素氧合酶‑1相关。

3.3　药物预处理

3.3.1　抗炎药物预处理

动物研究表明，采用腺苷受体激动剂进行预处理后，试验组TNF‑α水平下降，内毒素所致的肝细胞损伤减轻。也有研究表明，运用大麻素受体激动剂对小鼠缺血再灌注模型处理后，机体炎症反应和粒细胞趋化性减弱。近年来，大鼠肝缺血前进行抗炎药物预处理后，机体IL‑10、TNF‑α水平下调，抑制炎症级联反应的启动。此外，采用类固醇预处理后，试验组IL‑10水平增高，IL‑6和C反应蛋白水平下降，转氨酶水平下调，术后胆红素水平下降，且大鼠的生存率增高。

3.3.2　抗氧化药物预处理

在采用甲状腺激素预处理的动物模型中，HIRI明显减轻，考虑与肝细胞抗氧化应激能力提高相关。有研究表明，前列腺素可通过抑制细胞膜降解、改善脂类代谢来发挥其在HIRI中的保护作用。研究表明，在肝暖缺血前运用3‑硝基丙酸进行预处理后，再灌注引起的氧自由基爆发性增多导致肝细胞凋亡水平降低。

3.3.3　肝细胞能量代谢药物预处理

HIRI中微循环紊乱是影响肝细胞自我修复和再生的重要因素，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶是导致微循环紊乱的关键因子。研究表明，在大鼠缺血再灌注前1 h给予聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂，微循环明显改善，HIRI减轻。也有研究表明，联合采用葡萄糖、维生素C和IP后，肝细胞线粒体功能改善，细胞内能量储存能力增强，从而减轻因能量不足所致细胞凋亡增加，改善HIRI。

3.3.4　麻醉药物预处理

3.3.4.1　异丙酚预处理

相关动物研究表明，与对照组相比，经异丙酚预处理后的实验组细胞结构基本正常，自噬体数目较少；血清中转氨酶水平显著降低，肝组织LC3‑Ⅱ/LC3‑Ⅰ和Beclin 1表达均降低，表明由LC3‑Ⅰ向LC3‑Ⅱ的转化减少。考虑异丙酚预处理通过限制自噬体的过度形成和成熟，将自噬维持在适当水平，防止自噬过度激活对正常的组织器官及蛋白造成损伤，从而减轻HIRI。因此，使用异丙酚作为此类患者麻醉诱导及麻醉维持药物可能是改善HIRI的有效策略之一。

3.3.4.2　七氟醚预处理

既往研究表明，经七氟醚预处理的实验组转氨酶、ICAM‑1和血清氧化应激指标（丙二醛）低于对照组，而缺氧诱导因子‑1高于对照组，且实验组术后并发症明显减少，提示七氟醚预处理可抑制炎症反应，下调氧化应激的水平，减轻HIRI。也有动物研究发现，经七氟醚预处理后的实验组转氨酶、TNF‑α和IL‑1水平较缺血再灌注组降低，IL‑10较缺血再灌注组增高，且实验组肝组织结构损伤减轻；而自噬抑制剂则可消除以上保护性效应。以上研究提示，七氟醚预处理可通过增强自噬从而削弱炎症反应，增强肝对缺血再灌注的耐受性，减轻HIRI。但七氟醚预处理通过何种信号转导通路来调节细胞自噬从而改善HIRI仍有待探究。

3.3.4.3　瑞芬太尼预处理

研究表明，瑞芬太尼预处理组中血清转氨酶、TNF‑α和IL‑1水平均降低，组织病理学损伤明显减轻，提示瑞芬太尼可下调氧化应激及自由基水平、减少炎症因子释放、抑制炎症级联反应启动，并减少由此所致的细胞凋亡及坏死，考虑与瑞芬太尼使p38蛋白激酶磷酸化激活相关。此外，研究表明，抑制NF‑κB的表达可改善HIRI，而瑞芬太尼预处理组NF‑κB及ICAM‑1的表达显著减少，考虑瑞芬太尼可通过下调NF‑κB的表达进而抑制由下游信号分子ICAM‑1启动的炎症反应从而对HIRI发挥保护性效应。但瑞芬太尼是否通过作用于细胞自噬从而实现对炎症反应及细胞凋亡的调节仍有待研究。

4 小结与展望      

研究表明，预处理、HIRI和细胞自噬三者相关性极高，IP及药物预处理可通过不同途径改善HIRI，提高患者存活率，改善患者预后。但预处理通过何种生物学机制改善HIRI仍不明确，需进一步探究。此外，目前的研究主要集中于炎症、氧化应激机制，而对线粒体机制和免疫机制等研究尚少。因此，进一步探究更多的预处理方式及具体的信号转导通路有助于更好地预防和减轻HIRI。