科研丨南昌大学 & 军事医学院: 肠道微生物组的靶向调节调控大鼠代谢谱并缓解海拔相关性心脏肥大(国人佳作)

编译：九卿臣，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读   

慢性高山病（CMS）是一种生活在高海拔地区人群中出现的综合征，当缺氧适应能力丧失时就会发生。作为CMS的一个标志性特征，缺氧诱导的心脏肥大也通常被普遍认为是慢性心力衰竭的基本病理过程，这是全球心血管疾病导致死亡的主要原因。在过去的几十年里，人们提出了一些生物学理论来解释长期低压缺氧刺激后与海拔相关的病理性心脏肥大，包括氧化应激、炎症和激酶活性，然而潜在机制仍未完全阐明。  

人类对高海拔会产生生理或病理上的反应，这些反应伴随着肠道菌群的改变。为了研究调节肠道菌群是否可以缓解高海拔相关疾病，我们使用益生菌、益生元和合生元在低压缺氧刺激后的高海拔相关心脏损伤大鼠模型中观察到三种治疗均减轻了心脏肥大（通过测量心脏重量-体重比和心脏组织中生物标志物的基因表达水平）。低压缺氧对肠道菌群的破坏也得到了改善，尤其是Ruminococcaceae和Lachnospiraceae ，代谢组学显示，低压缺氧显著改变了血浆短链脂肪酸（SCFAs）、胆汁酸（BAs）、氨基酸、神经递质和游离脂肪酸，但没有改变整个粪便总SCFAs和BAs。这些治疗能够在一定程度上恢复血浆氨基酸和神经递质的稳态，但对其他测量的代谢物则不能。本研究为进一步研究高海拔相关疾病中肠道菌群的潜在机制奠定了基础，并为靶向肠道菌群治疗提供了机会。

论文ID

原名：Gut Microbiome-Targeted Modulations Regulate Metabolic Profiles and Alleviate Altitude-Related Cardiac Hypertrophy in Rats

译名：肠道微生物组的靶向调节调控大鼠代谢谱并缓解海拔相关性心脏肥大

期刊：Microbiology Spectrum

IF：9.043

发表时间：2022.2

通讯作者：徐振江、毕玉晶

通讯作者单位：南昌大学、军事医学研究院

DOI号：10.1128/SPECTRUM.01053-21

实验设计

80只无特异性病原体的雄性Wistar大鼠均在相同条件下饲养，经过6天的适应期后，随机分为常压常氧（NN）组和低压缺氧（HH）组。将NN大鼠保持在海平面水平上，而HH大鼠运送到一个模拟5000 m的海拔高度室内饲喂28天，HH大鼠在第一周内均维持在持续缺氧的状态下，接下来的3周内将条件改为间歇性低压缺氧（缺氧>20 h/天）。大鼠每天灌胃生理盐水、益生菌、益生元或合生元（10只大鼠/组），商业益生菌含有3株双歧杆菌和6株乳杆菌，益生元主要由聚葡萄糖、半乳糖和菊粉组成，合生元是益生菌和益生元的混合物。所有试剂均溶于生理盐水（0.9%氯化钠）中，药物采用灌胃方式，每只大鼠每日灌胃3ml生理盐水，益生菌的剂量为5×109CFU/大鼠，益生元剂量为1g/大鼠。在转移至舱前3天（标记为第0天）和第28天采集粪便样本，实验结束时采集心脏和血浆样本。心脏组织用TRIzol试剂提取总RNA，对粪便样本，使用QIAamp Fast DNA Stool minikit进行DNA提取和纯化，采用定量PCR进行益生菌的鉴定，并利用针对16S rRNA基因V3-V4区域的引物在Illumina MiSeq PE250平台上构建双向测序扩增文库，采用超高效液相色谱/质谱（UHPLC/MS）分析粪便和血浆中的靶向代谢组学。

图1实验设计图。

前言

越来越多的证据强调了肠道菌群在人类健康和疾病中的重要性，临床调查公布改变肠道菌群在慢性心力衰竭患者中的特点是致病菌过度增长，以及大量的潜在促进健康的微生物减少，如Faecalibacterium，Lachnospiraceae ，Erysipelotrichaceae和Ruminococcaceae被称为SCFAs的生产者。在心肌梗死后诱导的心脏肥大模型中，抗生素治疗的肠道菌群缺失增加了心脏肥大的严重程度，而补充SCFAs（丙酸）和益生菌可减轻症状。在高血压大鼠模型中，肠道菌群的失调也与心脏损伤相关，丙酸和益生菌显示出有益的抗炎和降压作用。同样，多项研究表明，微生物衍生代谢物（如三甲胺-N-氧化物和胆汁酸）也参与了慢性心力衰竭的发展，因此肠道菌群可能在心脏肥大和心力衰竭的发病机制和进展中发挥关键作用。然而关于肠道菌群和CMS之间的联系仍然缺乏相关知识，特别是在与海拔相关的心脏肥大方面。

在一项平行研究中发现长时间低压缺氧导致大鼠的病理性心脏肥大与肠道菌群及其代谢潜力的显著变化有关，因此研究肠道菌群靶向干预是否可以改善与海拔相关的心脏肥大是有必要的。在本研究中，我们采用析因设计来研究益生菌、益生元和合生元治疗对低压缺氧诱导的心脏肥大的影响，分析粪便菌群、粪便SCFAs和BAs以及血浆代谢组和细胞因子，结果显示益生菌、益生元和合生元可显著降低低压缺氧大鼠的心脏肥大、肠道菌群失调和血浆代谢谱，表明肠道菌群靶向治疗可能是海拔相关心脏肥大的有效治疗策略。

结果

1 研究设计

如图1所示，将大鼠随机置于常压常氧（NN）和低压缺氧（HH）两种环境中，NN大鼠维持在海平面水平，HH大鼠在模拟5000m高海拔环境的低压缺氧室中维持28天，平行研究证明，长时间暴露于HH会导致病理性心脏肥大和肠道菌群及代谢物的显著变化。为了确定口服益生菌或益生元是否能恢复肠道微生物生态系统并减轻HH诱导的心脏肥大，两种环境下的大鼠每日灌胃生理盐水（对照）、益生菌、益生元或合生元28天。益生菌补充剂中含有3株双歧杆菌（B. animalis subsp. lactis V9，B. longum KT-L9，B. adolescentis KT-A8）和6株乳杆菌（L. casei Zhang，L. plantarum P-8，L. paracasei KT-P6，L. rhamnosus M9，L. acidophilus KT-A1，L. helveticus H9），益生元由聚葡萄糖、半乳糖和菊粉组成，合生元是两者的混合物。我们在治疗前（第0天）和治疗后（第28天）采集大鼠粪便，在实验结束时收集血浆和心脏。 为了验证灌胃28天后益生菌的存在，我们采用特异性引物进行qPCR实验，检测L. casei Zhang，L. plantarum P-8，L. rhamnosus，L. helveticus，B. adolescentis species，B. animalis subsp. lactis和Bififidobacterium。HH益生菌大鼠中检测到L. casei Zhang（图S2B），L. plantarum P-8（图S2C），L. rhamnosus（图S2E）、B. animals sub. lactis（图S2F）和Bifidobacterium（图S2H）相较于第0天在第28天时水平显著升高。我们还比较了第28天生理盐水组和益生菌组L. casei Zhang（图S2I），B. animals sub. lactis（图S2J）和Bifidobacterium（图S2K）的丰度，在NN和HH条件下，益生菌组的丰度均高于生理盐水组，这些结果共同证实了粪便中存在益生菌。   

2 肠道菌群靶向治疗减轻了HH诱导的病理性心脏肥大 

研究表明低压缺氧可诱导心脏肥大，这是心脏为维持稳态而增加负荷的适应性反应，其特征通常是心脏和心肌细胞大小增加，心室壁变厚。HH大鼠的心脏大小（图2A和B）和心脏指数（湿性心脏重量与总体重的比值，图2C）均有显著增加。益生菌、益生元和合生元处理均在统计学意义上显著抑制了低压缺氧诱导的心脏大小（图2A和B）和心脏指数（图2C）的增加，表明它们有效地缓解了海拔相关的心脏肥大，但对NN条件下的大鼠影响不大。 心脏肥大有生理性和病理性两种类型，与具有正常收缩功能和心脏结构的生理性心脏肥大不同，病理性心脏肥大以心肌重构为特征，最终发展为心力衰竭。作为心脏纤维化的生物标志物，I型和III型胶原基因表达增加，是进行性心力衰竭的一个重要特征，缺血性心肌病中I型和Ⅲ型胶原的比例较低。

研究中观察到与NN生理盐水组相比，HH生理盐水组的I型和III型胶原含量更高，I型/III型胶原比例降低，这表明是心脏重构和缺血性心肌病。然而使用益生菌、益生元或合生元的治疗未能影响I型（图2D）、III型胶原（图2E）或它们的比例（图2F）变化。心房利钠肽（ANP）和脑利钠肽（BNP）是心脏分泌的激素，它们随着病理性肥大的严重程度而增加。HH生理盐水组大鼠心脏组织顶端的mRNA水平显著高于NN生理盐水组大鼠，经益生菌、益生元或合生元处理后，ANP的表达略有下调，但只有合生元组的ANP水平显著降低（图2G），在HH处理的大鼠中，BNP基因的表达也部分恢复（图2H）。心肌肌球蛋白重链（MHC）是另一种心脏肥大标记物，在α型和β型中表达，病理性心脏肥大中βMHC表达增加，αMHC/βMHC亚型的基因表达比例降低。结果显示低压缺氧刺激降低了αMHC（图2J），增加了βMHC（图2I），导致αMHC/βMHC比值降低（图2K）。这种下降的比例在处理后略有逆转，特别是合生元组（P<0.05；图2K），主要是通过提高αMHC的表达（图2J）。与HH生理盐水组大鼠相比，治疗组大鼠的βMHC表达水平没有明显变化，但在益生菌组和合生元组中表现出略低的水平（图2I）。总的来说，数据表明肠道菌群靶向治疗减轻了长时间HH条件下暴露引起的病理性心脏肥大。

图2 肠道菌群靶向治疗减轻了HH诱导的病理性心脏肥大。

（A）实验结束时捕获的大鼠心脏图像。（B，C）测量各组的心脏宽度（B）和心脏重量/体重的比值（C）。（D-K）通过实时定量PCR检测I型胶原（D）、III型胶原（E）、I型胶原/III型胶原（F）、心房利钠肽（ANP）（G）、B型利钠肽（BNP）（H）、心肌肌球蛋白重链亚型（βMHC）（I）、心肌肌球蛋白重链亚型（αMHC）（J）、心脏组织顶端αMHC/βMHC的mRNA基因表达（K）。数据归一化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh）基因的表达。数据以均值±S.D.表示，6只大鼠/组。用GraphPad Prism 8.0软件进行组间统计学差异分析，采用单因素方差分析和t检验。*P<0.05，**P<0.01（原文图1）。

3 治疗方法改善低压缺氧对肠道菌群的影响 

为了研究益生菌、益生元和合生元对低压缺氧大鼠肠道菌群变化的影响，我们对第0天和第28天采集的粪便样本V4区进行了16S rRNA基因扩增子测序。分类组成主要为Ruminococcaceae、S24_7、Lactobacillaceae、Lachnospiraceae、Verrucomicrobiaceae、Prevotellaceae以及非注释到的科水平，占总丰度的80%以上（图S2）。S24_7、Lactobacillaceae和Prevotellaceae的丰度似乎由于长时间的低压缺氧暴露而发生了改变，然而在科级分类图上，处理组间的分类学差异并不明显。

我们没有观察到Shannon指数、Faith PD或ASVs（扩增子序列变异）在治疗组之间的显著α多样性差异。根据文献，年龄是驱动肠道菌群组成的主要因素，结果显示来自两个时间点的样本在PCoA图上分别以加权或未加权的UniFrac距离明显分离（图3A）。Mantel检验还显示同一大鼠第0天和第28天的肠道菌群没有显著相似，证实了年龄引起的肠道菌群的巨大差异（未加权UniFrac，p-val=0.17；加权UniFrac，p-val=0.95）。低压缺氧刺激也显著影响了肠道菌群，因为第28天的NN和HH样本无论它们的处理方法如何（图3B），在PCoA图上都聚集成它们自己的组。为了控制年龄影响和抵消个体的基线变化，我们计算了每种微生物第28天丰度与第0天丰度的对数比，然后使用对数比值来表示年龄因素导致的微生物分布。PERMANOVA分析结果显示，在正常或低压缺氧条件下，生理盐水组与其他治疗组之间的肠道菌群有显著差异（表S1），此外，与生理盐水对照组相比，治疗组NN和HH样本之间的β多样性距离缩小，表明低压缺氧引起的肠道菌群差异显著缓解（图3C），这种改善在合生元组比益生菌和益生元组更为显著。

图3 该治疗改善了低压缺氧对肠道菌群的影响。

（A）所有样本未加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA），样本是按天着色的。（B）未加权UniFrac距离第28天的PCoA，样本用不同的处理方法着色，锥形表示神经网络样本，球形代表HH样本。样本按形状而不是颜色聚类，这表明低压缺氧对整体菌群的影响大于治疗。（C）与生理盐水组相比，三种处理中NN和HH样本之间的Euclidean距离均减少。** P <0.01（原文图2）。

接下来我们确定了一组个体微生物，它们的丰度被低压缺氧显著改变，这些微生物大部分属于Ruminococcaceae和Lachnospiraceae（图4A，表S2）。这些治疗方法逆转了其中的一些改变，例如在经过益生菌、益生元或合生元处理后，Ruminococcaceae和Oscillospira的ASVs对数比急剧降低到NN水平（图4A）。在平行研究中发现低压缺氧条件改变了Parabacteroides，Alistipes，Prevotella，Lachnospira，Lactococcus以及Bacteroides和 Prevotella的比例。我们还在属水平上对这些类群进行了研究，观察到除Lachnospira外，治疗减弱了这些变化（图4B）。综上所述，我们的结果表明低压缺氧破坏了正常肠道菌群组成，而这种破坏可以通过使用益生菌、益生元和合生元来大大缓解。

图4 受低压缺氧影响的差异丰富微生物的热图。

（A）采用线性模型（ASV~NN/HH环境＋益生菌＋益生元＋合生元）来估计各因素对ASV丰度的影响。NN/HH、益生菌、益生元、合生元的线性模型系数在热图的四列中可视化，每一行代表一个对HH环境有显著影响的ASV，颜色越深表明该因素的影响越大。热图显示，该治疗在一定程度上逆转了低压缺氧对大多数ASV的影响。星号（*）表示错误发现率（FDR）<0.1。（B）Lactococcus, Parabacteroides, Alistipes, Lachnospira及prevotella与bacteroides和prevotella的比值相互作用图。如果治疗线与生理盐水线不平行，则说明治疗与HH环境之间存在相互作用。除Lachnospira外，其他属对HH诱导的变化均有所缓解。（原文图3） 

4 粪便SCFA和BA谱的改变 

SCFAs和BAs是肠道菌群产生的两种主要影响宿主生理活性的小分子，用高效液相色谱-质谱法对在第0天和第28天收集的粪便中9个SCFAs和15个BAs进行了分析，与肠道菌群结果相似，总体粪便SCFA（图5A）和BA谱（图5B）都主要受到大鼠年龄的影响。Mantel检验也显示第0天和第28天之间的相关性不显著（SCFAs，p-val=0.73；BAs，p-val=0.40），因此对粪便SCFA和BA数据进行了类似的对数比转换来进行下游分析，与肠道菌群结果不同的是，PERMANOVA分析显示，生理盐水对照组NN和HH大鼠SCFA或BA差异均无统计学意义。然而，益生元处理组的NN和HH大鼠之间的粪便SCFA谱的Euclidean距离减小（图5C），益生元和合生元处理组的粪便BA谱也同样降低（图5d）,表明益生元和合生元可能能够抵消HH对粪便SCFA和BA谱的影响，可能是由于效应量和样本量较小，使这种HH效应没有统计学意义。 我们进一步鉴定了NN和HH生理盐水大鼠之间差异丰富的三个个体代谢物，它们都是短链脂肪酸，包括2-甲基丁酸、异戊酸和异丁酸，然而这些改变的SCFAs都不能通过治疗逆转（图5E）。

图5 粪便SCFA和BA谱的变化。

（A，B） Aitchison距离的PCoA显示，年龄影响了粪便中SCFAs（A）和BAs（B）的总体组成，样本按日着色，锥形表示神经网络样本，球形代表HH样本。（C，D）每个治疗中NN和HH样本之间的Euclidean距离。益生元减少了SCFAs的距离（C），合生元减少了BAs的距离（D）。（E）差异粪便SCFAs的相互作用图，治疗不能逆转SCFAs的表达。**P <0.01。（原文图4）

5 治疗对血浆代谢组和细胞因子的影响 

通过比较无菌啮齿动物与传统啮齿动物的代谢物谱，可以清楚地表明宿主血液中有大量的代谢物来自肠道菌群。最近的代谢组学研究显示，肠道微生物来源或宿主的内源性代谢物与各种疾病之间有很强的相关性，因此为了研究与低压缺氧和治疗相关的血浆代谢组的变化，我们量化了第28天的血浆代谢物，包括SCFA、其他中链和长链游离脂肪酸（FFA）、BAs、氨基酸（AAs）、神经递质（NTs）和细胞因子。基于Aitchison距离的PERMANOVA分析显示，低压缺氧引起血浆SCFA、BAs、AAs、FFA和NTs的整体轮廓变化（所有p-val<0.01），但不影响细胞因子（p-val=0.062）。益生菌治疗减轻了AAs（图6A）和NTs（图6B）的这些变化，但对其他类型的代谢物（图S3A-C）没有影响。 我们进行了双向方差分析，以检验低压缺氧及其与治疗的相互作用对单个代谢物的影响。图S3D显示了所有被单独低压缺氧刺激有统计学意义改变的代谢物，包括犬尿氨酸、犬尿喹啉酸和谷氨酸。一些代谢物在HH和治疗之间具有统计上显著的交互作用。这些HH改变的代谢物（主要是BAs和FFAs）的水平在治疗后有统计学意义的恢复，最显著的是在合生元治疗组（图6C-H）。

图6 治疗对血浆代谢组和细胞因子的影响。

（A，B）在AAs（A）和NTs（B）中，益生菌处理降低了NN和HH样本之间的Aitchison距离，** P<0.01。（C-H）双向方差分析的相互作用图。如果治疗线与治疗线不平行，则表明治疗与HH环境之间存在交互作用。HH组中DCA（C）、12-甲基三烷酸（D）、13-甲基肉豆蔻酸（E）、琥珀酸（F）、琥珀酸（G）、棕榈酸（H）的相对丰度被逆转，尤其是通过合生元。点表示每一组的平均值，误差条表示标准误差（原文图5）。

6 多组学轮廓之间的相关性

对于每一对收集到的数据集都进行了Mantel检验，以寻找它们的总体组成之间的相关性（图7A），发现肠道菌群、粪便（而不是血浆）SCFA和BA谱之间有很强的相关性。肠道菌群也与氨基酸和神经递质相关，反应了肠道菌群对氨基酸代谢和神经活性分子产生的影响。在个体SCFA中观察到血浆和粪便中的醋酸盐水平呈正相关，但它们与大多数其他SCFAs呈负相关。粪便丁酸与血浆丁酸呈显著正相关，与2-甲基丁酸、异戊酸、己糖酸呈中度相关（图7B）。总的来说，粪便中的BAs与血浆中的BAs相关（图7A），这可能是因为肠道中的大部分BAs通过肠肝循环被重新吸收。除血浆UDCA与粪便CDCA、血浆GDCA与粪便LCA相比外，血浆和粪便BAs之间的大多数个体相关性没有统计学意义（图7C）。

图7 多组学之间的相关性。

（A）采用Mantel检验分析微生物组、粪便SCFAs、粪便BA、血浆SCFAs、血浆BAs、血浆AAs、血浆FFAs、血浆NTs、血浆细胞因子之间的相关性。（B，C）粪便SCFAs与血浆SCFAs之间（B），以及粪便BAs与血浆BAs之间（C）的Spearman相关性。可视化深红色表示强正相关，深蓝色表示强负相关。星号表示匹配的配对之间有统计学意义。一颗星（*）表示FDR<0.05，两颗星（**）表示FDR<0.01（原文图6）。

对粪便微生物与粪便/血浆代谢物进行两两相关性分析，经过多次假设校正后，列出了所有的显著相关性，如图8所示（FDR<0.01，cor系数>0.5）。根据微生物和代谢物的相关系数对行和列进行排序后，可以大致分为两种相关模式，其中，Christensenellaceae的3种微生物可导致肥胖和代谢综合征，均与Phe、Glu和胆固醇呈负相关。

图8 粪便微生物与粪便和血浆代谢物之间的成对相关性。

每一行都是一个ASV，每一列都是一个代谢物。深红色表示强正相关，深蓝色表示强负相关。星号表示匹配的配对之间有统计学意义。一颗星（*）表示FDR<0.05，两颗星（**）表示FDR<0.01（原文图7）。 

讨论

低压缺氧是导致高山病发展的主要因素，人类遗传和环境因素之间复杂的相互作用影响个体对低压缺氧诱导的高山病的易感性。它最有效的治疗方法是降低海拔、补充氧气和药物治疗，如使用乙酰唑胺。证据表明，低压缺氧对肠道菌群有深远的影响，然而诱导综合征和肠道菌群转移是否仅仅是它们之间的关联还是存在因果关系仍不确定。如果肠道菌群失调对高山病有影响，那么肠道菌群靶向干预可能是一种有效的治疗方法。 

在本研究中，我们给低压缺氧刺激的大鼠灌胃益生菌、益生元和合生元，通过qPCR实验对益生菌进行了验证，这些治疗使HH诱导的肠道菌群向正常组成的方向改变，尽管与年龄和低压缺氧环境相比，它们对整体肠道菌群的影响有限。我们鉴定出了被HH显著改变的细菌，经过三种处理后，它们的丰度都恢复到了神经网络水平。 低压缺氧诱导大量的代谢重编程，为了全面描述这些代谢变化，测量了大量的粪便和血浆代谢物，在HH大鼠中发现血浆短链脂肪酸、其他游离脂肪酸、胆汁酸、氨基酸和神经活性分子都发生了改变。HH刺激大鼠血浆中3个中长链FFAs水平显著升高，分别为棕榈酸、芥酸和甜酸 （图6F和G），血浆中FFAs水平与心脏病相关，在缺氧环境下，血浆棕榈酸（PA）增加，血浆PA升高与心血管疾病的发生有关，PA导致体外胰岛素分泌和胰岛细胞活力下降，血浆芥酸能够通过血脑屏障，并通过链缩短被纳入特定的脂质代谢。 

其中，低压缺氧刺激后，Glu/Pro和Gln/Pro比值急剧下降，而Glu/Gln比值也明显下降，但下降程度较小（图S4）。脯氨酸在癌症中起着重要的调节作用，被发现是适应低压缺氧过程中的重要代谢物，在人体中，Gln可以通过谷氨酰胺酶转化为Glu，在肿瘤中，通过吡咯啉5-羧酸（P5C）合酶将Gln和Glu转化为Pro的过程在缺氧反应中被发现增强，这与我们观察到的它们比率的变化一致。这说明高海拔动物模型可能与肿瘤发生过程中低压缺氧的病理生理过程有一些相似之处，然而我们对益生菌、益生元和合生元的治疗除了轻度减轻Glu/Gln比值（图S4C）外，并不能恢复这种特殊的氨基酸代谢重编程。此外，我们将这些多组学谱进行交叉关联，发现粪便和血浆代谢组学与肠道菌群数据集具有一定程度的相关性，反映了微生物组对代谢活性的影响。许多个体的SCFAs和BAs在血浆和粪便中没有相关水平，这意味着要么血液和肠道的代谢物交换受到积极的调节，要么它们的水平受到这里未解释的其他代谢过程的显著干扰。 

综上，益生菌、益生元和合生元可显著减轻长时间低压缺氧刺激引起的心脏肥大，肠道菌群转移以及代谢组的改变也通过干预措施得到改善，这表明肠道菌群调节可以作为高山病的治疗方法。 

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