综述丨ANNU REV FOOD SCI T: 下一代食品研究: 使用元组学方法表征食物链中的微生物群落

编译：微科盟小木，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读   微生物存在于食物链中，并以积极和消极的方式影响食品的质量和安全。识别和理解这些微生物群落的行为有助于在公共卫生和食品行业环境中实施预防或纠正措施。目前依赖于培养的微生物分析非常耗时，并且只针对特定的微生物亚群。然而，更多地使用无需培养的元组学方法有可能促进对食物链中微生物群落的全面表征。事实上，这些方法在促进疫情调查、确保食品真实性、评估抗菌素耐药性的传播、追踪发酵和加工过程中的微生物动态以及揭示食物链中影响食品质量和安全的因素方面显示出潜力。本综述探讨了基于群落的方法，特别是基于测序的元组学方法的应用，以表征食物链中的微生物群落。    

论文ID

原名：Next-Generation Food Research: Use of Meta-Omic Approaches for Characterizing Microbial Communities Along the Food Chain

译名：下一代食品研究：使用元组学方法表征食物链中的微生物群落

期刊：Annual Review of Food Science and Technology

IF：14.714

发表时间：2022.3

通讯作者：Paul D. Cotter

通讯作者单位：爱尔兰农业部Teagasc食品研究中心

DOI号：10.1146/annurev-food-052720-010751

综述目录

1 前言

2 微生物在整个食物链中的重要性

2.1 品质:风味、质地、发酵和腐败

2.2 安全性:病原体和微生物拮抗作用

3 微生物表征的传统方法

4 元组学方法:群落方法

4.1 基于测序的元组学方法

4.2 其他元组学方法

4.3 基于测序的元组学方法所面临的挑战

5 基于测序的元组学方法在食物链中的应用

5.1 公共卫生应用

5.2 食品行业应用

6 总结

7 未来的问题

主要内容

1 前言

从农场到餐桌的食物链中的微生物影响着食品的质量和安全。历史上，基于培养的技术已被广泛用于表征这些微生物。然而，随着分子技术和高通量测序技术的发展，非培养技术越来越多地应用于食品微生物组分析。这导致了相应的从对食品微生物的特定分类群或种群的调查转向更广泛的基于群落的分析。这些方法基于核酸、蛋白质和/或代谢物的提取，无需培养即可检测和表征环境中的微生物。由于微生物的发生和相互作用会影响食品的质量和安全，因此对这些过程的深入了解有助于对不良食品安全事件进行早期干预，确保最佳食品质量，并确定理想或不理想微生物的来源。 尽管培养方法费时费力，但仍是食品工业中最常用的方法。但最大的限制之一是，这些方法往往只能检测样本中存在的一小部分微生物，因为它们依赖于单个微生物在培养基上的分离和生长，其代谢和生理需求可以在体外复制。这不仅忽略了部分可存活但不可培养的微生物(VBNC)，而且也没有考虑样本中存在的细菌群落之间的关系。据估计，在许多环境中，未培养的微生物占微生物总数的99%，这意味着使用传统培养方法会严重低估微生物数量。尽管这种程度的低估在食品系统中可能不那么严重，但是，由于食品和食品加工环境的微生物群落由复杂、动态的微生物群落组成，元组学方法有可能提供对这些群落更准确和更深入的理解。 本文简要介绍了微生物对食品质量安全的贡献以及微生物鉴定的传统方法。本综述的主要重点是基于测序的元组学方法及其对理解食品、食品相关环境和食品加工微生物群落动态的贡献，还简要提到了其他非测序的元组学方法。  

2 微生物在整个食物链中的重要性

2.1 品质:风味、质地、发酵和腐败

食品质量往往与pH值和水分含量等物理参数有关，这些参数可影响食品和食物链中微生物的生长和生存。食品变质是使产品不受欢迎或不能被消费的过程或变化，它受到食品内在特性和外在环境的影响。这是一个复杂的过程，食物发生生化变化，通常是由于生态决定因素的微生物活动。常见的腐败菌包括假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、希瓦氏菌属(Shewanella spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、梭菌属(Clostridium spp.)、乳酸菌(LAB)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。最终，不同的细菌会导致不同种类的食物出现不同的质量问题，如表1所示。此外，尽管酵母和霉菌的生长速度较慢，但它们能够利用食物系统中的许多生态位，并能够利用细菌无法利用的底物并耐受极端条件。常见的腐败酵母菌包括接合酵母菌(Zygosaccharomyces，在高糖食品中)、酿酒酵母(Saccharomyces，导致葡萄酒产生气体和浑浊)和念珠菌(Candida，导致肉类和奶制品异味)，常见的腐败霉菌包括Zygomycetes(在高水分产品中)、青霉菌(Penicilliumspp.，导致水果腐烂)、曲霉(Aspergillus，谷物、香料和坚果中)。 微生物也可以通过改变食物的内在特性来改善食品质量。这在发酵食品中是很明显的，微生物的活性除了延长保质期外，还可以提高其感官和营养品质。发酵食品微生物可以自发引入(从原料或生产或加工环境)或作为发酵剂接种，随着时间的推移，可以产生酶、挥发性化合物和抗菌分子，如有机酸、脂肪酸、过氧化氢、双乙酰和细菌素，有助于减缓或防止腐败和病原微生物的生长。尽管微生物的自发引入与本综述有特定的相关性，但我们在此简要概述了发酵食品中一些最重要的微生物。

乳酸菌(LAB)是一些发酵食品生产中最重要的微生物之一。这反映在许多LAB对发酵食品环境的自然适应上，但多年来的研究已经对其进行了补充，以更好地理解和提高其对产品安全、感官、营养和健康特性的贡献。不同种类的LAB已被用于乳制品(奶酪和发酵牛奶)、肉类(香肠)、鱼、蔬菜(酸菜和泡菜)、酱油、谷物(酵母)和酒精饮料(葡萄酒)。另一类与发酵有关的细菌是醋酸菌，主要由醋酸杆菌(Acetobacter)和葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter)组成。这类细菌在咖啡、可可和醋发酵过程中起着重要作用，因为它们具有氧化碳底物的能力。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)对大豆的工业化发酵很重要，因为它们生长迅速，发酵时间短。酵母在许多发酵食品的生产中也起着重要的作用。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)用于酒精发酵，酵母最终被用于许多本土发酵食品，因为它们耐酸，能够在高温下生长，并存在于多种环境中。在亚洲，人们普遍食用用酵母发酵的本土食物，如味噌、酱油和葡萄酒。  

表1 由不同生物引起的食物腐败的经典示例。  

2.2 安全性:病原体和微生物拮抗作用

虽然发酵食品和其他微生物对食品质量和安全有贡献，但在食品安全方面，微生物往往被视为负面的，食源性病原体是每年全球食源性疾病和暴发的原因。据估计，欧洲每年因食用受污染食品造成4500人死亡(WHO 2017年)。2019年欧洲食源性疾病暴发的病原体是细菌病原体(26.4%)、细菌毒素(19.3%)、病毒(10.7%)以及寄生虫和其他病原体(3.6%)，40%的疫情报告有未知病原体(EFSA & ECDC 2019)。常见病原菌有蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、大肠杆菌(Escherichia coli)、Listeria monocytogenes、沙门氏菌(Salmonella spp.)、志贺氏菌(Shigella spp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、弧菌(Vibrio spp.)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)等。诺如病毒和戊型肝炎等病毒以及寄生虫(包括刚地弓形虫Toxoplasma gondii和旋毛虫Trichinella spiralis)，也是疾病暴发的常见原因。病原微生物进入食物链的途径多种多样，可以是原料本身所固有的，也可以通过设备、食品加工机或包装材料等途径在加工过程中引入。微生物群落也可以以生物膜的形式存在，它们是附着在固体表面的微生物群落，可能含有可以在食品加工设施表面持续存在的致病和腐败物种。这些生物膜一旦附着，就很难去除，因为它们嵌入聚合物基质中，而且生物膜中的细胞可能对消毒剂或抗菌剂具有抗性，特别是在混合物种生物膜中。为了克服食品工业中的这一挑战，正在进行预防生物膜形成和去除现有生物膜的控制策略的研究工作。食品安全管理制度，包括危害分析和关键控制点，以及风险评估原则已得到广泛实施以预防食源性疾病和暴发，并控制病原体在食物链中的传播。然而，这些管理系统依赖于对存在的微生物及其可能构成的风险的全面了解。 尽管从食品安全的角度来看微生物往往是负面的，但有些微生物在生物控制或生物保存方面很有用。微生物拮抗作用已通过细菌素、噬菌体等应用于食品工业。细菌素是一种由抗菌肽组成的物质，已被用于靶向食品中的腐败菌和致病菌，从而延长食品的保质期并提高食品的安全性。来自LAB的细菌素(如乳酸链球菌肽)已被批准用于食品，最常用于肉类、奶制品和蔬菜产品。细菌噬菌体或噬菌体是细菌的病毒捕食者，已显示出巨大的前景，因为它们是自然产生的，并控制特定的病原菌，而不影响食品的质量和微生物群。噬菌体已被应用于从农场到餐桌各个阶段的一系列食品中，以消除常见的病原菌，如空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、大肠杆菌O157:H7等。此外，一些物种的生物膜可以通过战胜不良细菌来帮助提高食品安全。一些LAB菌株被发现对有害细菌表现出拮抗特性，充当天然屏障，并改变腐败微生物的生物膜形成。在食品中，微生物群落及其相互作用对食品质量和安全起着至关重要的作用。

3 微生物表征的传统方法

如上所述，基于培养的测定方法历来被用于检测、计数和分离食品和环境样品中的活的食源性病原体或腐败微生物。一般来说，样品首先要均质化，然后通常要进行富集步骤(预富集和选择性富集)，然后是选择性或差异电镀以区分存在的其他微生物，最后通过生化、血清学或其他方法进行鉴定。预富集用于恢复受损细胞和稀释食物样品中的抑制性化合物，而选择性富集增加了目标病原体的浓度，同时抑制了其他微生物的生长。这些传统方法价格低廉，但耗时费力，根据目标微生物的不同，接种、分离和鉴定需要2-3天到一周的时间。此外，由于可能存在VBNC细菌，可能会出现假阴性，这可能意味着无法成功检测到食品中的病原体或腐败菌。 由于需要更及时地检测细菌以应对食源性暴发，近年来已经深入研究了用更快的免疫学或基于分子的方法取代传统电镀步骤的快速方法，并得到了更广泛的采用。食品病原体的检测需要高水平的灵敏度和特异性。基于抗原与抗体特异性结合的免疫学方法，例如酶联免疫吸附试验(ELISA)，已经显示出了潜力，但它们缺乏灵敏度和相对较高的检测限[103-105菌落形成单位(CFUs)/mL]，这意味着通常需要在检测之前先进行富集。然而，当ELISA与纳米技术相结合时，其在食品分析中的应用获得了更高的灵敏度、特异性和稳定性。 与传统的培养方法相比，聚合酶链式反应(PCR)、定量PCR(qPCR)、环介导等温扩增(LAMP)等基于核酸的技术需要更短的时间，并且通过多路复用可以促进同时检测、实时监测和定量多个微生物目标。开发和优化每种检测方法非常重要，因为复杂的食物基质可能会阻碍核酸提取，并含有可能干扰检测反应的抑制剂。尤其在多路复用时，引物设计至关重要，因为引物组需要相似的退火温度才能成功进行检测。不幸的是，这些方法(如基于免疫的检测)，由于其检测限(103-104CFUs/mL)，通常仍需要富集或浓缩步骤，而且由于病原体在食品中的浓度通常较低，因此很难直接检测。另一种主要用于临床环境的快速方法是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)，它分析电离和飞行时间检测后来自核糖体蛋白的信号，这些信号对于每种菌株都是独特的，从而可以快速鉴定微生物。尽管这些快速方法通常优于基于培养的方法，但在常规采用之前，行业和监管机构需要进行彻底的验证。 尽管基于培养的方法和快速方法可用于识别复杂食品或食品环境相关样品中的微生物，但它们对特定微生物的重视程度不平衡，尽管进行了多路复用，但仍然仅捕获整个微生物群落的一小部分。由于微生物存在于群落中，因此对其进行研究非常重要，因为一个物种或菌株的生长、生存和活动可能会影响或与另一个物种或菌株的存在有关。此外，从实践角度来看，理论上可以同时鉴定食物链样本中所有病原体和腐败微生物的方法可能会产生破坏性的积极影响。    

4 元组学方法:群落方法

技术的进步为更快和更好地表征食物链微生物组提供了机会，并转向用非培养的基于分子的方法取代或补充依赖于培养的方法。全基因组测序通过提供比以前的分型方法更深入的微生物菌株鉴别能力，成功地补充了依赖于培养的方法，美国和欧洲的监管机构现在将其作为病原体分型和抗菌素耐药性(AMR)监测的工具。在大肠杆菌O157:H7暴发调查中，基因组测序方法优于其他分型方法，提供了有助于改进流行病学病例和群体识别、地理来源追踪以及潜在新出现菌株信息的见解。 相比之下，非培养方法，如DNA测序技术的使用，能够同时识别和表征食物中或食物链中的多种微生物，同时无需培养微生物。图1显示了一些当前基于群落的方法。

图1 当前用于微生物研究的元组学方法。基于测序的方法包括宏遗传学、宏基因组学和宏转录组学，其他基于群落的方法包括宏蛋白质组学和宏代谢组学，这些方法目前被用于人类、环境和食品微生物组的研究。

4.1 基于测序的元组学方法:宏遗传学、宏基因组学和宏转录组学

宏遗传学，也称为扩增子测序、分类学、宏条形码，有时也称为16S宏基因组学或16S核糖体RNA(rRNA)基因测序，是一种通过PCR从混合基因组DNA中扩增标记基因的靶向方法。然后直接测序并与参考数据库进行比对，以确定整个微生物群落的分类学组成。16S rRNA基因是细菌鉴定中最常用的基因，普遍存在于细菌中，该基因包含9个高变区，其中部分或全部可通过扩增和测序靶向鉴定相应的细菌分类。类似的方法可以通过靶向18S或23S rRNA基因或rRNA操纵子的内转录间隔区(ITS)应用于真菌。 鸟枪法宏基因组学，通常称为宏基因组学，是通过对从混合微生物群落中提取的整个DNA样本进行测序，对微生物种群进行非靶向基因组分析。该方法包括对样本DNA进行片段化，然后制备测序文库，分析所得数据以提供关于整个微生物群落的分类组成和功能潜力的信息。由于宏基因组学的非靶向性，在假设DNA提取方法合适的情况下，可以从样本中获得与各种微生物(包括细菌、病毒、古菌和真菌等单细胞真核生物)有关的信息。

由于缺少扩增步骤，消除了宏遗传学可能存在的偏差并具有更高的灵敏度，从而使分类达到菌株水平。鸟枪法宏基因组学的另一个优势是，如果应用足够的测序深度，可以恢复宏基因组组装基因组(MAGs)，这可以提供更多的基因组信息，揭示特定类群的功能和安全相关特性，并允许研究食品相关微生物物种(如LAB)的菌株水平多样性。 宏转录组学涉及对从样本中分离的总mRNA进行非靶向测序，从而可以识别样本中具有转录活性的微生物，并可以进一步深入了解微生物群落的潜在功能特征。这种方法揭示了群落中最活跃的微生物，同时也使人们能够更深入地了解复杂食物微生物群落或与食物相关环境中的微生物群落是如何相互作用的。这种方法还可用于观察食品中的原位基因表达，收集目前在食品生态系统中表达的可能与食品发酵和/或腐败相关的代谢活动的信息。宏转录组学的另一个优势是能够检测基于RNA的病毒，包括食源性病原体，如诺如病毒。   

4.2 其他元组学方法:宏蛋白质组学和宏代谢组学 

其他基于群落的非测序方法，如宏蛋白质组学和宏代谢组学，也有用于食品微生物组研究的潜力。宏蛋白质组学是对给定时间点样本内微生物群落产生的整个蛋白质补体的大规模研究，有助于将基因组和转录组数据与生物学功能联系起来，加深对表型随着条件变化而变化的理解。宏蛋白质组学提供有关微生物群落及其丰度和功能、群落内相互作用、群落代谢和生理变化以及样品中微生物的底物利用、碳源和同化途径等信息。质谱法用于宏蛋白质组学，其在食品微生物群中的应用主要是发酵食品(如发酵大豆和奶酪)的表征。然而，宏代谢组学涉及使用化学、生物化学和生物信息学来检测和分析样品中的小分子代谢物，并提供对微生物表型特征的见解。宏代谢组学分析分为两类：非靶向分析，侧重于检测尽可能多的代谢物；靶向分析，侧重于特定条件下用户选择的特定代谢物。该领域的研究人员通常使用质谱或核磁共振来评估食品成分、质量、安全性、真实性和可追溯性。宏蛋白质组学和宏代谢组学与其他组学方法的整合被用于提供新的见解并将基因组信息与表型联系起来。     

4.3 基于测序的元组学方法所面临的挑战 

尽管这些基于测序的方法很有前景，但要实现更广泛的应用，它们还面临着一些挑战。这些元组学方法面临的主要挑战是缺乏标准化，由于使用不同的提取方法、测序平台、数据库和生物信息学工具，导致结果出现差异。为了强调这一点，我们参考了几项研究，这些研究根据所采用的分析方法得出了不同的结论，从而强调需要确定那些提供最大准确性的方法，并最终以标准化方式使用它们。 同样，在分析方面，结果通常以相对丰度表示，这一事实可能会导致误解，因为一个分类单元相对丰度的增加会导致其他分类单元的相对丰度同时减少。因此，有必要使用互补的方法来量化微生物群落，这方面的方法包括数字PCR、qPCR、流式细胞术和培养。值得注意的是，在测序中使用合成标准对不同的方法产生了不同的结果，这再次强调了在分析过程中需要谨慎。 此外，对于宏遗传学，由于缺乏与靶向16S rRNA基因的高变区相关的一致性，在尝试比较不同研究的结果时存在困难。此外，对一个标记基因的关注可能会导致其他问题。特别是，16S rRNA基因的操纵子拷贝数因分类群而异，这可能会无意中影响定量估计。单拷贝靶基因(如recA、rpoB和gyrB)已被建议作为替代品，但由于它们仅与细菌的特定分类群相关和/或缺乏充分填充的数据库，因此它们的使用受到限制。

从方法学的角度来看，提取足够浓度和质量的DNA/RNA对测序至关重要，这在某些情况下可能具有挑战性，例如从低微生物负荷地区采集的环境拭子样本。扩增方法(如多重置换扩增(MDA))被用于产生足够数量的DNA，并已研究纳入对照以减少污染，但这些方法可能会导致偏差。 无论是标准宏基因组测序还是宏基因组测序，从微生物组内活生物和死亡生物中提取的DNA都没有区别，这对于食品或食品环境微生物群的研究至关重要。叠氮溴化丙啶(PMA)和以前更常用的叠氮溴化乙啶(EMA)是DNA结合染料，它们可选择性地结合基质中存在的可接近的DNA，本质上是结合死亡细菌和其他细胞的DNA，并防止其在文库制备过程中扩增。因此，在DNA提取前用PMA处理可选择随后对活细胞DNA进行测序。PMA与测序的成功应用使得在牛奶加工和奶酪制造过程中可以对活细胞进行选择性分析，但其性能可能受到微生物群落和样品生物量的影响。利用内标准品对这些染料的应用进行研究，从而可以定量活细胞和死细胞，并在不同食物或环境基质中优化这种处理。另一种选择是用RNA测序代替DNA或与DNA一起测序，因为测量RNA拷贝的目标是活性微生物部分，这允许区分活微生物和死亡微生物，尽管mRNA的不稳定性可能再次带来挑战。需要进一步研究活细胞和死细胞的鉴别，特别是将这些基于测序的方法应用于食品相关样本。 值得注意的是，特别是对于宏遗传学，一些测序平台(如由市场领导者Illumina开发的平台)产生的短读长可能会限制在物种水平上的分类。其他能够产生较长reads的测序平台可能会解决这个问题，如牛津纳米孔技术公司(ONT)或太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)的测序平台，但较低的read准确度和较高的测序成本可能是问题。 虽然鸟枪法宏基因组测序克服了与基于扩增子的方法相关的许多偏差，但其最大的挑战之一是，当随机测序含有大量宿主DNA的样本时会降低微生物的测序深度。虽然大多数研究在生物信息学分析过程中从宿主DNA中去除reads，但更有效的替代方法是通过各种化学方法和市售试剂盒来减少宿主DNA或富集微生物DNA。同样，在宏转录组学中，高度丰富的rRNA会导致成本增加和复杂的下游分析。为了克服这一挑战，在下游分析中采用了测序前和/或测序后去除rRNA缺失或mRNA富集策略。此外，随着测序技术的使用，先进的计算能力和生物信息学技能对于它们的使用是必要的，这在考虑应用这些方法时增加了挑战。

5 基于测序的元组学方法在食物链中的应用

5.1 公共卫生应用

上述基于测序的元组学方法对各种不同微生物组的研究做出了重大贡献，例如，促进了食品微生物组研究的重大进展。从公共卫生的角度来看，这些元组学方法为病原体检测、暴发调查、AMR测定、食品真实性和来源追踪等方面提供了见解。  

5.1.1 病原体检测和暴发调查

元组学方法是有优势的，因为它们无需在鉴定和表征假定的病原体之前对样本中的病原体进行培养和富集。它们还能够揭示未培养和难以培养的微生物的存在，这可能有助于监测、来源归因、风险评估和流行病学分析，弥补传统方法的不足。宏遗传学和宏基因组学方法都能够检测和鉴定各种食品中的病原体，包括蔬菜、肉类和乳制品。宏转录组学，虽然由于RNA分离的挑战而没有广泛应用，但在鉴定食品中的活病原体方面也有很大的潜力。 宏基因组学方法的使用可以延伸到食物链之外，德国STEC(产志贺毒素大肠杆菌)O104:H4暴发期间收集的患者粪便样本的宏基因组测序有助于恢复暴发菌株的基因组。此外，当病毒病原体是暴发的原因时，宏基因组学很有用，或者在多菌株暴发的情况下，宏基因组学能够区分和表征多种菌株，从而比传统的基于培养的方法更快地区分它们。与宏遗传学相比，宏基因组学可能更适用于低生物量样品，因为它可以扩增目标，宏基因组学有助于对物种水平进行更敏感的表征，并进一步研究存在的微生物的功能潜力。 尽管这些元组学方法具有潜力，但它们目前尚未得到广泛应用。原因之一是缺乏统一的方法和标准化、经认可的工作流程/管道，无法一致地检测和表征引起暴发的病原体。然而，当宏基因组分析与进一步的定量分子分析相辅相成时，宏基因组分析的有效性可以得到增强，这突出了宏基因组分析在确定病原体污染或暴发事件方面的有效性。阻碍将元组学技术作为病原体常规筛查工具的一个重大技术挑战是，这些技术并不总是足够敏感。由于样本中的病原细胞数量较少，因此需要足够的测序深度，尤其是鸟枪法测序，因为样本中含有其他微生物或污染物的DNA(如动物、植物或人类DNA)。有了足够的测序深度，鸟枪法宏基因组学可以成为一种更快、更有价值的工具，比目前的传统工作流程提供更多的信息，允许将食品/环境暴发相关样本与临床样本联系起来。尽管各种食物基质的复杂性可能是一个挑战，但对于生物复杂性较低的基质(如食品生产中使用的水或一些最低限度加工食品)来说，这不是一个大问题。  

5.1.2 鉴定抗菌素耐药基因

在过去几十年中，AMR已被确定为严重的公共卫生威胁，因此，发布了更多用于从测序数据中检测AMR遗传决定因素的工具。虽然通常使用培养分离株的全基因组测序，但宏基因组测序在监测AMR方面显示出巨大潜力，因为宏基因组测序在量化猪群耐药性方面优于基于培养的方法。鸟枪法测序在监测从农场到屠宰场的环境中的AMR基因方面取得了成功。它也被用来了解抗菌药物使用和耐药性之间的关联，以及加工对耐药性和病毒组的影响。 与其他宏基因组学方法一样，应该考虑到测序深度和宿主DNA的存在，因为已发现它们会影响环境和食品样本中的耐药性分析。其他挑战包括难以将抗菌素耐药基因分配给它们的宿主物种或菌株，这可以通过使用长读长技术进行测序和参考耐药基因数据库的选择来解决，在该数据库中，来自相同参考序列的基因变体之间存在差异不同的数据库，重申对综合数据库和标准化工作流程的需求。值得注意的是，AMR数据并不总是与表型相关，因为这些基因可能没有被表达，或者生物信息学工具的选择可能导致假阳性或假阴性。从基因表达的角度来看，宏转录组学可能被用于补充分析。移动组(微生物组的所有可移动遗传元件)的分析也与耐药性分析相结合，以了解AMR基因和毒力因子通过水平基因转移的潜在传播。  

5.1.3 食品真实性

食品欺诈是一个全球性问题，会产生多种后果，包括可能的健康风险、经济损失和阻碍可持续发展的努力。宏条形码已被用于确定蜂蜜、中药、鱼类等的真实性和来源。基本概念是，与传统食品相关的微生物群与食品的地理来源和生产方式密切相关，因为微生物是原材料和环境的典型代表。尽管取得了一些成功，但将微生物组作为确定食物来源的手段仍存在挑战。这包括需要有一个包含预期食品微生物组组分的数据库，以及由于储存或加工条件而导致的微生物组潜在变化。与其他元组学应用类似，对参考数据库完整性和食品基质认证的准确性的依赖对于避免不准确的结论非常重要。Haiminen等人发现DNA和RNA鸟枪法测序都是用于食品认证和污染物检测的准确非靶向方法，Kamilari等人用互补代谢组学对PDO奶酪进行了表征，以确定产品来源的区分因素。    

5.1.4 其他公共卫生相关领域

除了食品行业，其他领域也发现了基于群落的微生物组分析方法的应用所带来的好处。基于群落的方法有助于增加对医疗环境和水系统中土著微生物群落和AMR模式的认识，这为更大的监测需求提供了证据。在医院环境中，元组学方法为病原体和非病原体之间的进入途径和关系提供了线索，并有助于进行环境监测以抗击医院获得性感染和AMR。同样，在辅以其他技术的情况下，鸟枪法宏基因组学可有效揭示饮用水分配系统中病原体相关物种的毒力因子和新型生物标志物的存在。此外，在国际范围内，飞机飞行产生的城市污水和废物被认为是经济上和道德上可接受的方法，可以利用宏基因组学对AMR进行全球持续监测和预测。    

5.2 食品行业应用

微生物群落存在于整个食物链中，了解其动态以及促进或阻碍其生长的条件将有助于食品安全和质量目的。使用元组学方法的研究研究了食品、食品相关环境和食品加工步骤，如图2所示，下文将详细阐述。  

图2 基于测序的元组学方法在食物链中的应用。宏遗传学、宏基因组学和宏转录组学已被用于研究食品微生物群落、食品加工步骤和食品相关环境。  

5.2. 1 食品:发酵和非发酵

基于群落的方法的主要应用之一是发酵食品的研究。以往的综述指出，大多数关于发酵食品的早期研究都采用宏遗传学来监测发酵过程中微生物的活动。近年来，越来越多的研究利用宏基因组学和宏转录组学来了解多种食品(如蔬菜、奶酪等)在发酵过程中的微生物群落多样性和微生物活动的变化。宏转录组分析揭示了蔬菜发酵过程中LAB基因表达和代谢特征的变化。同样，在奶酪中，通过宏转录组学揭示了微生物群落内的代谢相互作用和成熟过程中温度驱动的功能变化。使用宏基因组和宏转录组分析可检测发酵过程中的活性微生物以及发酵豆制品中负责生物胺生产的微生物。这种并行方法也有助于了解成熟过程中微生物群落的动态，揭示温度对微生物群落和基因表达的影响。这些是在不断增长的研究库中选择的研究示例，这些研究使用这些方法来研究发酵食品中的微生物群落。不出所料，有人提出，多种元组学方法通过对其微生物组的详细功能表征促进发酵食品的改进、高效和可持续生产。 虽然使用元组学方法研究非发酵食品的数量远低于发酵食品，但已经完成的研究突出了此类方法的巨大潜力。这些应用大多与食品相关环境或食品加工步骤的表征有关，下文将对此进行详细阐述。除了这些研究之外，还有一些很有前景的研究，涉及使用基于群落的方法来筛选腐败或病原微生物。然而，由于食品样本的复杂性和病原体丰度通常较低，迄今为止，人们发现食品的DNA或RNA直接测序比传统基于培养或扩增方法的敏感性低。还应注意的是，尽管短读长和长读长测序技术都显示出了将微生物准确分类到科和属水平的前景，但并非所有方法都能充分分类到病原体检测所需的种或菌株水平。这有时是一个重大限制，特别是在食品安全方面，仅在属水平上进行识别可能不足以了解存在的可能导致食品链上食品安全或质量问题的实际物种。对灵敏度和特定检测的需求以及其他挑战证明，这些基于群落的方法目前不适用于监管合规级别，但随着进一步发展，这将成为未来的标准。     5.2.2 食品相关环境 从农场到加工设施，食品相关环境一再被发现会对最终产品的微生物群产生积极或消极的影响。    

5.2.2.1  环境因素

微生物可以从几个不同的点进入食物链。这包括食物来源/衍生的农作物和动物，以及土壤、水、耕作系统、害虫和气候条件等环境因素。元组学方法发现，牧场系统、动物圈舍、空气中的灰尘、灌溉水等因素可以影响食品的微生物群多样性和组成。除了多样性和组成，用于表征耐药性的元组学方法表明，农场环境是AMR细菌和基因的潜在载体(这些细菌和基因源自灰尘和动物粪便)，有助于AMR传播和工人暴露。将动物粪便用作肥料(粪肥/废水)也会导致AMR细菌和基因在环境中传播，进而影响在土地上种植的作物或饲养的动物的微生物群。季节性是动物和植物环境中微生物群的另一个贡献因素。季节性影响在某些产品中很明显，如牛奶和牛肉，在这些产品中，宏遗传学和宏基因组学的使用揭示了最终产品微生物群的季节性变化。    

5.2.2.2 食品加工环境

元组学技术已被用于表征肉类、奶制品和酒精饮料等食品加工涉及的几种环境。利用元组学方法进行此类研究的一个关键观察结果是，在加工环境中存在一种持续存在的常驻微生物群，病有可能影响最终食品的质量和安全。最近的一篇综述强调了这一点，该综述使用高通量测序来表征加工环境和食品中发现的优势类群，总结了加工环境可以作为微生物转移到食品的储存库和来源的证据。这可能是有益的，也可能是有害的，例如，在发酵食品生产中具有明显的有益影响。在这方面，环境中的微生物对发酵蔬菜、葡萄酒和白酒的生产做出了积极贡献。相反，利用不同的元组学方法在各种乳制品、肉类和蔬菜加工设施的表面发现了腐败或病原微生物。例如，在奶酪和鲑鱼加工厂的下水道生物膜中发现了假单胞菌(Pseudomonas spp.)，在牛奶和肉类加工厂的表面发现了葡萄球菌(Staphylococcus)和耶尔森氏菌(Yersinia)等病原体。事实上，由宏遗传学确定的生物膜中微生物群落与环境因素的相关性已经被用来追踪随时间推移的持久性，表明细菌群落在肉类和鱼类加工厂中具有位置特异性。此外，可以通过元组学方法评估病原体与其他微生物的微生物共存以及复杂生态系统中的微生物相互作用，这可以确定有利于或阻止食源性病原体生长或生存的模式。这是通过16S rRNA测序来研究的，该测序检测了食品生产设施中李斯特菌(Listeria spp.)和微生物组之间的相互作用，并确定了作为明显主角或拮抗剂的物种，这些物种对加工厂内单核细胞增生性李斯特菌(L. monocytogenes)的存在产生影响。 处理可能是污染或微生物转移的潜在来源，微生物可以不知不觉地从表面转移到食品中。Moraxella spp.是一种主要的肉类腐败菌，在员工的手套上发现了这种细菌，并通过全长16S rRNA基因测序鉴定为整个猪肉加工厂的潜在污染源。同样，在高通量测序揭示了尸体中腐败相关细菌的来源及其在环境中的持久性之后，处理被确定为牛肉产品中腐败菌增殖的催化剂。    

5.2.3 食品加工步骤

利用元组学方法监测食品加工过程中食品微生物群落的变化，有助于理解加工过程对食品质量和安全的影响。这是通过两种方法进行研究的。一种方法涉及对整个食品加工链进行分析，从整个过程开始到结束采集样本，并使用元组学方法来追踪微生物群落动态的变化，这有助于制定缓解措施。这种全链方法通常涉及食品和环境样本的采样，并突出了可能发生污染或腐败的区域；例如，在肉类加工中，动物尸体或兽皮被确定为可能的污染源，并且发现在屠宰期间和屠宰后采取的措施是减少细菌负荷和AMR基因向肉类产品传播的关键。用类似的方法研究香肠生产表明，乳化步骤选择了革兰氏阳性腐败菌。其他的调查强调了乳制品加工过程中，储存、低温和设备对牛奶微生物群的影响，而在啤酒厂中，食品接触表面被认为是可能传播腐败细菌或基因的区域。 使用元组学方法时采用的另一种方法是聚焦过程，在该方法中，检测通常被认为是食品安全管理系统关键点的特定加工步骤。已经研究了热处理、冷藏、包装、清洁等过程，以了解这些工艺过程中的微生物动态，并确保其消除或减少细菌生长的有效性。宏遗传学研究热处理发现肉丸和奶酪中的细菌丰度和多样性减少，但它们也影响了最终产品的质量。同样，利用宏基因组学和宏转录组学监测奶酪的成熟过程，可以更好地理解由温度驱动的风味发展差异，而宏遗传学、蛋白质组学和辅助的理化和感官分析揭示了高压加工在提高鱼片质量和保质期方面的有效性，并为进一步研究优质标志物的鉴定提供依据。特别是在贮藏方面，宏遗传学和宏基因组分析表明，低温贮藏是加工链上的一个区域，它允许肉和乳制品中某些嗜冷腐败微生物的增殖和优势地位。为了了解储存温度对微生物群落的影响，已经在香肠和鱼类中使用宏遗传学结合感官评估或依赖培养的方法来监测微生物动态，这导致了模型的发展，以推断贮藏期间的腐败动态和细菌种类的关联。目前，气调包装(MAP)用于延长鲜肉、海鲜、水果、蔬菜等各种食品的保质期，但需要优化气体成分以保持产品的质量。在评估家禽的MAP时，Wang等人利用宏基因组学确定了与其他包装条件相比细菌群落的变化，Höll等人利用宏转录组学监测两种腐败菌对不同气体条件的调控反应。同样，通过宏遗传学、感官分析或代谢组学对低温MAP和真空包装的鱼片的保质期进行评估，以了解腐败菌随时间的动态变化。已经使用宏遗传学研究了清洁和消毒的效果，有证据表明，在奶牛场和养猪场清洁后细菌多样性和丰度发生了变化。类似地，基于RNA的16S rRNA测序表明，目前使用臭氧的清洁方法是有效的，并导致肉类加工厂中潜在活性微生物群发生变化。相比之下，由宏遗传学确定的鲑鱼加工厂的卫生设施被发现不达标，因为假单胞菌在传送带上的生物膜中持续存在。 最后，已发现基于测序的元组学方法是识别加工链中微生物的有效工具，常规实施有助于揭示影响微生物种群动态的因素。迄今为止进行的大量研究表明，利用元组学方法追踪食物链中的微生物群落具有很大的潜力。    

6 总结

1. 微生物是食品质量和安全的重要贡献者，它们存在于整个食物链中。 

2. 由于微生物存在于群落中，因此对其进行研究是很有价值的。元组学方法绕过了培养和分离微生物的需要，允许对微生物群落进行更广泛的表征。 

3. 宏遗传学和宏基因组学是两种基于测序的元组学方法，已被用于表征食品、食品相关环境和食品加工微生物群落。虽然只有少数研究使用了宏转录组学，但结果显示出其在评估食物链中的活微生物的动态方面具有潜力。 

4. 使用基于测序的元组学方法有望更好地表征食物链中的微生物群，并有助于更好地了解影响食品安全和质量的因素。然而，标准化的工作流程/管道对于允许数据共享和可比性以及在监管和行业层面的广泛采用是必要的。     

7 未来的问题 

1. 随着这些元组学方法越来越多地被用于揭示食品和与食品相关环境的微生物群，非常需要标准化的工作流程/管道来进行方法学和分析。 

2. 测序产生大量数据。这需要良好的数据管理实践和系统的元数据文件，以促进研究成果的数据共享。此外，用于分析生成数据的生物信息学专业知识目前对于从测序数据中得出准确和正确的解释至关重要。未来的努力将需要集中在精确的、自动化的分析工具上。 

3. 由于分析的大部分都需要参考现有的数据库，因此测序研究的结果只能与这些数据库一样好。目前的数据库主要来自人类微生物组研究，因为在该领域进行了更多研究，这可能会导致偏向与人类相关的微生物。食品和其他领域微生物组研究的不断增加应该纠正这种不平衡，以便更好地表征微生物组。

4. 分析方法的进一步发展要克服元组学方法的挑战，例如宿主DNA损耗和区分微生物群落中活微生物的能力，这样元组学方法将在食品加工链中的微生物表征方面得到更广泛的应用。

5. 从宏基因组数据来看，MAGs的恢复可以为更多的单菌株研究让路，这有助于更好地了解食品环境中的常驻微生物群以及导致食品发酵或变质的菌株。此外，利用宏转录组学或宏基因组学以及代谢组学等互补方法，增加对食品环境中微生物功能特性的研究，可以更深入地了解食物链过程中涉及的活性微生物和代谢途径。

6. ONT公司的便携式测序设备可以进行现场测序，这已被证明可用于临床暴发调查和环境采样。这些便携式设备能够快速检测食品生产或食品加工环境中的微生物污染物或病原体。虽然一些研究已经探索了这种可能性，但仍需要与其他测序技术和平台进行进一步比较以确定准确性和可比性。