小儿HIV 感染实验室诊断检测方法与治疗监测

本文刊载于《临床实验室》杂志2022年10月刊专题“临床微生物检验”-「实验室诊断技术导航」版块

作者：黄春燕  高兴辉  汤一苇  朱渝

单位：610041 四川大学华西第二医院感染科(黄春燕  朱渝)；赛沛（上海）商贸有限公司(高兴辉   汤一苇 )

【摘要】 

小儿HIV感染是全球面临的重大公共卫生问题，HIV患儿的及时及正确检测对提高患儿的疗效至关重要。目前我国的HIV患儿及时诊断和治疗监控存在很大的不足，在医疗资源有限的地区尤其突出。传统的HIV实验室检测方法已无法满足临床的实际需求，亟待发展新的检测技术。近年来随着分子生物学技术发展，涌现出一批分子检测产品。本文对小儿HIV感染的主要实验室检测方法进行回顾与总结。

儿童HIV感染者临床表现差异很大，特别是婴幼儿可能是无症状的，或者非特异性症状，很难从临床症状考虑到HIV感染。儿童HIV感染的症状还与成人不同，最常见的症状有：生长迟缓、营养不良、反复发作性口腔溃疡、频繁各类感染；症状性淋巴细胞间质性肺炎；进入临床4阶段出现各类严重或罕见感染；慢性单纯疱疹感染；念珠菌性食管炎；中枢神经系统弓形虫病；巨细胞病毒感染，出现在出生>1个月视网膜炎或巨细胞病毒感染影响其他器官；肺外隐球菌病；播散性地方性真菌病)，慢性隐孢子虫病，播散性非结核性分枝杆菌感染。

儿童期HIV感染的防治最重要是阻断母婴传播，积极进行母亲的感染治疗，科学喂养，以及出生后及时筛查和药物阻断是关键的措施。

细胞学检测方法  

CD4+ T淋巴细胞计数是判断小儿HIV感染的疾病进展、临床用药、疗效和预后的重要指标。CD4+T淋巴细胞亚群常用的检测方法为流式细胞技术 。在治疗前进行1次检测，启动治疗3个月后进行1次检测，治疗后2年以内每3～6个月检测1次（如果基线CD4+T淋巴细胞计数＜200～300/ul，建议每3个月检测1次；如果基线CD4+T淋巴细胞计数＞300/ul，建议每6个月检测1次）。正常的CD4细胞计数在500-1500个/µl之间。CD4计数为200个细胞/µl或更低，可诊断为艾滋病。

血清学检测方法  

1.抗体检测方法 ：一般情况下，HIV 1/2抗体检测(见表1)仍然是小儿HIV感染诊断的金标准 。

酶联免疫吸附试验：ELISA是国际上应用最早、发展最快、应用最广的一种HIV检测方法。快速检测试验操作简便，在较短时间（约10-30分钟）内可以得到实验结果，并且敏感性和特异性较好。这类试验可使用血液（包含血清、血浆和干血斑）、尿液样本，既可检测 HIV 抗体，也可联合检测 HIV 抗体抗原（同时检测血液中 HIV-1 p24 抗原和 HIV-1/2 抗体）。

免疫层析试验：有效试验的质控带必须显色。反应时间在 30 分钟以内。抗体抗原快速检测法是待检样本中的 HIV 抗体、HIV-1 p24 抗原分别与样本垫中的 HIV-1/HIV-2 抗原、HIV-1 p24 单克隆抗体结合形成复合物，在毛细作用下沿着硝酸纤维膜向上移动，至相关抗体、抗原包被区域后，分别与之结合，组成有色复合物线条。质控线用于检测过程质量控制，肉眼判读检测结果 。

免疫印迹试验（Western Blot, WB） ：WB 可使用血清、血浆和干血斑样本，采用间接法检测样本中的抗 HIV-1/HIV-2 特异性抗体。

2.抗原检测方法：HIV主要核心蛋白（p24）出现于HIV-1感染的早期，一般用于HIV-1感染窗口期、HIV-1抗体不确定或HIV-1阳性母亲所生婴儿的鉴别诊断。全血、血清、血浆、病毒培养上清液以及血液制品原料样本均可用于HIV-1 P24抗原检测。目前检测HIV-1 P24抗原最常用的方法是ELISA法、酶联荧光分析法、电化学发光法等。其中ELISA法最成熟，应用最广泛。

3.抗体和抗原共同检测方法：HIV 抗原和抗体共同检测方法是通过重组抗原检测IgG和IgM，同时通过单克隆抗体检测p24 抗原。p24抗原检测可以在HIV-1感染血清转化前检测出HIV感染，能在一定程度上缩短HIV 感染后检测的窗口期。目前主要的HIV 抗原和抗体共同检测试剂盒有Bio-Rad GS HIV combo Ag/Ab 酶联免疫吸附测定和Abbott Architect HIV Ag/Ab combo化学发光试验等，这都属于第四代免疫试验，都能检测lgG、lgM抗体和p24抗原，主要用于筛查。

核酸检测  

HIV-1核酸检测是是一种儿童艾滋病诊断中使用最广泛的检测方法。在新生儿及小龄儿童中，母体HIV抗体可以在婴儿体内存在一定时间，这时采用病毒核酸检测则可以避免假阳性。HIV-1核酸检测是目前最敏感的HIV检测方法，可分成HIV-1 DNA和HIV-1 RNA 检测。

1.HIV-1 DNA定性检测：目前被广泛用作诊断婴儿HIV感染标准方法，也是通常作为研究中与其他检测方法比对的方法 [6]。由于抗逆转录病毒疗法不能治愈HIV感染，且HIV前病毒DNA是整合在细胞基因组中，因此，HIV-1 DNA会一直存在HIV感染儿童的外周血单个核细胞和淋巴组织。HIV-1 DNA定性方法能够检测到HIV-1 DNA，而HIV-1 RNA方法检测不到病毒复制。因此HIV-1 DNA定性检测也是诊断儿童HIV感染最敏感的方法之一 。过去Roche Amplicor Qualitative DNA assay作为婴儿和幼儿HIV感染诊断HIV-1的金标准，在干血斑中灵敏度可达到96.7%，在大于400 copies/ml的样本中灵敏度是98.8% 。

2.HIV-1 RNA 定性检测：HIV-1 RNA定性检测试剂盒可以检测干血斑、血浆、血清和全血中的HIV病毒RNA，主要用于HIV急性感染、早期婴儿感染和确证试验结果不确定者的排查。目前HIV-1 RNA定性检测是诊断≤18月龄儿童HIV-1感染的首选方法。

Hologic Aptima HIV-1 RNA Qualitative Assay 是FDA批准的唯一用于诊断急性HIV-1感染的核酸扩增检测，它是利用转录介导的扩增，并用0.5 ml血浆检测到的30 copies/mL HIV-1 RNA  。在一项使用394份来自HIV感染和未感染婴儿和儿童的血浆样本（0.2至0.5 ml）研究中发现Aptima HIV-1 RNA Qualitative Assay的灵敏度为99.5%，特异度为99.5%，重复性为100%，检出限为14 copies/ml，说明该方法适用于HIV-1的早期婴儿诊断 。

Abbott Realtime HIV-1 Qualitative Assay 是一种体外实时PCR检测方法，用于检测人体血浆和干血斑中的HIV-1核酸，可用于儿童和成人患者的HIV-1感染诊断，适用于资源有限的环境中。研究表明，Abbott Realtime HIV-1 Qualitative Assay也是及时诊断婴儿艾滋病感染的一种实用选择。同时该试剂盒在检测HIV-1阳性母亲所生的6周龄至18个月龄婴儿的样本（干血斑和血浆）的检测结果与Roche Amplicor HIV-1 DNA Test version 1.5一致，其中干血斑的一致性为95.5%，血浆的一致性为97.8% ，这说明该方法也适用于儿童HIV-1感染的诊断。

3.HIV RNA 定量检测：HIV RNA定量检测是指检查标本中的HIV病毒载量，主要用于儿童和成人HIV早期感染的诊断、病程评估及抗病毒治疗效果监测。Cepheid Xpert HIV-1 Viral Load Assay 是基于GeneXpert系统的一种简单化、全自动化、一次性定量分析HIV定量检测试剂盒。研究发现Xpert HIV-1 VL和Abbott检测结果之间存在高度相关性，总体平均差异为0.34 log10 copies/ml，且两种方法对HIV-1 RNA的检测率一致为97.1%，灵敏度为99.6%，这说明Xpert HIV-1 VL与HIV-1 RNA传统实验室检测方法显示高度一致性和准确性。由于 Xpert HIV-1 VL检测属于分子POCT，在南非资源有限的地区，可用于常规监测HIV患者的病毒载量，评估治疗效果 。总体而言， Xpert HIV-1 VL表现良好。

Cepheid Xpert HIV-1 Viral Load XC Assay 是下一代HIV定量检测产品，检测LTR和POL两个靶标，检测样本为1ml EDTA血浆，检测时间为91分钟。Xpert HIV-1 VL XC定量样本与Abbott检验结果具有高度一致性，且整合酶抗性相关的突变对结果没有影响。Xpert HIV-1 VL XC与Abbott检测在所有检测的HIV-1亚型中显示出良好的相关性，且在治疗相关病毒载量范围内，灵敏度、线性和准确性较高。Xpert HIV-1 VL XC检测准确度高，是儿童HIV-1感染患者病毒载量监测的一种安全、可靠和快速的选择。

Roche Cobas HIV-1 quantitative Assay是基于Cobas 6800/8800系统的HIV-1 定量检测试剂盒，检测靶标是gag基因和LTR区域，需要至少0.65 ml样本，可报告20至10000000 copies/ml定量结果。在Cobas检测结果在接近临床相关临界值应更加谨慎地解释 。同时CobasHIV-1 quantitative Assay与CAP/CTM HIV-1 quantitative检测结果也有很好的相关性 。

Abbott Realtime HIV-1 Assay是基于自动化m2000系统的HIV-1 定量检测试剂盒，该试剂盒是以Pol整合酶区域为靶点，可用0.2、0.5、0.6或1.0 ml样本，其线性范围为40至10000000 copies/ml。根据研究发现，Real Time HIV-1 Quant Dx Assay 与Roche COBAS Amplicor HIV-1 Monitor Test有很强相关性，两者一致性为94.4%，其Abbott 的灵敏度比Roche更高，可考虑在资源有限的环境中进行HIV-1病毒载 量检测。

Hologic Aptima HIV-1 Quant Dx Assay是基于全自动Panther系统的HIV-1 定量检测试剂盒，其靶标是针对Pol和LTR区域，所需的最小样本量为0.7 ml样本，可报告的定量结果范围为30至10000000 copies/ml。在一项研究中发现Aptima HIV-1 Quant Dx Assay 95%的检测限为17.6 IU/ml，其特异性为99.83%。其与RocheCOBASAmpliprep/COBASTaqManHIV-1testv2.0在50和100copies/ml时，两者标准偏差和变异系数分别为0.14logcopies/ml（8.67%CV）和0.18logcopies/mL（9.91%CV），说明Aptima法是一种灵敏、特异、准确性的检测HIV-1病毒载量的方法。

耐药性检测  

高效抗逆转录病毒治疗的应用有效地控制了艾滋病患者的病情，延长了患者的生命，大大地降低了HIV相关的发病率和死亡率。但是HIV耐药性的出现却极大地限制了抗病毒治疗的效果。选择一个能最大限度地抑制HIV-1复制的方案已成为一个极具挑战性的任务。接受过抗病毒治疗的病人，不但可能对使用的药物产生耐药，而且对其他药物亦会产生潜在的交叉耐药，目前HIV耐药性检测方法主要有2种：表型耐药检测和基因型耐药检测。

1.表型耐药检测：表型耐药检测是通过体外药敏分析方法检测细胞培养中抗逆转录病毒敏感性，其敏感性通常用抑制50% HIV-1复制的抗逆转录病毒浓度（IC50）表达。目前表型耐药检测主要是用重组病毒方式进行，它通过将PCR扩增的患者病毒基因片段插入野生型病毒载体中而创建重组病毒方式进行表型耐药检测。该方法特点是成本和周转时间长，表型耐药检测方法主要用于药物开发、耐药性研究或复杂的临床病例。能够直接测量每种抑制剂的耐药水平或敏感性，而无需事先了解HIV-1毒株的突变。因此，表型耐药检测可为儿童HIV-1感染患者，尤其是接触抗病毒药物的患者提供药物使用的精确指导。

2.基因型耐药检测：基因型耐药检测基于分子生物学方法，通过DNA测序检测HIV-1靶基因中的特定耐药性相关突变，在线利用数据库进行结果解释，操作简单，所用时间短，容易执行和低成本，比表型耐药更常用。但当涉及到具有异常突变或复杂突变组合模式的序列时，基因型分析可能很难解释耐药水平。目前常用基因型耐药检测方法就是Sanger测序法和下一代测序法 。

3.Sanger测序法：Sanger测序法是通过DNA测序检测蛋白酶、逆转录酶和/或整合酶区域来识别已建立的具有临床意义的耐药基因突变，该方法是从血浆RNA逆转录的cDNA直接扩增的PCR产物进行的。由于个体中的病毒群通常是异质的，因此在Sanger序列电泳图的给定位置通常存在一个以上的核苷酸。测序的系统分析和距离测量可用于检测采集点可能的实验室污染或样本标记错误 。一般Sanger检测下限约为20%，但点突变分析和下一代测序技术通常都能检测到远低于20%阈值的耐药变体。随着测序技术不断深入各级实验室，许多分子生物实验室具备sanger测序的条件，其价格合理，且可用于自建方法对比公共序列库进行分析，该方法已经作为HIV-1耐药基因检测的主要技术平台和金标准，在临床和科研中均已被采用 。

下一代测序

下一代测序(Next Generation Sequence, NGS)检测通量高，可精确检测到只发生在1%的HIV-1毒株中的耐药性突变，极大程度提高了检测的灵敏度。几项研究表明，基于NGS的HIV耐药检测在20%检测阈值时与Sanger测序高度一致。因此，利用潜在的改进效率，增加可扩展性、降低成本和提高灵敏度，许多实验室正在转向用NGS检测HIV耐药性。随着NGS技术变得更具成本效益，在实验室方案、数据处理和报告的标准化是很有必要的。尽管NGS有可能潜在地提高低于20%阈值耐药突变的检测能力[35]，但这种敏感性增加的临床相关性尚不清楚。近年来NGS技术已出现多种平台，其成本也已逐渐降低，但对于低收人国家来说仍难以负担。此外，该技术前期手工操作步骤多，上机收集的数据量大，目前仍缺乏简单便捷的生物信息学分析流程。因此，NGS尚不能在各实验室广泛开展应用于HIV-1耐药检测分析 [41, 42]。

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题图 | veer.com

排版 | 张宁

审校 | 方研

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