精准前沿丨cfDNA甲基化组高效区分原发和转移性前列腺癌

本期《精准前沿》栏目分享厦门大学吉国力教授团队和多伦多大学玛格丽特公主癌症中心何厚胜教授团队等发表于Nature Communication（IF=17.694）上的一篇研究[1]，研究利用cfDNA免疫沉淀结合新一代测序（cfMeDIP-seq），分别对来自4个研究队列中60例原发性前列腺癌和175例转移性前列腺癌患者cfDNA甲基化组进行分析，cfDNA甲基化可以高精度地区分转移性和原发样本，表现出了强大的疾病监测和预测的微创策略潜力。

研究背景

前列腺癌（PCa，Prostate cancer）是男性第二大常见恶性肿瘤，也是全球癌症相关死亡的第三大常见原因。虽然大多数原发前列腺癌可以治愈，但转移性患者的5年生存率低至30%。雄激素阻断治疗（ADT，Androgen deprivation therapy）是晚期或转移性疾病患者的标准护理。然而，尽管这种治疗方式最初有效，但是大部分患者很快发展为去势抵抗性前列腺癌（mCRPC，metastatic castration-resistant prostate cancer ），最终导致死亡。更有效的第二代雄激素信号抑制剂（ASI，androgen signaling inhibitors）的开发和应用能够为CRPC患者提供额外的生存好处，并越来越多地应用于晚期疾病的早期治疗，然而，最终还是会发生耐药。因此，迫切需要提高对mCRPC的认识和治疗。

mCRPC病变的活检具有挑战性，液体活检中循环肿瘤DNA（ctDNA）的分析已显示出一种有潜力的微侵入及精准的疾病监测工具。ctDNA的定量可以提供肿瘤负荷、转移和治疗反应的信息。值得注意的是，在mCRPC中，ctDNA已被证明可以反映肿瘤或转移性病变的基因组图谱，而甲基化状态等表观遗传特征可以反映肿瘤负荷和亚型。尽管有这些优势，在大规模的临床队列中仍缺乏mCRPC的全基因组cfDNA甲基化组谱。本研究采用cfDNA免疫沉淀结合下一代测序技术（cfMeDIP-seq），为分析cfDNA甲基化组提供了一种有效的方法。该研究分析了来自原发和转移性前列腺癌患者的60和175个血浆DNA甲基化组，捕获反映异质疾病生物学的变化。

研究设计

本研究为了深入地了解前列腺癌进展过程中cfDNA甲基化谱的变化，共收集了133份血浆样本，其中来自原发性和mCRPC患者的血浆样本分别为30份和103份。样本收集来自4个研究队列（原发性肿瘤患者来自CPC-Gene，转移性前列腺癌来自VPC、Barrier、WCDT）。将所有血浆样本中的甲基化DNA片段沉淀并进行配对末端DNA测序，部分CPC和WCDT队列具有多组学特征，配对的组织样本的测序数据可供使用。

研究结果

1.  原发性和转移性前列腺癌血浆DNA甲基化组的全基因组分析

对纳入的四个队列的30份原发性和103份mCRPC患者的血浆样本（图1A）进行cfMeDIP-seq分析，部分CPC和WCDT（mCRPC）队列具有多组学特征，配对的组织样本的测序数据可供使用，本研究进一步比较了血浆cfDNA甲基化组和之前的组织WGBS图谱，尽管测序技术存在差异，但在匹配的组织和cfDNA甲基化组之间观察到显著较高的相关性，匹配样本的皮尔森相关性中位数为0.37，而未匹配样本的皮尔森相关性中位数为−0.02（图1B–D）。

研究团队将分析扩展到所有队列，除了几个mCRPC样本（由于低到无法检测的ctDNA浓度）比较接近原发性癌症队列，整体甲基化模式能够区分原发和转移性样本（图1F）。先前的研究报告称，肿瘤来源的cfDNA与健康对照相比具有更短的长度，因此，本研究分析了四个队列的cfDNA片段大小，与原发样品相比，mCRPC样品的片段大小明显缩短（图 1G）。此外，在VPC队列的mCRPC样本中，片段大小与ctDNA的含量呈显著负相关（图 1H）。综上，这些结果表明转移灶中的ctDNA含量高于原发患者血液中的ctDNA含量，证实了之前的观察结果。先前的研究显示，患者样本中低于150bp的cfDNA片段显著富集，本研究数据的片段分布差异主要发生在150bp以上。因此推断甲基化ctDNA可能有不同的片段长度，实验方法的不同也可能导致这种差异。尽管如此，本研究结果表明cfMeDIP-seq可以定性地捕获片段长度差异，正如预期的那样，估计的片段大小分布与总体和无进展生存期显著相关（图 1I, J）。除了长度差异之外，癌症的cfDNA长度也有很多变化，事实上，当检查基因组中5 Mb的片段时，在转移组中观察到较高的标准偏差（图 1K）。片段长度和片段的差异可以进一步将本地样本与之前报道的健康对照（HC）cfMeDIP-seq配置文件区分开来。

图1. 采样示意图及血浆ctDNA甲基化组和片段组变化

2.  cfDNA 5mC谱显示转移性样本中广泛存在高甲基化

接下来，作者比较了CPC（原发性）和VPC（转移性）样本在匹配年龄情况下的cfDNA甲基化谱。在转移性肿瘤中观察到广泛的高甲基化，检测到这种差异甲基化区域（DMR）比正常的多7.6倍（图2A），与此同时先前报道的患者肿瘤中的低甲基化位点在转移性样本中显示出一致的低甲基化，证实了本研究分析的有效性。在VPC队列中，hyper-DMRs与ctDNA百分比显著正相关（图 2B），hypo-DMR没有显示出相关性（图 2C）。hyper- 和 hypo- DMRs在CpG 岛和shores中都有富集（图2D，2E）,在hyper- 和 hypo- DMRs中，重要转录因子（TF）的基因组占用表现出不同的富集模式，具体来说，在hyper-DMRs中富集最多的是转录抑制因子如SUZ12和EZH2，而在hypo-DMRs中，激活因子如TRIM24和CREB1富集最多，AR结合在两组DMRs中都很丰富，这与它在转录调控中的作用一致。

图2. cfMeDIP显示转移性样品中的高甲基化和低甲基化

3.  转移性样本中，着丝粒周围区域优先出现低甲基化

hyper-DMRs在类似启动子调控区富集，hypo-DMRs则没有（图2D,E）。在进一步的研究中，研究发现hypo-DMRs在重复区域特异性富集（图 2F）。为了更好地表征重复信号，本研究利用峰值策略来量化甲基化信号，在低甲基化峰中最丰富的重复类型是GAATGn，这是一种常见于端粒周围区域的经典卫星DNA（图 2G）。事实上，在着丝粒周围区域（注释着丝粒间隙周围的1Mb）内的差异甲基化峰，显示转移样本中的信号显著减少（图 2H–J）。此外，观察到良性组织和原发性肿瘤样本之间更明显的减少，这表明沿着PCa发展轨迹，端粒周围区域的甲基化逐渐丧失。

4.  NR3C1启动子甲基化水平与不同疾病结局相关

研究显示最高倍数变化的异常DMR位于编码糖皮质激素受体（GR）的基因NR3C1的启动子区（图 3A），该位点的甲基化水平显示与ctDNA百分比呈正相关（图 3B）。这种高倍数变化可能是由VPC队列中少数甲基化异常高的样本所驱动的。在最近的一项研究中检测了20例健康供体外周血白细胞分离的cfMeDIP-seq数据，在该位点未检测到信号，这表明GR-DMR上存在癌症特异性甲基化。从肿瘤基因组图谱（TCGA）、中国前列腺癌基因组和表观基因组图谱（CPGEA）和CPC队列中发现，原发肿瘤的GR-DMR甲基化水平越高，预后越差（图 3C, D），而在转移性队列中观察到相反的结果（图 3E）。GR基因表达水平与GR- DMR甲基化水平呈中度负相关，此外，除了CPGEA队列外，GR RNA的直接丰度没有显示出显著的生存相关性，这表明GR表达存在不同的调控机制。

图3. GR基因的差异甲基化与其在mCRPC中的改变相关

5.  cfDNA甲基化组可以高精度地区分转移性和原发样本

本研究创建了一个机器学习预测器，利用甲基化图谱来区分原发性和转移性肿瘤，为了增加样本量，对VPC队列（VPC- v）中额外的72个样本和健康研究OHS队列中原发肿瘤患者的30个样本进行了测序（图 4A），为了避免由于样本分类不平衡而造成的潜在偏差，本研究从各个队列中随机选择相同数量的原发和转移性样本（每组21个），将其用作训练集（图 4A）。然后对训练集进行特征选择：进行差异甲基化分析，选出前150个hyper- 和 hypo-DMR。

然后使用所选特征构建随机森林分类器，并在剩余数据集（测试集）上进行评估。该过程重复50次（图4A–C）。该预测器的AUC中位数为1，在测试数据集上具有极高的中位数精度0.989（图 4B）。所有的原发样本都被正确分类，在50次重复中，175个转移样本中只有10个被错误分类（图 4C）。值得注意的是，大多数ctDNA含量非常低的样本被正确分类，这高度说明了DNA甲基化在检测基因改变负荷较低样本时的敏感性（图 4C）。进一步将本研究的预测因子应用到之前研究中的20名健康对照组，从原发样本中观察到显著的概率分布差异，这表明使用cfMeDIP-seq数据有鉴别早期疾病和健康对照的潜力。

图4. 甲基化谱准确区分原发性和转移性样本

6.  cfDNA甲基化组可以预测大规模的遗传变异

从cfMeDIP-seq数据中获得的测序信息可以反映遗传变化并进行拷贝数改变（CNA）分析。与RNA-seq数据类似，基于富集的cfMeDIP数据在用于CNA分析时，由于甲基化水平的不同，其覆盖范围也不均匀。因此将RNA-seq的CNA推断工具用于cfMeDIP-seq数据分析，总体而言，VPC中的CNA覆盖率明显更高（图5A），这与转移样本中较高百分比的ctDNA的概念一致，事实上，在VPC队列中，CNA覆盖率与ctDNA百分比呈显著正相关（图 5B）。与之前的一项研究中检测的单个基因的CNA变化，观察到高度一致性（图 5C）。总的来说，这些结果导致CNA预测的总体准确性为0.86。当只考虑CNA发生变化区域时，精度为0.975。然后将分析扩展到VPC-V，预测的CNA覆盖率与%ctDNA之间中等相关。与VPC队列相比，可能是由于ctDNA百分比的范围较低，导致敏感性降低。尽管如此，总体准确率高达0.92 。

同样，错误分类区域的CNA度明显较低，而预测中性区域的正确比例较高，有助于提高整体预测精度。综上所述，cfMeDIP-seq数据可以可靠地用于预测样本CNA。

图5. 利用cfDNA甲基化组预测样本CNA

讨论

在这项研究中，使用从原发性和转移性前列腺癌患者血浆中分离的cfDNA提供了全基因组甲基化分析。cfDNA甲基化谱在早期非转移性前列腺癌的靶向分析中得到了广泛的研究，在基因组水平上对晚期转移性疾病的评估仍然很少。考虑到mCRPCs的高度异质性，mCRPC样本来自三个独立的研究。使用数据的一个子集建立了一个预测器来区分原发和转移性样本并可以推广到剩余的数据集，这种一致的和高敏感性的性能有潜在的临床应用价值。

本研究利用成本效益较高的cfMeDIP-seq方法揭示原发性及转移性前列腺癌甲基化组的差异，准确度较高。但也具有一定的局限性：1）研究队列未进行大规模样本验证；2）不同的分析方法也可能导致不同的观察结果，如虽然一项meta分析显示低甲基化与前列腺癌相关，但更广泛的泛癌分析发现了更多的高甲基化位点；3）血浆中cfDNA起源的复杂性可能进一步导致观测到的差异，如先前的研究显示，患者样本中低于150 bp的cfDNA片段显著富集，本研究数据的片段分布差异主要发生在150 bp以上。未来的工作需要更加完善区分原发性与转移性前列腺癌。

结语

本研究基于cfMeDIP-seq方法分析原发性及转移性前列腺癌的甲基化组谱差异，研究发现ctDNA甲基化组可以观察到转移样本中的整体高甲基化，以及着丝粒周围区域的低甲基化，以98.9%的预测准确度区分不同的疾病类型，揭示了cfDNA甲基化作为前列腺癌生物标志物的潜力。

END 

参考文献：

[1]  Chen S, Petricca J, Ye W, Guan J, Zeng Y, Cheng N, Gong L, Shen SY, Hua JT, Crumbaker M, Fraser M, Liu S, Bratman SV, van der Kwast T, Pugh T, Joshua AM, De Carvalho DD, Chi KN, Awadalla P, Ji G, Feng F, Wyatt AW, He HH. The cell-free DNA methylome captures distinctions between localized and metastatic prostate tumors. Nat Commun. 2022 Oct 29;13（1）:6467.

撰写丨XF

编辑、排版丨SX