论著 | 浙江省结核分枝杆菌耐药突变特征及其与基因型相关性分析

文章来源：中国防痨杂志，2022.44（11）：1126-1134

作者：吴坤阳1， 陆烨玮2， 张明五1， 朱业蕾1， 李相辰2， 潘军航1， 王晓萌1， 王蔚3， 江敏敏4， 彭小军2， 王炜欣2， 高俊顺2， 柳正卫1

作者单位：1浙江省疾病预防控制中心结核病预防控制所结核病实验室，杭州 310051；2杭州广科安德生物科技有限公司生物信息部，杭州 311215；3嘉兴市第一医院检验科，嘉兴 314001；4嘉善县第一人民医院检验科，嘉兴 314199

通信作者：柳正卫

基金资助：浙江省医药卫生科技计划项目(2020keyan512)    

doi: 10.19982/j.issn.1000-6621.20220224

摘要

目的：评价全基因组测序(whole-genome sequencing，WGS)对浙江省结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)耐药相关基因突变特征及其与基因型相关性的耐药分析和检测效能。

方法:对2018—2019年浙江省第五次结核病耐药监测项目收集的808株MTB菌株进行14种抗结核药物的WGS分析。鉴定菌株的基因型及耐药相关基因突变，并对二者相关性，以及WGS检测异烟肼的药物敏感性试验(简称“药敏试验”)结果与表型药敏试验结果的一致性进行分析。

结果:808株MTB菌株中，153株对11种抗结核药物(异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、链霉素、氟喹诺酮类、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、乙硫异烟胺、对氨基水杨酸)发生了耐药相关基因突变，总突变率为18.9%。主要耐药突变类型分别为katG-315-S/T[异烟肼，60.0%(45/75)]、rpoB-450-S/L[利福平，57.1%(16/28)]、embB-306-M/V[乙胺丁醇，43.8%(7/16)]、rpsL-43-K/R[链霉素，65.5%(36/55)]、gyrA-94-D/G[氟喹诺酮类，36.6%(15/41)]、rrs-1402-C/A(阿米卡星，3/3)、rrs-1402-C/A(卡那霉素，3/4)、rrs-1402-C/A(卷曲霉素，3/3)、inhA-15-C/T[乙硫异烟胺，65.0%(13/20)]、thyA-75-H/N(对氨基水杨酸，7/8)。rpsL基因和katG-315位点在北京基因型中的耐药突变率[均为6.8%(40/586)]均明显高于二者在非北京基因型中的突变率[0.0%(0/222)和3.2%(7/222)]，差异均有统计学意义(χ2=15.943，P=0.000;χ2=3.964，P=0.046)。WGS耐药性分析对于异烟肼的检测敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、一致率和Kappa值分别为87.5%(49/56)、98.0%(680/694)、77.8%(49/63)、99.0%(680/687)、97.2%(729/750)和0.808。

结论:浙江省MTB菌株对11种抗结核药物耐药相关基因突变以katG、rpoB、embB、pncA、rpsL、gyrA、rrs、thyA、inhA基因上的突变为主，其中rpsL基因、katG-315和rpsL-43位点突变与北京基因型相关。WGS耐药性分析对于异烟肼具有全面的耐药检测性能，但对个别基因突变位点的检测性能较弱。

结核病的耐药问题依然严峻，尤其是耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)对结核病防控构成严重威胁。据世界卫生组织统计，2020年71%的病原学确诊肺结核患者接受了利福平耐药检测，发现了13.2万例耐多药或利福平耐药结核病患者(multidrug/rifampicin-resistant tuberculosis， MDR/RR-TB)和2.6万例准广泛耐药或广泛耐药结核病患者(pre-extensively or extensively drug-resistant tuberculosis， pre-XDR/XDR-TB)。

2013—2014年浙江省开展的第四次结核病耐药监测显示，浙江省结核病初治耐药率和耐多药率均低于全国水平，但仍高于全球平均水平。全基因组测序(whole-genome sequencing，WGS)技术目前已广泛应用于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)的研究当中，该技术既可以克服传统表型药物敏感性试验(简称“药敏试验”)及其他分子药敏试验检测的局限性，也可以用于耐药性分析和基因型鉴定。故笔者运用WGS技术对2018—2019年浙江省第五次结核病耐药监测时收集的MTB菌株耐药相关基因突变及其与基因型的相关性进行分析，以评估WGS药敏试验与表型药敏试验检测结果的一致性，并了解浙江省目前结核病耐药现状，为本地区耐药结核病的早诊断和早治疗提供科学依据，探索WGS替代传统表型药敏试验进行耐药监测工作的可能性。

材料和方法

一、菌株来源

2018—2019年，浙江省参照世界卫生组织《结核病药物耐药性监测指南》的方法，在浙江省第四次耐药监测的原有30个耐药监测点开展了第五次结核病耐药监测。按监测指南要求，对纳入调查的996例涂阳肺结核患者痰液标本进行细菌分离培养，共获得996株分枝杆菌菌株，剔除47株污染菌、33株未生长菌株、81株非结核分枝杆菌，最终835株MTB菌株用于研究分析。MTB标准株H37Rv作为监测菌株由中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室提供。

二、研究方法

1.菌株复苏培养:将耐药监测分离保存的菌株冻存管自然解冻后，吸取0.1～0.15ml菌液均匀接种于改良罗氏培养基上，每株菌株接种于2支培养管，置于(36±1)℃恒温培养箱中孵育复苏，具体操作参考《结核病实验室检验规程》。

2.表型药敏试验:将复苏后的菌株进行比例法固体药敏试验。取培养基上生长1～2周的菌落，制备成10-2mg/ml和10-4mg/ml菌悬液，各取0.01ml分别均匀接种至对照培养基和药敏培养基表面。接种完成后，将培养基置于(36±1)℃恒温培养箱中培养4周后报告结果。若受试菌株耐药百分比＞1%，则判断为耐药。本研究由于只有异烟肼检测到的耐药菌株数量较多，且异烟肼可以较为准确地评估WGS耐药性分析方法的性能，故本研究只使用异烟肼药敏罗氏培养基检测菌株的异烟肼表型药敏，具体操作和耐药百分比计算参照《结核病实验室检验规程》进行。

3.WGS:转种的菌落初生长至2周时，刮取培养基斜面2环菌放于含有300μl去离子水的1.5ml离心管中，80℃灭活30min。委托杭州广科安德生物科技有限公司对MTB分离菌株进行测序，利用高通量二代Illumina测序技术平台，构建DNA文库，完成PE150双端测序。

4.测序菌株质控及筛选:首先，使用fastp软件(https://github.com/OpenGene/fastp)去除原始测序数据中的接头序列，并进行低质量碱基的过滤处理。接下来，将处理后得到的高质量序列数据输入Kraken软件(http://ccb.jhu.edu/software/kraken/)进行物种鉴定，去除鉴定结果为其他物种或者鉴定到MTB比例过低(＜80%)的污染样本。最后，使用bwa软件(http://bio-bwa.sourceforge.net/)将剩余样本的测序数据与H37Rv标准株基因组(NC_000962.2)序列进行比对。筛选出平均测序深度＞20X、基因组覆盖度＞95%的满足分析要求的808株样本测序数据进行后续的WGS数据分析。

5.WGS数据分析:将808株测序样本数据输入至TB-Profiler软件的本地版本(https://github.com/jodyphelan/TBProfiler)，以鉴定突变位点基因型，并检测其对14种抗结核药物(包括异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、链霉素、氟喹诺酮类、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、乙硫异烟胺、对氨基水杨酸、利奈唑胺、贝达喹啉、氯法齐明)的耐药谱。使用TB-Profiler软件检测各菌株相较于H37Rv标准株基因组(NC_000962.2)的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism， SNP)，将检测到的SNP与已知的基因型特异性SNP比对获得菌株的基因型及其亚型，再与已知的耐药基因突变数据库比对获得菌株的耐药突变谱。以是否发生耐药相关突变作为判断药物敏感性的标准。

三、统计学处理

利用R 4.0.5软件进行数据的统计分析。以α=0.05为检验水准，通过χ2检验或矫正χ2检验分析不同药物主要突变类型的发生频率在不同基因型间(北京基因型和非北京基因型)的差异是否有统计学意义。为进一步了解WGS与表型药敏试验结果的一致性，本研究对WGS药敏试验结果中耐药菌株数较多的异烟肼结果进行了表型药敏试验检测结果的比对分析，以敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、一致率和Kappa值为指标计算WGS技术的耐药预测效能。其中，Kappa值≥0.75为一致性很好，0.40≤Kappa值＜0.75为一致性较好，Kappa值＜0.40为一致性较差。平均测序深度为平均每份样本的有效测序数据中覆盖到该位点的测序reads数，平均测序深度越深表明该突变位点的检测结果越可靠，一般要求＞20;平均突变频率(%)为检测到该突变的reads数与覆盖到该位点的总reads数的比例，鉴于MTB的基因组是单倍型，其固定下来的耐药突变频率一般＞90%，故较低的突变频率可反映异质性耐药的情况及耐药突变在基因组上进行固定的过程。

结果

一、MTB菌株耐药突变特征

808株MTB菌株的WGS药敏试验结果显示，153株发生了除利奈唑胺、贝达喹啉、氯法齐明以外的11种抗结核药物耐药相关基因突变，总突变率为18.9%;其中，MDR-MTB菌株占2.1%(17/808)，pre-XDR-MTB菌株占0.9%(7/808)。11种发生耐药相关基因突变的药物中，对异烟肼的耐药率最高，达到9.3%;其次是链霉素和氟喹诺酮类，分别为6.8%和5.1%;而对其他药物的耐药率均在5%以下。具体见表1、2。

二、MTB菌株对一线抗结核药物的耐药相关基因突变特征(表1，2)

1.异烟肼耐药相关基因突变特征:75株异烟肼耐药菌株中，不同耐药相关基因的突变频率分布为katG(78.7%， 59/75)、inhA(22.7%，17/75)、ahpC启动子区(6.7%，5/75)。耐药基因中共产生21种突变类型，其中最主要的突变类型为katG-315-S/T;此外，发现6株(8.0%，6/75)异烟肼耐药菌株存在≥2个位点联合突变，以katG联合inhA或ahpC启动子区突变居多。

2.利福平耐药相关基因突变特征:28株利福平耐药菌株中，全部在利福平耐药相关rpoB基因上发生耐药突变，其中2株同时在rpoC基因上发生耐药突变。在rpoB基因上共发现9种突变类型，其中92.9%(26/28)的突变发生在rpoB基因耐药决定区(rifampicin-resistance determining region，RRDR)，最主要的突变类型为rpoB-450-S/L(57.1%)。另外发现有5株(17.9%，5/28)利福平耐药菌株存在≥2个位点的联合突变;其中rpoB基因联合rpoC基因发生耐药突变的2株菌株的突变类型分别是rpoB-450-S/L+rpoC-527-L/V和rpoB-170-V/F+rpoC-527-L/V。

3.乙胺丁醇耐药相关基因突变特征:16株乙胺丁醇耐药菌株中，发现embB(93.8%，15/16)和embA启动子区(12.5%，2/16)发生耐药突变。其中embB基因306、354、423、406、504和1024位点分别占56.3%(9/16)、12.5%(2/16)、6.3%(1/16)、6.3%(1/16)、6.3%(1/16)和6.3%(1/16)，embA启动子区中-16和-12位点分别占6.3%(1/16)和6.3%(1/16)。耐药基因中共发生9种突变类型，其中最主要的突变类型为embB-306-M/V(43.8%)，且其中有1株(6.3%)存在位点联合突变，为embB基因和embA启动子区联合突变，突变类型是embB-406-G/A+embA启动子-12-C/T。

4.吡嗪酰胺耐药相关基因突变特征:12株吡嗪酰胺耐药菌株中，耐药突变均发生在pncA基因上，且突变位点分散，几乎遍布整个编码区域。突变类型共有12种，未发现主要突变类型。

5.链霉素耐药相关基因突变特征:55株链霉素耐药菌株中，耐药突变发生在rpsL、rrs和gid基因，共产生11种突变类型，主要突变类型为rpsL-43-K/R(65.5%)，此外发现1株(1.8%)存在rrs基因和gid基因位点联合突变。

三、对二线抗结核药物产生的耐药相关基因突变特征(表1，2)

1.氟喹诺酮类耐药相关基因突变特征:41株耐药菌株中，耐药突变主要在gyrA和gyrB基因上，以gyrA基因为主(90.2%，37/41)，主要突变类型为gyrA-94-D/G(36.6%)和gyrA-90-A/V(29.3%)。

2.阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素耐药相关基因突变特征:三者耐药菌株数分别为3、4和3株，共计4株菌株。其中有3株对3种药物同时耐药，另有1株仅对卡那霉素耐药，分别在rrs基因和eis启动子区发现了耐药突变，突变类型以rrs-1402-C/A和rrs-1484-G/T为主;其中有2株(2/4)发生rrs-1402-C/A和rrs-1484-G/T联合突变，1株(1/4)卡那霉素单独耐药菌株上发现eis启动子区耐药突变eis启动子-10-G/A。

3.乙硫异烟胺耐药相关基因突变特征:20株乙硫异烟胺耐药菌株中，在inhA和ethA基因上发现主要的突变类型为inhA-15-C/T。

4.对氨基水杨酸耐药相关基因突变特征:8株对氨基水杨酸耐药菌株中，耐药相关基因为thyA和folC，发现主要突变类型为thyA-75-H/N和folC-150-S/G。

表1 808株结核分枝杆菌对11种抗结核药物的耐药基因突变情况

注 “耐药率”为该药品耐药菌株在全部808株结核分枝杆菌菌株中所占比例;“突变率”为该基因发生突变的菌株在对应药品全部耐药菌株中所占比例

表2 808株结核分枝杆菌对11种抗结核药物的耐药基因突变类型构成情况

注 表中仅列出频率≥5%且排名前3位的药物突变类型数量;“其他”为该种药品其他突变类型的总和。因吡嗪酰胺耐药突变类型非常分散,无主要突变类型,故不予展示;平均测序深度=平均每个样本的有效测序数据中覆盖到该位点的测序reads数;平均突变频率(%)=检测到该突变的reads数/覆盖到该位点的总reads数×100%

四、遗传背景与耐药突变的相关性分析

808株MTB菌株中，586株(72.5%)为北京基因型菌株，222株(27.5%)为非北京基因型菌株。受限于本研究中耐药菌株数较少的情况，仅对突变率较高的4种耐药基因katG、rpsL、gyrA和rpoB的突变情况及突变率较高的4种耐药基因位点katG-315、rpsL-43、gyrA-94、rpoB-450在不同基因型中的分布进行相关性分析。结果显示，链霉素耐药相关rpsL基因突变仅在北京基因型中发现，与在非北京基因型中的分布差异有统计学意义(表3)。同时，katG-315位点和rpsL-43位点在北京基因型中的突变率均明显高于非北京基因型(表4)。

表3 808株结核分枝杆菌4种耐药基因突变在不同基因型中的分布情况

注 括号外数值为“菌株株数”,括号内数值为“突变率(%)”

表4 808株结核分枝杆菌4种耐药基因突变位点在不同基因型中的分布情况

注 括号外数值为“菌株株数”,括号内数值为“突变率(%)”

五、WGS药敏试验与表型药敏试验检测结果一致性分析

对808株菌株进行异烟肼表型药敏试验检测，共获得750株菌株的表型药敏结果，检出56株(7.5%)异烟肼耐药菌株。以表型药敏试验结果为参照标准，WGS对异烟肼的耐药性检测敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、一致率和Kappa值分别为87.5%(49/56)、98.0%(680/694)、77.8%(49/63)、99.0%(680/687)、97.2%(729/750)和0.808(表5)。

表5 全基因组测序以表型药敏试验结果为参照标准对异烟肼耐药性的检测效能

注 敏感度=分子药敏预测正确耐药数/表型药敏耐药数×100%;特异度=分子药敏预测正确敏感数/表型药敏敏感数×100%;阳性预测值=分子药敏预测正确耐药数/分子药敏预测总耐药数×100%;阴性预测值=分子药敏预测正确敏感数/分子药敏预测总敏感数×100%;一致率=分子药敏预测正确数/菌株总数×100%;Kappa值=(观察符合率-机遇符合率)/(100%-机遇符合率)

在21株WGS与表型药敏试验结果不一致的菌株中，katG-315-S/T和ahpC启动子-48-G/A是导致结果不一致的主要位点，分别有5株和3株，并且发现2株存在位点联合突变，分别为inhA-15-C/T+katG-110-A/V和ahpC启动子-48-G/A+katG-607-E/K。同时，在结果不一致的菌株中，有7株菌株是WGS未能检出的野生型耐药菌株(表6)。

表6 21株两种药敏试验方法检测结果不一致菌株的基因突变类型分析

注 “比例”为该突变位点结果不一致菌株在21株结果不一致菌株中所占比例;“不一致率”为该突变位点结果不一致菌株在所有发生该突变的菌株中所占比例(仅针对突变菌株数≥3株的情况进行计算)

讨论

WGS技术预测MTB菌株对于不同抗结核药物耐药性的性能已得到了相关研究的验证，同时也获得了世界卫生组织的认可和推荐。该方法可以克服目前临床分子检测方法存在的不足，如GeneXpert MTB/RIF和GenoType MTBDRplus等方法只能检测到部分抗结核药物及其中的部分耐药基因突变位点，对指导结核病临床用药和控制耐药结核病意义重大。浙江省第四次结核病耐药监测结果表明本省耐药问题依然严峻，故本研究针对浙江省第五次结核病耐药监测的MTB菌株，使用WGS技术揭示了目前浙江省主要的耐药突变类型及其与菌株基因型之间的相关性，获得了本地区比较全面的耐药突变特征。

本研究中发现的利福平、乙胺丁醇、氟喹诺酮类药物的主要突变类型和突变频率与已有研究一致，但异烟肼耐药菌株出现了更高比例的inhA基因耐药突变(22.7%)，明显高于深圳市(8.6%)和全国范围(15.2%)的研究，提示本地区可能存在较高比例的异烟肼耐药患者，抗结核药物治疗难度加大，这可能与inhA基因突变常发生异烟肼低水平耐药，使得标准剂量的异烟肼对inhA基因突变的患者治疗无效，只能使用高剂量并与其他抗结核药物联合治疗才可以取得一定的疗效有关。因此，建议浙江省可以通过WGS技术检测inhA基因耐药突变，有针对性地使用高剂量异烟肼疗法以提高本地区耐药结核病的治愈率。另外，本研究还发现6株(8.0%)异烟肼耐药菌株存在katG联合inhA或ahpC启动子区突变的情况，提示患者体内可能存在异质性耐药，也体现出WGS技术在异质性耐药检测上相较于其他分子检测方法的优势。其中，有1株异烟肼耐药菌株为ahpC+inhA+katG的联合突变形式，值得后续进一步研究分析。相关文献报道显示，吡嗪酰胺主要的耐药相关基因为pncA，其突变类型较多，主要突变类型为pncA启动子-11-T/C，与本研究发现的12株吡嗪酰胺耐药基因突变均在pncA基因上、突变位点分散且几乎遍布了整个编码区域的结果一致，但本研究并未发现pncA启动子-11-T/C的突变类型。由于受到样本量的限制，本研究发现的对其他二线抗结核药物耐药菌株较少，无法更深入地挖掘其耐药突变特征。总而言之，国内不同地区MTB耐药谱中主要突变类型基本一致，但突变频率可能存在一定的差异，这可能受到研究样本量、菌株基因型及不同地区结核病临床治疗偏好等因素影响。而本研究的结果进一步说明，充分且全面地了解本地区MTB菌株耐药突变特征，对评估分子检测方法的适用性及制定临床诊疗方案具有重要作用。

不同地区的流行菌株存在遗传背景差异，可能会导致同一药品在不同地区产生耐药突变谱的差异。本研究分析了突变率较高的耐药基因及突变位点与基因型的相关性，发现586株(72.5%)为北京基因型菌株，222株(27.5%)为非北京基因型菌株，所占比例与全国其他地区相似，如北京和上海;而且，链霉素耐药相关rpsL基因突变仅在北京基因型菌株中出现;同时，katG-315位点和rpsL-43位点在北京基因型中的突变率也明显高于非北京基因型;但在样本中未发现突变率较高的利福平耐药相关基因rpoB和氟喹诺酮类耐药相关基因gyrA与基因型之间的明显相关性，这可能与样本量不足有关，需要扩大样本量以进一步证实北京基因型与上述耐药相关基因的相关性。

WGS耐药性分析方法是否可以在结核病耐药监测工作中发挥更加重要的作用，还需要进行系统性评估。本研究对异烟肼的WGS分子药敏结果与表型药敏试验检测结果进行了交叉比对，并结合异烟肼相关耐药突变特征进行分析，展示了一套系统性的评估流程，为WGS耐药性分析方法的普及和推广进行了探索性工作。本研究中，WGS对异烟肼耐药检测的敏感度(87.5%)、特异度(98.0%)和一致率(97.2%)均较高，Kappa值达到了0.808，表明两种方法对异烟肼的耐药性检测结果一致性较高，可重复性强，提示在耐药监测工作中WGS具有取代表型药敏试验的潜力。但是，也发现WGS对部分耐药突变位点的预测性能较弱，如ahpC启动子-48-G/A、inhA-15-C/T和katG-315-S/T这3个位点在本研究中的不一致率分别为3/4、16.7%和11.6%，这些性能较弱的突变位点可导致假阳性结果的产生，降低了阳性预测值(77.8%)，对整体分析性能存在着制约作用。ahpC启动子-48-G/A在本研究中较高的不一致率提示该突变位点可能在浙江地区存在较低的预测性能，需要收集更多的耐药菌株进一步验证。

本研究也存在一定的局限性。虽然收集到808株MTB菌株的测序数据，但从部分抗结核药物检测到耐药相关基因突变的菌株并不多，无法进行进一步分析。另外，受到不同药物耐药菌株数量的限制，本研究仅对耐药率较高的异烟肼进行了WGS耐药性分析的性能评估，但认为该评估方法可应用于其他抗结核药物并值得推广。

综上所述，本研究对浙江省第五次结核病耐药监测数据进行WGS技术检测，揭示了MTB菌株对一线及二线抗结核药物的耐药相关基因突变谱及其与基因型的相关性，在分子层面展示了本地区的耐药情况，为耐药结核病分子检测方法的优化提升以及临床用药的精准指导提供了数据和理论支持，同时对WGS技术在耐药监测工作中普及和推广进行了探索性的研究。

利益冲突 

所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献

吴坤阳和陆烨玮:酝酿设计实验，实施具体研究，收集分析数据，撰写论文以及审阅修改;张明五、朱业蕾和李相辰:参与设计完善实验步骤，帮助实施研究，分析解释部分数据，撰写论文部分内容;潘军航、王晓萌、王蔚、江敏敏、彭小军、王炜欣和高俊顺:指导部分研究、帮助采集分析数据;柳正卫:审阅论文，指导研究，为研究提供经费、行政、技术和材料支持

参考文献（略）

编辑：于    菲

审校：范永德

发布日期：2022-11-30