科研丨曲阜师大: 磷酸三苯酯(TPHP)对鲤鱼的毒性作用及肠道微生物群落响应(国人佳作)

编译：微科盟北岸，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

磷酸三苯酯(TPHP)是一种有机磷类阻燃剂，其使用量逐年增加。然而，与暴露于TPHP相关的毒性作用尚未得到充分研究。因此，本研究测定了TPHP对经济鱼类鲤鱼(Cyprinus carpio)的毒性剂量。进行了急性和亚急性毒性试验，采用液相色谱-质谱法测定了TPHP在鲤鱼鳃、脑、肠和肝脏中的富集情况，并采用16S rRNA基因高通量测序法测定了鲤鱼肠道微生物群落对TPHP胁迫的响应。结果表明，TPHP在鲤鱼体内96 h LC50为7 mg/L。第7天时，TPHP的吸收顺序为(从高到低)：鳃>肠>肝>脑，但在28 d及净化期，TPHP吸收顺序为脑>鳃>肠>肝脏。3.5 mg/L的TPHP暴露降低了肠道微生物群落的α多样性(p < 0.05)，并改变了群落组成，特别是优势微生物类群的相对丰度。基于16S rRNA基因数据预测的微生物群落功能谱显示，TPHP处理组的外源物质降解和能量代谢上调(p < 0.05)，表明肠道微生物类群在降低TPHP毒性中具有一定作用。研究结果可为水环境中TPHP污染物的风险评估和相关水污染的管理提供参考。  

图文摘要      

论文ID

原名：Toxic effect of triphenyl phosphate (TPHP) on Cyprinus carpio and the intestinal microbial community response

译名：磷酸三苯酯(TPHP)对鲤鱼的毒性作用及肠道微生物群落响应

期刊：Chemosphere

IF：8.943

发表时间：2022.3

通讯作者：王仁君，高配科

通讯作者单位：曲阜师范大学生命科学学院

DOI号：10.1016/j.chemosphere.2022.134463

实验设计

结果

1 鲤鱼的急性TPHP毒性

实验开始8 h内，各组鲤鱼均未出现明显中毒症状。8 h后，低浓度组的鲤鱼在鱼箱内异常活跃，游动迅速，但随着时间的推移开始死亡。高浓度组的鲤鱼变得安静，聚集在水箱角落。渐渐地，它们的身体开始倾斜，有的出现腹部上翘、侧身游泳、停止游泳，甚至死亡。如图1所示，鲤鱼体内TPHP的96h-LC50计算为7 mg/L。

图1 鲤鱼暴露于TPHP 96小时的剂量-反应曲线。

2 TPHP处理后鲤鱼脑、鳃、肠和肝脏中TPHP的分布

用LC-MS法检测被测鲤鱼脑、鳃、肠和肝脏中TPHP的浓度，TPHP的标准曲线如图2a所示：y = 53.615627 * x + 137.653254，R2= 0.98763057。从鲤鱼组织中提取的物质出现时间为3.12分钟，如图2b所示，与色谱图中外标TPHP一致。此外，根据图2(c)所示的质量-电荷关系，确认所提取物质为TPHP。根据TPHP的标准曲线，计算鲤鱼组织中TPHP的浓度。如图2d所示，TPHP在第7 d的吸收顺序为：鳃>肠>肝>脑，在第28天和净化期(第31天)TPHP的吸收顺序为：脑>鳃>肠>肝。同一器官在不同时期所含TPHP也存在差异。鱼鳃中TPHP浓度随时间的推移显著下降(p < 0.05)，第7天和第28天肠道中TPHP浓度显著下降(p< 0.05)。同样，TPHP的浓度在净化期(第31天)有所下降，但差异不显著(p> 0.05)。在第7天和第28天，脑组织中TPHP升高(p < 0.05)，在净化期间(第31天)，TPHP浓度显著降低(p < 0.05)。肝组织中TPHP降低(p >0.05)。

图2 在暴露于TPHP的鲤鱼鳃、肠、肝和脑中检测到TPHP。(a) TPHP的标准曲线，(b)TPHP在色谱图中的出现时间，以及(c)TPHP的质荷色谱图，(d)暴露于TPHP的鲤鱼鳃、肠、肝和脑中TPHP的累积量。数据由通过平行样本计算的平均值和标准差值表示。标记的不同字母代表差异显著。

3 微生物α多样性

测序群落覆盖率达到0.999，表明测序深度覆盖了鲤鱼肠道内的所有微生物(表1)，鲤鱼肠道内微生物群落的α多样性降低。使用Shannon指数(p < 0.01)和Chao 1指数(p < 0.05)发现观察到的OTU数量显著减少。当将TPHP从养殖环境中去除时(净化，表1)，微生物α-多样性指数增加，与对照组无明显差异(p > 0.05)。

表1 鲤鱼肠道微生物群落的测序信息。

A： 对照组(7天)； B： DMSO组(7天)； C： 3.5 mg/L TPHP(7天)； D： 净化期。 数据由通过平行样本计算的平均值和标准差值表示。 标记的不同字母代表差异显著。

4 微生物β多样性

为了进一步分析样本之间的差异，在目分类水平上进行了PCA分析(图3)。结果显示，TPHP和对照组相对集中在不同的象限，这表明两个处理组之间存在差异。净化组结果分散；其中一些与对照组处于同一象限，这表明净化组和对照组的肠道微生物群落结构具有一定的相似性，但也有明显的差异。

图3 鲤鱼肠道微生物群落的PCA分析。A：对照组(7d)；B：DMSO组(7d)；C:3.5 mg/L TPHP(7天)；D：净化组。横坐标和纵坐标表示不同的主成分，百分比表示主成分对样本差异的贡献值。

5 菌群组成

如图4a所示，鲤鱼的肠道微生物群主要由变形菌门、放线菌门、梭杆菌门菌、镰刀菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、疣微菌门和蓝细菌组成。其中，变形菌门、梭杆菌门、拟杆菌门和放线菌门为优势菌门，野生鲤鱼肠道中的相对含量分别为50.5%、21.8%、13.5%和7.8%。DMSO溶剂对照组的群落组成与对照组相似，没有观察到显著差异(p > 0.05)。添加TPHP后，鲤鱼肠道微生物组的组成发生了显著变化：变形菌门和拟杆菌门的相对丰度增加(无显著差异，p > 0.05)，放线菌门和梭杆菌门的相对丰度显著增加(p < 0.01)。在净化期间，实验组鲤鱼的肠道微生物与对照组相似，如变形菌门、拟杆菌门和放线菌门较TPHP组减少。 在科分类水平上(图4b)，鲤鱼的肠道微生物群主要属于α变形菌、γ变形菌、放线菌、梭杆菌、拟杆菌、Bacilli、Verrucomicrobiae、Cyanobacteriia和梭菌。α-变形菌、γ-变形菌、放线菌、梭杆菌和拟杆菌是优势菌纲。野生鲤鱼肠道的相对含量分别为30.7%、21.8%、19.8%、13.5%和7.5%。DMSO组的微生物组成与对照组相似，无显著差异(p > 0.05)。随着TPHP的加入，鲤鱼的肠道微生物群发生了显著变化：γ-变形菌和梭杆菌的丰度显著降低(p < 0.01)。然而，α变形菌和放线菌呈相反的趋势，其在微生物组中的丰度显著增加(p < 0.01)。与对照组相比，拟杆菌减少，但总体上没有显著差异(p > 0.05)。进入净化期后，各类细菌的结构在一定程度上恢复到对照组的结构。 在属分类水平上(图4c)，鲤鱼的大部分肠道微生物属于48个菌属。DMSO组的微生物组组成与对照组相似，未观察到显著差异(p > 0.05)。随着TPHP的加入，其他优势细菌的丰度增加，如Phyllobacterium、Mesorhizobium和Mycobacterium，且差异极显著(p < 0.01)。 为了进一步确定组间群落差异的优势类群，使用STAMP 2.1.3进行了Welch t检验。如图5a所示，两个菌属(Crenobacter和Reyranella)在对照组和净化组之间存在显著差异，相对丰度小于3%(p < 0.05)。与对照组相比，TPHP组中的Mesorhizobium、Phyllobacterium、Mycobacterium、Labrys、Methylovirgula、Tsukamurella、Xanthobacteraceae_Unclassified、Nesterenkonia和其他微生物的相对丰度占优势，Mesorhizobium和Phyllobacterium占群落的10%以上(图5b，p < 0.05)。

图4 鲤鱼肠道优势种群的相对丰度。A：对照组(7d)；B：DMSO组(7d)；C: 3.5 mg/L TPHP(7天)；D：净化组。(a)门分类水平的相对丰度，(b)科分类水平的相对丰度，(c)属分类水平的相对丰度。在每个处理组中选择相对丰度排名前10%的数据。

图5 微生物类群(属分类水平)在对照组和净化组之间(a)、对照组和TPHP组之间(b)以及TPHP组和净化组(c)之间的相对丰度存在显著差异。

6 肠道微生物群落功能预测

使用Tax4Fun2从16S rRNA基因序列推断出第7天各组肠道微生物群落的功能特征，然后使用STAMP进行可视化(图6)。TPHP组和对照组之间与代谢途径相关的预测序列存在显著差异(图6)。TPHP组与双酚类、硝基甲苯和其他外源性有机物降解及炎症性疾病(系统性红斑狼疮)相关的预测功能基因的相对丰度显著高于对照组(p < 0.05)。相比之下，氨基酸代谢(精氨酸和组氨酸代谢)、脂质代谢(甘油酯代谢)、糖合成和代谢(各种N-聚糖生物合成)以及其他相关功能基因的相对丰度显著下调(p < 0.05)。

图6 基于16S rRNA基因的肠道微生物群落功能预测。蓝色和红色分别代表对照组和TPHP组。

讨论

磷酸三苯酯(TPHP)是一种材料添加剂，由于其持久性，通常会在生物体内积累，并产生影响生物健康的生物毒性。与溴化阻燃剂(BDE 209)对鲤鱼的影响相比，TPHP的毒性相对较低。目前研究TPHP对鱼类的毒性作用的结果表明，TPHP对物种的影响不同，致死效应阈值也不同。例如，基于大型水蚤的48小时急性暴露实验表明，10 mg/L TPHP杀死所有大型水蚤，5 mg/L的致死率高达70%。长期暴露21天后，在0.5 mg/L TPHP下观察到34%的死亡率，大型水蚤的体长显著缩短。然而，当斑马鱼胚胎暴露于4-120 hpf时，100 mg组的所有胚胎在72 hpf时死亡，120 hpf时的LC50为29.6 mg/L。另一项研究发现，50 μM TPHP杀死了50%的斑马鱼胚胎。在TPHP暴露下，Menidia beryllina的96 h-LC50(95 mg/L)是Cyprinodon variegatus(0.31-0.56 mg/L)的300倍。在本研究中，鲤鱼体内TPHP的LC50浓度为7 mg/L，与其他生物相比相对较低。因此，TPHP通常具有很高的毒性，并对水生生物产生轻微到高度的毒性。 TPHP进入鱼体内后，会被输送或分配到各种组织和身体器官，在这些组织和器官中产生毒性作用。研究结果表明，TPHP在各种组织和器官中的分布并不均匀，产生的毒性作用大小也不同。因此，不同器官或组织对TPHP的敏感性也不同。TPHP可对水生鱼类的脑神经造成严重损害，但相关的TPHP在鱼类脑组织中的富集数据很少。在第28天，大脑中的TPHP含量最高，但在净化期间开始下降。鳃是鱼类的呼吸和排泄器官，在环境中与TPHP直接接触；因此，它们更容易被TPHP损坏。在这项实验中，鳃组织样本中的浓度在第7天时相对较高，并且随着时间的推移开始降低。除去TPHP后，鱼鳃也表现出最大的改善。肝脏是鱼类的解毒和排泄器官，参与许多生理和代谢功能。一项实验表明，在暴露3天后，斑马鱼肝脏中TPHP的积累达到峰值。在该实验中，肝脏中TPHP的浓度下降，这表明其代谢TPHP的能力大于其吸收TPHP的能力。TPHP的生物降解此前已有研究。肠道是影响鱼类免疫的最大器官，它包含一个复杂的微系统。在本研究中，肠道组织样本中的TPHP浓度在第7天时相对较高，并随着时间的推移开始降低。在当前实验的净化期，肠道中TPHP浓度的降低不仅与肠道的排泄功能有关，还与肠道中降解TPHP的微生物的存在有关。 肠道微生物群被认为是生物体中最复杂的系统，近年来引起了广泛的研究关注。微生物群丰度和结构组成的变化对身体的营养代谢和免疫功能有很大影响。之前的一项研究使用高通量测序技术，发现变形菌门、梭杆菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门是斑马鱼肠道内的核心微生物群，这与当前研究的结果一致。在本研究中，TPHP胁迫显著降低了鲤鱼肠道微生物的多样性，并改变了微生物群落的组成。在另一个实验中，成年斑马鱼被喂食补充了三氯生的食物一段时间，观察到肠道微生物多样性的快速变化。此外，当向金鱼的环境中添加100 μg/L五氯苯酚(PCP)时，金鱼的微生物群落结构也发生了变化。在门分类水平上，厚壁菌门和拟杆菌门的比例相对减少；在属分类水平上，拟杆菌属的比例增加，但Chryseobacterium、Microbacterium和Legionella的相对丰度降低。对肠道微生物群的干扰以及由此产生的失衡进一步加剧了持久性污染物毒性的影响，并最终导致宿主肠道通透性和炎症的改变。本研究发现3.5 mg/L TPHP组中变形菌丰度增加。变形菌与脂多糖的产生有关，脂多糖可以破坏肠粘膜屏障，增加肠道渗透性，从而引起炎症。TPHP已被观察到对肠道微生态有一定的负面影响，损害肠道健康。一项研究发现，在环境浓度下急性暴露于多溴联苯醚会导致斑马鱼肠道微生物群的突然变化，从而危及宿主的健康。除了致病菌外，水生生物的肠道中还存在相对稳定的长期定植菌，如共生菌，这种微生物群是在进化过程中通过个体适应和自然选择建立起来的，它们是生物体中不可分割的一部分，非常有益。梭杆菌可以将碳水化合物(包括粘蛋白)代谢成短链脂肪酸丁酸盐，这为宿主提供了许多益处，包括为胃肠道细胞提供能量，作为抗癌和抗炎剂，以及抑制潜在的淡水鱼病原体。在本实验中，使用Tax4Fun2预测对照组和TPHP组中细菌的功能。此研究发现，3.5 mg/L TPHP组的肠道微生物群在去除污染物有机物、能量代谢和炎症疾病方面有显著效果。本研究的净化期实验结果表明，鲤鱼肠道中的一些微生物在特定条件下通过自身功能代谢TPHP，降低其毒性。此外，一些敏感细菌的丰度恢复到接近正常水平。最近的研究发现，Saccharomyces cerevisiae可增强宿主肠道中嘌呤的代谢，嘌呤可被氧化并转化为尿酸，从而诱发结肠炎。虽然很少有资料提供鲤鱼肠道中存在TPHP降解菌的信息，但已在污泥和电子垃圾渗滤液中筛选出TPHP降解菌，本研究还发现鲤鱼肠道中也存在这些细菌。

结论

本研究调查了鲤鱼(经济鱼类)中TPHP的毒性剂量，并测定了鲤鱼脑、鳃、肠和肝脏中TPHP的富集水平，以及鲤鱼肠道微生物群落对TPHP胁迫的反应。结果表明，TPHP在鲤鱼体内的LC50为7 mg/L。在整个实验期间，TPHP在鲤鱼组织中的分布随时间而变化，TPHP胁迫导致鲤鱼肠道微生物多样性、组成和功能特征发生变化。结果还表明，Mesorhizobium、Phyllobacterium、Mycobacterium、Labrys、Methylovirgula、Tsukamurella和其他微生物可作为确定TPHP污染的指示微生物。本研究结果可作为评估TPHP水污染毒性效应的重要参考，但还需要进一步的研究来确定肠道微生物是否对TPHP有很强的解毒能力。另一方面，本实验中鲤鱼的中毒行为是肉眼不规则记录的，将被准确描述。