尿路上皮细胞癌尿分子标志物检测方法及准确性研究进展

Bulai C, Geavlete P, Ene CV, Bulai I, Popescu RI, Mares C, Ene CD, Punga AM, Geavlete B. Detection of Urinary Molecular Marker Test in Urothelial Cell Carcinoma: A Review of Methods and Accuracy. Diagnostics (Basel). 2022 Nov 4;12(11):2696. doi: 10.3390/diagnostics12112696. PMID: 36359539; PMCID: PMC9689047.

尿路上皮细胞癌尿分子标志物检测方法及准确性研究进展

早期发现膀胱癌对预后有积极影响。已经开发了多种生物标志物来及早检测尿液中的膀胱肿瘤并减少对膀胱镜检查的需求。为了检测膀胱癌，有几种方法可用，但其准确性根据每种方法的敏感性和特异性而有所不同。本综述旨在根据现有文献重点介绍已建立的膀胱癌检测方法。此外，我们的目标是确定提供最高准确度的不同有效检测方法的组合。在我们的研究中，使用关键字检索方法来搜索适当的英语参考文献。该参考书目已在 PubMed 和 Scopus 中编入索引，或通过 2015 年至 2022 年的系统搜索找到。根据对国际准则的分析，人们发现存在许多差异和未解决的问题。尿路上皮细胞癌生物标志物的理想检测方法的发现一直是众多努力的主题。近年来，关于这一主题已经发表了广泛的标签外、实验、新颖和组合方法。本综述有助于确定检测膀胱癌的准确方法，并突出未来可以改进的研究领域。

在泌尿生殖道上，尿路上皮细胞癌（UCC）是仅次于前列腺癌的第二大常见恶性肿瘤。膀胱肿瘤占UCC的90%-95%，但UUT相对罕见，仅占UCC的5%-10%[ 1 ]。   许多因素可能导致膀胱癌的严重程度、复发或进展，以及患者的生存。关于尿路上皮癌相关分子变化的知识越来越多，因此应发展诊断性检查，并已对这些检查进行综述 。 患者和泌尿科医生都面临着经尿道切除术后复发性非肌层浸润性膀胱癌和随后癌症进展的挑战 。 截至目前，膀胱癌患者会定期通过膀胱镜检查和尿液细胞学检查癌症复发或进展，检查频率取决于其个体的疾病危险因素[ 7 ]。众所周知，膀胱镜检查费用昂贵，会引起患者相当多的不适，并且敏感性各不相同[ 8 ]。此外，尿液细胞学检查对检测低级别疾病的敏感性较差，其准确性对病理学家的知识和经验敏感 。 鉴于这些手术的侵入性，需要一种不那么积极、更可靠的替代方案。临床实践需要对早期膀胱癌患者进行诊断和评估，尤其是高危患者手术后 。 许多新型尿液生物标志物正在研究中，FDA已经批准了6种检测方法，但由于成本高或敏感性低，目前没有一项检测方法正在常规临床实践中实施 。 美国国家综合癌症网络（NCCN）认为几种标志物，包括UroVysion和核基质蛋白（NMP22），可用于监测BCA的复发。虽然各种指南都强调了UroVysion的实用性，但重要的是要认识到其应用因临床环境而异 。 另一方面，欧洲泌尿外科协会 （EAU） 2022 年指南指定了膀胱镜检查阴性患者的分子标志物检测 UroVysion、NMP22、成纤维细胞生长受体 （FGFR3） 和微卫星分析，以识别进展和复发风险增加的患者。使用膀胱镜检查来检测血尿或其他提示疾病存在的症状的患者的BCA，是最有效的检测方法。分子标志物检测可作为膀胱镜检查的补充操作，以检测漏诊肿瘤，尤其是特异性特别重要的CIS 。 根据全球BCA指南，诊断包括膀胱镜检查、活检、影像学检查和尿液细胞学检查，其中FISH和尿标志物蛋白检测是BCA检测的补充推荐 。 泌尿科医生面临的挑战是为低风险患者设计有效、具有成本效益的无创监测方案，同时促进更积极主动地早期发现高风险难治性癌症。有必要进行全面的研究，确定新的和更有效的生物标志物，以促进诊断，随访和筛查处于危险中的社区。此外，必须使用改进的仪器引入新的更有效的分子标记检测 。 使用PubMed和SCOPUS数据库从2015年到2022年进行了文献检索。 在搜索查询中，我们输入了“膀胱癌检测”或“尿路上皮细胞癌”和“生物标志物”或“分子标志物测试”或“UroVysion”或“NMP22”或“成纤维细胞生长因子受体（FGFR）3”。 作为本综述的一部分，我们纳入了检查诊断膀胱癌的分子标志物的研究，通过敏感性/特异性、阳性预测值、阴性预测值和患病率样本（临界值和尿液采样方法，如首次排尿、刷尿、洗尿和被动收集尿液）来评估诊断性能。 我们旨在在本出版物中对诊断、分子生物标志物和膀胱癌的控制进行循证综述。本文将参考美国泌尿外科协会 （AUA）、欧洲泌尿外科协会 （EAU） 和国家综合癌症网络 （NCCN） 发布的几份指南，这些指南为膀胱癌诊断提供背景信息和补充建议。

1.1. 尿路上皮细胞癌生物标志物的当前指南

在非肌肉浸润性膀胱癌 （NMIBC） 患者的监测中，FDA 批准的几种膀胱肿瘤抗原 STAT 测试可从美国华盛顿州雷德蒙德的巴德诊断、BTA TRAK 测试、来自美国马萨诸塞州牛顿市的 NMP 22 和 NMP22 膀胱切克测试、ImmunoCyt 测试（加拿大魁北克市 QC 诊断公司）和荧光原位杂交 （FISH） 测试（UroVysion Systems Vysis， 雅培实验室，雅培公园，芝加哥，伊利诺伊州，美国）。此外，最近还评估了微卫星多态性分析作为测试和标志物[ 16 ， 17 ]。尽管NMIBC目前和未来都有潜力，但目前的NMIBC管理指南并未包括对尿液标志物的批判性评估和比较[ 12 ]。 在目前的指南中，一些具有强大证据基础的生物标志物由于文献中没有提及而未被讨论。有一种针对泌尿系统肿瘤的测试建议，该测试可在从BCA患者和健康个体获得的尿液样本中提取的脱落细胞中检测烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT）。Bca患者的尿液样本与对照组的尿液样本存在显著差异[ 18 ]。毫无疑问，需要对这个标记进行进一步和详细的研究。 上述测试已获得FDA的认可，用于BCA的诊断和随访以及规范技术，但其中大多数是在BCA流行的人群中进行的病例对照研究，因此其阳性预测值高得不切实际。此外，当随访膀胱镜检查未发现显著发现时，很难从这些检查中读取阳性结果。这些试验在日常实践中的使用也因缺乏外部验证研究而受到限制[ 12 ]。 在过去的几年中，已经见证了对几种有前途和有趣的生物标志物的评估，尽管只有那些由负责体外诊断（IVD）的监管机构批准的生物标志物才成为商业上可获得的生物标志物，可以与膀胱镜检查结合使用，用于BCA的初步诊断和随访。根据不同的报道，新型尿生物标志物的敏感性更高，但特异性低于细胞学检查，因此在国际指南中不推荐。

1.2.1. NMP22

膀胱 这些 蛋白质被称为核基质蛋白（NMP），是细胞核内部结构框架的一部分。这些蛋白质有助于维持核形状和组织DNA，它们在DNA复制、转录和基因表达中起重要作用[ 31 ， 32 ， 33 ]。Schulz 等人（2022 年）指出，有两种 FDA 批准的测试使用此标记，即 NMP22 膀胱癌 ELISA 和 NMP22 膀胱切克测试。与定量测试的ELISA测试相比，BladderChek测试是在实验室中进行的定性测试，可以在护理点（POC）进行。两种检测均通过分析排尿来检测NMP22标志物[ 34 ]。根据各种调查和meta分析，BTA统计的敏感性为64%，特异性为77%，而BTA Trak的敏感性为65%，特异性为74%[ 35 ]。根据Yafi等人的说法，BladderChek对低级别肿瘤的敏感性为25%，对高级别肿瘤的敏感性为91%[ 20 ]。BladderChek可以提供哪些患者需要膀胱镜检查的临床见解。遗憾的是，研究发现尿路感染、结石、异物和其他泌尿生殖系统癌症的假阳性率很高[ 23 ]。在有症状患者的诊断中观察到的敏感性高于随访，尽管特异性相似。尽管补体因子H的特异性降低，即在其他泌尿生殖系统恶性肿瘤中，伴有血尿的良性疾病（包括结石、炎症、仪器和膀胱内治疗）的敏感性高于尿细胞学检查[ 24 ， 32 ]。

1.2.2.

 UroVysion/FISH（荧光原位杂交） UroVysion是一种杂交测定，使用多靶点多色原位荧光（FISH），可识别脱落尿路上皮细胞中的染色体异常[ 21 ]。根据美国泌尿外科协会指南，UroVysion FISH 可用于评估对卡介样芽孢杆菌治疗的反应并确定适当的细胞学检查。为了检测看不见的肿瘤，尤其是CIS，可以使用尿液生物标志物来遵循EAU指南的建议。许多研究表明，尿FISH也可用于诊断尿路血尿患者的尿路上皮癌[ 22 ， 36 ]。Yang等人使用尿液标本在膀胱副神经节瘤中检测了FISH[ 37 ]。这项研究没有证明UroVysion诊断罕见组织学癌症的有效性。在他们之前的临床工作中，Hu Z等人指出，尿FISH也可以在尿路癌中显示出阳性结果，这导致了这项研究。因此，本研究重点关注FISH在尿路癌患者中的诊断价值，并比较了这些患者的组织学和细胞学FISH结果的一致性[ 38 ]。另外，Nagai，T.等人在他们的研究中得出结论，仅靠UroVysion FISH不足以检测膀胱癌，膀胱镜检查需要伴有UroVysion FISH才能准确检测和随访[ 27 ]。

1.2.3. FGFR3在膀胱癌中的应用 FGFR3

已被 验证为尿路上皮膀胱癌的预后和预测标志物，也是治疗靶点[ 39 ]。FGFR3基因改变的存在通常与尿路上皮膀胱癌的级别和分期较低有关[ 38 ]。根据美国癌症联合委员会第8版，FGFR3表达与低级别肿瘤和较低的癌症进展风险相关[ 28 ]。尽管FGFR3基因改变通常与有利的特征相关，但Lotan，Y等人认为，一旦尿路上皮癌进展，没有证据表明FGFR3基因改变与侵袭性表型相关。当晚期癌症患者接受化疗时，FGFR3基因改变与较差的结局相关[ 40 ]。尿路上皮癌由FGFR3驱动，导致靶向FGFR3的治疗方法的发展[ 41 ]。研究表明，靶向FGFR3和其他酪氨酸激酶的单药多维替尼在未选择的尿路上皮癌患者群体中的效果不如靶亲和力较高的泛FGFR抑制剂[ 42 ， 43 ]。

1.2.4. 微卫星检测 微

卫星不稳定性 （MSI） 被认为是胃肠道癌、子宫内膜癌、结直肠癌和膀胱癌的诊断方法;然而，不稳定事件正在更广泛的癌症中出现。这个过程在人类致癌的不同阶段起着至关重要的作用。目前，通过检查重要微卫星标记物（MSI-PCR）的PCR产物来检测微卫星标记[ 29 ]。据报道，近年来，许多研究小组已经开发出使用广泛的并行DNA测序技术来分析MSI的技术[ 30 ]。除了提供可靠的定性和定量精度外，这种最近的方法还基于大量样品。除了鉴定有价值的生物标志物和MSI阳性致癌的新治疗靶点外，下一代测序（NGS）已成为一种有用的工具[ 29 ]。这些是MSI+（MSI阳性）致癌研究的最新进展[ 29 ， 44 ， 45 ， 46 ]。作为对林奇综合征的初步研究的结果，对MSI对人类致癌物多样性的大量研究得出了三个关键结论。MMR系统缺陷/损伤有两个潜在原因：酶功能的突变失活或MMR通路中几个关键基因的DNA甲基化沉默[ 44 ]。在最近的研究中，有人建议MSI可用作免疫检查点阻断治疗的预测因子。对于MSI阳性肿瘤患者，与阴性肿瘤患者相比，使用程序性细胞死亡抑制剂1（PD-1）治疗已被证明可以带来更好的结果。T淋巴细胞检测多种基于MSI的DNA突变产生的多种肽新抗原的能力可以解释这一结论 。

2. 讨论

当临界值以及所研究的尿液采样方法的类型不同（排尿、尿路上皮刷、尿路上皮冲洗和被动收集尿液）不同时，将这项研究的结果与当前专业文献的结果进行比较似乎是武断的。比较上述生物标志物的分析，发现NMP22检测试剂盒（cut-o >10U/mL）与BTA统计在不同分期和肿瘤分级的敏感性或特异性方面没有差异[ 18 ]。 文献报道FISH在UTUC（UTUC）检测方面的敏感性和特异性范围很广（35-88%和78-96%）[ 47 ， 48 ]。文献还报道，尿液细胞学检测膀胱尿路上皮癌和UTUC的敏感性较低，但特异性与FISH相同或更高[ 48 ， 49 ， 50 ]。有必要进行额外的研究，以检查 FISH 作为输尿管镜检查分诊测试在 UTUC 肾脏保留手术后的随访中的诊断准确性。作为我们的综述结果，我们得出结论，泌尿科研究侧重于膀胱癌的早期诊断和初始治疗后复发的仔细随访。与疾病检测相比，很少有研究检查使用治疗前尿液生物标志物水平作为预后指标。 高复发率以及膀胱镜检查和细胞学检查的长期随访使膀胱癌成为总体上治疗最昂贵的癌症。 对于有膀胱癌风险的患者，建议使用 NMP22 和 UroVysion 进行诊断和监测。这些测试是经过充分研究的尿液标志物，可以通过利用非侵入性尿液标志物来改善新癌症的诊断和管理。根据我们的综述，我们发现很少有研究在2015年调查微卫星检测，尽管这种方法是由EAU提出的。 根据EAU指南，由于缺乏经批准的诊断或监测标志物，膀胱癌检测仍然很困难，因为这些经批准的标志物都不能取代膀胱镜检查或延长膀胱镜检查间隔[ 13 ]。 目前诊断和监测膀胱癌的方法是膀胱镜检查和细胞学检查，它们不被认为是最佳的尿液标志物，因此无法可靠地检测膀胱癌。除了昂贵且具有侵入性外，膀胱镜检查还缺乏对低级别肿瘤的敏感性。因此，已经开发了许多基于尿液的测试，以提高超越当前诊断测试的效率。对于 BCA 的诊断和监测，EAU 和 FDA 批准的方法（NMP22、Urovyson、FGFR3 和微卫星检测）显示出更高的灵敏度，但特异性较低，尤其是在低级别、早期或复发性 BCA 病例中。除了上述方法的优势外，即使在低级别病例中，也可以准确检测隐形肿瘤，包括原位癌，具有很高的阳性预测值。此外，FGFR3是预后最强的相关性之一，可作为预后选择标志物进行检测。每种方法的优点与缺点相平衡，例如尿路感染的假阳性率较高，成本以及对标准化标志物的需求，这可能会限制其在日常医疗保健中的使用（例如，UroVysion测试）。此外，膀胱癌检测和监测需要 FISH 测试以及膀胱镜检查。除了FDA批准的测试外，大多数商业测试都是基于研究的。 目前，市售有几种诊断工具可以检测尿液中的BCA，但正在开展深入研究，以发现更有效的生物标志物[ 32 ， 51 ， 52 ]。液体活检很可能是肿瘤早期发现的重要组成部分，可以为患者提供最佳护理，同时避免延迟诊断造成的人力和经济成本[ 53 ]。由于大多数研究中的患者数量有限，因此在大规模前瞻性研究中缺乏外部验证，缺乏生物标志物之间的比较研究，以及需要在方法上改进现有生物标志物并发现新的稳健生物标志物至关重要。此外，低危BCA的现有生物标志物相对不足，特异性低，初始诊断时比随访时更准确[ 18 ]。这些生物标志物的局限性阻碍了大多数国际临床学会提出建议，文献表明，单一生物标志物不足以克服这些局限性。在这方面，目前的研究趋势集中在开发更准确的BCA诊断和监测工具，以及预测其行为以提供预后信息[ 54 ]。 使用标准病例对照方法对检测的评估不足，强调需要进行前瞻性队列研究，这些研究涉及在不同时间点从有风险的个体中采集的连续样本，以及验证生物标志物临床益处的大型随机检测。由于这些因素，国际社会的指南不建议将其用作常规膀胱镜检查和细胞学检查的辅助或替代。目前，膀胱镜检查和尿液细胞学检查仍然是诊断膀胱癌的黄金标准，尽管需要进一步研究可能有助于确定其在疾病中的作用的标志物。 关于本综述，有一些限制需要提及，以确保其有效性。首先，由于文献中的发表偏倚，只发表阳性数据，因此综述可能偏向于更积极的结果。其次，该方法的敏感性和特异性尚未在肿瘤分级和分期的亚组中进行评估，这是本研究的另一个局限性。 虽然这项研究存在一些局限性，但我们相信它提供了文献的全面总结，并提供了一个可搜索的分子标志物数据库，迄今为止已经研究过，这将对那些正在寻找更好的尿液生物标志物的人有很大帮助。 转到：

3. 未来方向

截至今天，所研究的尿蛋白生物标志物都无法在没有侵入性手术的情况下用于膀胱癌的准确诊断。目前还没有成功的尝试结合蛋白质生物标志物来提高测试的准确性，但敏感性和特异性都不足以在临床上有用。包括诊断和随访方案以及临床风险分层的诊断流程可以突出这些技术在未来对疑似尿路上皮癌患者的潜在作用。例如，技术的发展以及临床界和医学工程部门之间的合作，有望使临床医生在不久的将来进行微创生物标志物测试，以检测和随访膀胱癌和/或上尿路上皮癌患者。 转到：

4. 结论

尽管具有很高的灵敏度和特异性，但非侵入性BC测定仍然存在不方便的假阳性率。膀胱癌可以通过多种测试进行非侵入性检测，每种测试都有自己的优点和缺点。目前，尚无生物标志物试剂盒被广泛使用。 由于其低特异性和有限的临床效用，基于尿液的生物标志物不能提高诊断精度，并且它们需要更可靠、更合理和特异性的基于尿液的膀胱癌生物标志物。 本文中描述的生物标志物不能被推荐用于膀胱癌的检测、监测和预后，未来的研究有望探索新的生物标志物和靶点。 我们将继续这项研究，评估推荐的生物标志物，以确认非侵入性膀胱癌检测方法的有效性并改善患者护理。

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