快报 | SDC4通过调控Cdc42、N-WASP和Arp2/3信号通路促进结核分枝杆菌感染肺上皮细胞

作者：温炟，崔佳，李平，熊秋宏，陈广信，吴长新

第一作者及单位：温炟，山西大学生物医学研究院；医学分子细胞生物学山西省重点实验室

通信作者及单位：吴长新，陈广信：山西大学生物医学研究院；医学分子细胞生物学山西省重点实验室/重大传染病治疗防控山西省重点实验室

Syndecan-4 assists Mycobacterium tuberculosis entry into lung epithelial cells by regulating the Cdc42, N-WASP, and Arp2/3 signaling pathway 

Da Wen, Jia Cui, Ping Li, Qiuhong Xiong, Guangxin Chen, Changxin Wu

Microbes Infect, 2022: 104931.

doi：10.1016/j.micinf.2022.104931.

PMID: 35026388.

研究背景

结核病（tuberculosis，TB）是一种古老的慢性传染病，是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）感染引起的一种人畜共患病，是威胁人类健康的主要因素之一。TB是由于吸入肺结核患者的咳嗽气溶胶复合物而引起的常见传染病，其主要特征是在患者肺部形成肉芽肿，当人体吸入MTB后，人体内的免疫细胞（如巨噬细胞和粒细胞）将与之抗争，一部分人体内的MTB被清除，一部分人体内MTB潜伏起来，而另一部分人则会感染TB。尽管MTB主要定殖于吞噬细胞（主要通过吞噬作用被摄入细胞内），但非吞噬细胞（如肺上皮细胞）也是MTB从肺部向其他器官复制和传播必不可少的途径。据报道，在气溶胶感染的最初几周中，MTB在诱发细胞介导免疫（CMI）之前就会在肺部发生剧烈的复制并传播到多个器官，而其中非吞噬细胞功不可没。即使结核分枝杆菌潜伏感染（LTBI）没有疾病进展，也会造成全身传播，而且多数LTBI都是非吞噬细胞类型的感染，例如肾脏的鲍曼囊壁细胞和近曲小管上皮细胞、肝脏的肝细胞和门静脉胆管上皮细胞。迄今为止，尽管上皮细胞越来越多地被认为是TB的关键参与者，但与MTB的相互作用以及促进上皮细胞的附着和内化的分子机制仍然是知之甚少。有研究证实，Syndecan-4（SDC4）与MTB感染肺上皮细胞有关，但其分子机制还不十分明确；另有文献报道，细胞骨架重排参与MTB对肺上皮细胞的感染。因此，我们猜想SDC4协助MTB感染肺上皮细胞的过程也与细胞骨架重排有关，并对此进行了研究。

研究设计

1．验证SDC4在MTB感染肺上皮细胞中的作用： Stefan H.E. Kaufmann教授已经报道SDC4能够促进MTB对肺上皮细胞的感染，我们对此进行了验证，使用H37Ra感染SDC4稳定过表达与敲低的A549细胞系，并通过稀释平板计数和免疫荧光对MTB的感染效率进行检测。

2．观察SDC4协助MTB感染A549细胞过程中细胞骨架的重构：肌动蛋白作为细胞骨架的重要组成成分，可以以G-actin的游离单体存在，也能以F-actin的线性聚合物存在，二者可以通过聚合和解聚相互转化，从而发挥不同的功能，所以通常将二者定为观察细胞骨架变化的指标。我们通过免疫荧光及Western Blot检测了H37Ra感染A549细胞后的F-actin及G-actin的变化。

3．MTB感染A549细胞引起的细胞骨架重构是否受Cdc42、N-WASP和Arp2/3信号通路所调控：细胞骨架重塑涉及多种信号途路，有研究表明，有病原体通过调节Cdc42信号通路的激活来诱导肌动蛋白的聚合进而感染宿主细胞。因此，我们通过Pull down实验分析A549细胞在感染MTB后Cdc42的激活情况，通过敲低Cdc42、N-WASP和添加Cdc42、N-WASP和Arp2/3的拮抗剂抑制此信号通路后，感染H37Ra并观察MTB感染效率的变化。

研究结果

1. 我们对SDC4不同表达水平的A549细胞td-tomato-H37Ra感染，随后通过免疫荧光拍照和稀释涂板计数对感染效率进行统计。免疫荧光及CFU结果显示，SDC4过表达后，MTB的感染效率较野生型得到了明显提升，而在SDC4敲低的A549细胞系中，MTB的感染效率明显降低（图1B～D）。说明SDC4可以协助MTB侵入肺上皮细胞。

图1 

2. 为了确定A549细胞在MTB感染期间肌动蛋白细胞骨架的重构，我们通过Western blot来检测F-actin和G-acitn的变化，并同时利用鬼笔环肽染色实验来确认细胞内F-actin的表达和分布情况。结果表明，无论在SDC4过表达和敲低的A549细胞中，MTB感染都可促使F- actin/ G- actin比值的降低（图2A），表明在MTB感染A549细胞的过程中肌动蛋白细胞骨架发生了重塑。同时我们发现，在SDC4过表达的A549细胞内，F-actin/ G-actin比值降得更低，而SDC4敲低的A549细胞内，F-actin/ G-actin比值降低的更少（图2B）。为了进一步验证，我们使用鬼笔环肽（与F-actin特异性结合）进行细胞骨架染色，结果表明，MTB明显降低了肺上皮细胞中F-actin水平（图2C）。以上所有结果表明，MTB感染A549细胞时，可以通过SDC4来引起肌动蛋白细胞骨架的重塑。

图2  

3. 我们通过pull down分析得出，在MTB感染过程中，SDC4的表达量与Cdc42信号通路的激活有关，SDC4表达量升高，MTB染菌效率升高，Cdc42的活化水平就受到了抑制（图3A）。为了具体分析肺上皮细胞中Cdc42信号通路的活化与MTB感染效率之间的关系，我们检测了敲低Cdc42和添加ZCL278（Cdc42特异性抑制剂）后MTB感染效率，结果发现两种方法均明显提高了MTB感染效率（图3C, D）。通过对Cdc42的下游信号通路蛋白N-WASP和Arp2/3的阻断或敲低，并感染MTB、Wiskostatin （N-WASP抑制剂）和CK636（Arp2 / 3抑制剂），发现N-WASP和Arp2/3被阻断或敲低后，MTB的感染效率明显上升（图3E～G）。以上结果表明，用抑制剂阻断Cdc42、N-WASP和Arp2/3信号通路可明显提高MTB对肺上皮细胞的感染效率。综上所述，MTB进入感染肺上皮细胞涉及Cdc42、N-WASP和Arp2/3信号通路的激活。

图3 

研究意义

本研究就SDC4在MTB感染肺上皮细胞中的作用及机制展开研究。实验表明，SDC4协助MTB感染肺上皮细胞的过程与细胞骨架的重排有关，且受Cdc42、N-WASP和Arp2/3信号通路的调控。本研究丰富了MTB感染宿主细胞，特别是非免疫细胞的感染机制，为开展特定靶向药物研发和实施精准医学治疗提供有意义的信息。

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供稿：温    炟

编辑：孟    莉 

审校：范永德

发布日期：2022-11-28