文献学习 ||弥漫性中线胶质瘤的内在特征和微环境特征

弥漫性中线胶质瘤（diffuse midline glioma, DMG）是一种儿童和青少年高级别胶质瘤，起源于大脑中线结构，包括脑桥（弥漫内生性脑桥胶质瘤-DIPG），源于少突胶质细胞谱系的干细胞的恶性转化。DMG约占所有确诊的儿童中枢神经系统癌症的10%~20%。诊断为DIPG的儿童和青少年的总生存期为9~11个月，诊断后2年存活率<10%。高死亡率使DMG成为中枢神经系统肿瘤儿童死亡的主要原因。

组蛋白H3K27的低甲基化在每一例DMG中都可见。DMG由H3基因（包括HIST1H3B/C（H3.1K27M）或H3F3A（H3.3K27M））体细胞突变或Zest同源抑制蛋白增强子（EZHIP）的过度表达驱动。这些改变抑制了多梳抑制复合物2（PRC2）对H3K27三甲基化的催化作用。WHO第5版《中枢神经系统（CNS）肿瘤分类》（2021出版）将这种恶性肿瘤定义为“弥漫性中线胶质瘤，H3K27改变”（反映多种潜在分子和表观遗传改变），包括脑干（脑桥、中脑、延髓）以及丘脑和脊髓中发现的肿瘤。

不幸的是，化疗并没有延长DMG患者的生存期，而且由于解剖部位复杂，不可能进行大范围切除。随着外科技术的进步，活检变得越来越普遍。随后的标志性的分子研究带来了精准治疗策略，然而，该方法仍未能改善患者的生存。DMG的标准治疗仍然是姑息性放疗，然而，对那些有反应的患者来说，这也只会延长几个月的生存期。因此，为DMG儿童和年轻人制定新的治疗策略显然是当务之急。

自从免疫检查点抑制剂被批准用于治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌和霍奇金淋巴瘤以来，基于免疫肿瘤学的治疗方法被誉为下一代癌症治疗方法。然而，这并不是侵袭性中枢神经系统肿瘤的经验。因此，有必要研究DMG独特的基因组学和表观遗传学特征，为寻找有效的免疫治疗方案做准备。

与其他高级别胶质瘤（如胶质母细胞瘤）和其他低级别胶质瘤相比，原发性DMG及其肿瘤微环境显示PD-1/PD-L1的表达有限，免疫细胞浸润很少，肿瘤细胞不能有效地被T细胞靶向识别。然而，尚不清楚免疫“冷”肿瘤微环境在DMG的发生中起什么作用，而关于 DMG独特特征的新数据可能会为我们提供关于免疫逃逸的线索。

一、表观遗传学

组蛋白H3K27低甲基化是DMG的标志。在正常组织中，H3K27要么被乙酰化（H3K27ac），要么被单-（H3K27me1）、二-（H3K27me2）或三-（H3H27me3）甲基化。H3K27ac标志着活性增强，最近的报告也表明H3K27me1与活性转录有关。然而，单甲基化的影响仍在讨论中。相反，H3K27me2和H3K27me3由PRC2催化，并与转录抑制相关。

值得注意的是，在DMG中，残基27中的赖氨酸（lysine）被蛋氨酸（methionine）取代（H3K27M），不仅阻止了突变等位基因（H3K27M）的甲基化，而且还阻止了其余野生型H3等位基因的甲基化，这类似于H3野生型DMG（EZHIP过表达阻止了PRC2催化三甲基化）。因此，尽管DMG细胞中只有3%~17%的组蛋白H3.1和H3.3存在K27M突变，但H3K27me2/me3的总体减少始终持续（表达阴性）。

转录沉默的缺失与DMG的发生密切相关，但据报道，H3.1K27M、H3.3K27M和EZHIP肿瘤亚型存在细微差异，表现在：同时发生的体细胞突变、部位、诊断年龄和中位生存期。其中，“生存期”表明这些特征影响了对放疗和/或免疫治疗的反应，从而影响复发和死亡的时间。

H3.1亚型的基因特征更类似于“间充质胶质母细胞瘤”。有趣的是，在非小细胞肺癌和黑色素瘤中，间充质表型与免疫抑制微环境相关，包括免疫检查点蛋白表达增加、免疫细胞浸润减少和对免疫检查点抑制剂治疗反应减少。这表明，H3.1的表观遗传学可能识别出一个免疫更“冷”的微环境（图1）。

图1. H3K27M DMG独特的表观遗传特征与胚胎干细胞（ESC）和间充质干细胞（MSC）相似，已知它们分别具有低免疫原性和免疫抑制性。此外，PRC2活性与抗原呈递呈负相关。

有趣的是，先前的研究表明PRC2表达与抗原呈递呈负相关；抑制EZH2（PRC2的催化亚基）增加抗原呈递和T细胞浸润。在H3K27M DMG中，基因组中的特定位点保持三甲基化状态，特定CpG岛（CGI）上的染色质甚至显示出增加的三甲基化。这种持续的甲基化对于DMG细胞的生存至关重要，因为EZH2抑制剂可抑制细胞生长。

此外，在胚胎干细胞（ESC）中也可以看到类似的局限于CpG岛（CGI）的三甲基化。胚胎干细胞（ESC）具有低表达的主要组织相容性复合体I（MHC I），使得这些原始细胞对免疫系统不太可见。因此，如果DMG中持续的H3甲基化涉及抗原呈递途径的抑制，从而可能指导增加MHC I表达的治疗，从而提高DMG肿瘤的免疫原性，这将是很有意思的。

二、DMG相关的体细胞突变

已知DMG具有较低的肿瘤突变负荷，这与较低数量的可能的新抗原产生和随后呈现在细胞表面有关。在几种癌症中，低突变负荷与肿瘤对免疫检查点抑制剂的反应降低有关，但其尚不确定是否可以作为预测标记。尽管如此，这意味着免疫检查点抑制剂单药治疗可能无法提高DMG患者迫切需要的生存期。

DMG中H3K27M后最常见的体细胞突变包括TP53、PDGFRA、ACVR1、MYC和PI3K通路成员的突变（图2）。目前尚不清楚这些突变是否会影响DMG的肿瘤微环境。有趣的是，在一些癌症中，TP53功能缺失突变与免疫抑制微环境有关。尽管还需要进一步的研究来确定TP53-诱导的免疫抑制机制，但目前的研究指出，免疫检查点蛋白表达的增加可能使肿瘤对免疫检查点抑制剂敏感。然而，这在DMG中还没有被观察到/报道。

图2. DMG中几种已知的体细胞突变与免疫抑制有关。

32%的DMG患者可出现ACVR1激活突变，并与TGF -βR1通路存在交互。TGFβR1是一种免疫抑制细胞因子TGF-β的受体。与H3.3K27M ACVR1野生型DMG相比，TGFβR1抑制在H3.1K27M ACVR1 G328V突变型DMG中效果较差，这表明ACVR1驱动TGFβR1的一些作用。然而，它在最终免疫抑制中的意义尚不清楚。

磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶（PI3K）信号轴成分的突变是公认的DMG发生的驱动因素。在小鼠模型中，胰腺导管腺癌（PDAC）敲除PIK3CA（PI3K信号的p110α催化亚基）导致T细胞浸润和肿瘤清除；缺乏PIK3CA增加了MHC I和T细胞共刺激物CD80的表达。尽管需要进行验证性研究，但这表明激活的PI3K通路（在大多数DMG中可见）也可能降低肿瘤细胞上MHC I和CD80的表达，使其对免疫系统不可见。此外，PI3K途径的抑制与抗PD-1疗法协同作用，进一步突出了该途径参与了免疫原性。

20%的DMG中癌基因MYC发生改变（H3.3K27M+）。在急性淋巴细胞白血病中，MYC上调PD-L1和CD47，分别保护细胞免受T细胞和巨噬细胞的伤害，鼓励研究靶向这些突变是否会增强DMG对免疫治疗的敏感性。

对DMG中非沉默突变的分析揭示了显著的肿瘤内异质性。这种多样性代表了一个相对未被探索的领域，并提供了一个镜头，通过它我们可以更好地了解这种癌症的侵袭性抗治疗特征。重要的是，DMG的异质性可能预示着通过免疫编辑避免免疫消除；一些细胞获得突变，导致免疫原性降低，使其能够避免消除，并使其保持在平衡的休眠状态。因此，来自适应性免疫系统的压力选择了装备更好的亚克隆，称为免疫选择。这就引出了一个问题，即是否需要联合靶向几种突变/抗原的免疫疗法来规避耐药性。

三、免疫抑制

图3. 皮质激素驱动CTLA-4的表达。

使用皮质类固醇（如常用的地塞米松）控制肿瘤周围炎症也可能有助于免疫逃避。地塞米松已被证明可上调CTLA-4，并阻滞T细胞的细胞周期，与已被抗原激活的T细胞相比，其在幼稚T细胞中的作用更为显著。有趣的是，CTLA-4抑制剂ipilimumab（伊匹单抗）能够在一定程度上逆转这种效应，但PD-1阻断没有效果。皮质类固醇对免疫疗法疗效的影响有矛盾的结果，当低剂量使用时，以及在免疫治疗后使用时，可降低疗效损失。值得注意的是，几乎所有DMG患儿在诊断时都会高剂量使用地塞米松，因此使用体外激活的嵌合抗原受体（CAR）T细胞可能是避免并发皮质类固醇治疗的免疫抑制作用的替代方法。

四、DMG免疫微环境

中枢神经系统在历史上被视为免疫特权部位，几乎没有免疫细胞浸润；然而，这已经被证明是不正确的，因为免疫细胞通过脉络丛、实质和软脑膜血管在中枢神经系统和外周之间传播。

脑干负责协调维持生命的功能，如心脏和呼吸控制以及包括吞咽在内的运动功能，因此在有效保护中枢神经系统免受病原体侵犯（需要免疫监测）和通过免疫反应介导的过度炎症的潜在危害之间存在微妙的平衡。

身体避免过度炎症的一个机制是免疫检查点蛋白。事实上，一名接受免疫检查点抑制剂nivolumab（抗PD-1）治疗的小细胞肺癌患者出现了脑干脑炎，这突出了免疫检查点蛋白在脑干中的重要性。

然而，很少有研究调查健康脑干中的免疫细胞浸润，因此需要确定基线免疫微环境及其在整个病程中的影响。这将揭示DMG中出现的“冷”肿瘤微环境是由肿瘤本身引起的，还是缺乏免疫细胞是脑干的固有状态。

图4. DMG肿瘤微环境中缺乏T细胞浸润、炎症细胞因子表达和免疫检查点蛋白，免疫中性小胶质细胞驻留增加。H3.1K27M DMG通过免疫抑制标记物促进小胶质细胞。

DMG的肿瘤微环境分析显示，与正常脑组织相比，免疫细胞的驻留显著减少，并且缺乏免疫细胞募集所需的趋化因子（图4）。

与成人胶质母细胞瘤以及其他儿童高级别和低级别胶质瘤相比，DMG组织中T细胞标记物CD3的表达显著降低。DMG中缺乏CD3+淋巴细胞可能是由于招募失败所致，因为DMG释放的细胞因子和趋化因子比成人胶质母细胞瘤少得多。与低数量的CD3+细胞一致，DMG尸检的RNA测序和免疫组化显示，大多数DMG几乎没有CD8+T细胞浸润。

相反，与正常组织（大脑皮层）相比，原代DMG组织样本表达的IBA1+巨噬细胞/小胶质细胞水平增加，提示巨噬细胞/小神经胶质细胞在免疫逃逸中的作用。当将DMG小胶质细胞与成人胶质母细胞瘤小胶质细胞进行比较时，DMG表达的炎性因子较少，且不显示M1或M2相关基因的富集。

值得注意的是，当共培养时，H3.1K27M细胞已显示促进免疫抑制因子（包括CD163、CD206和PD-L1）在M0巨噬细胞中的表达，而这在H3.3K27M DMG中未见。总之，H3.1K27M DMG似乎表现出更“冷”的免疫表型，因此，有必要考虑为这些DMG患者开发免疫治疗策略。

与非癌性脑组织相比，DMG也没有显示CD163+细胞（免疫抑制的巨噬细胞的标志物）的增加。这与其他儿童高级别胶质瘤形成对比，再次提示DMG具有相对“冷”的肿瘤微环境。

其他免疫抑制标记物如TIM3、LAG3和TIGIT在DMG中的作用尚未得到彻底研究。

五、血脑屏障

图5. 血脑屏障阻止大多数分子（> 400 - 500 Da）进入大脑。

血脑屏障（blood brain barrier, BBB）将珍贵的脑组织从体循环中分离出来。血脑屏障控制分子运输，防止毒素进入，维持离子稳态，确保低蛋白质环境，分离中枢和外周神经递质池，调节免疫监测和对最小炎症和细胞损伤的反应。

众所周知，与大脑皮层的相同肿瘤相比，脑干DMG显示血脑屏障通透性降低，这突出说明了化疗未能改善预后的原因。

此外，血脑屏障通常允许400-500Da的分子穿过保护层，抗体（包括免疫检查点抑制剂）受大小限制。因此，新型给药方式至关重要。最近，I期临床试验BrainChild-01（NCT03500991）局部局部将Her2特异性CAR-T细胞输送到复发/难治性中枢神经系统肿瘤儿童的肿瘤腔或脑室系统中，并证明了初步的可行性和耐受性。这一经验导致了一项I期试验的开始，BrainChild-03（NCT04185038），将B7 - H3-特异性CAR - T细胞输送到DMG儿童的脑室系统中，初步结果很有希望。

此外，由于诊断为DMG的患者经常接受放疗，这对血脑屏障的影响是很重要的。关于辐射如何影响血脑屏障的研究显示了不同的结果；大多数研究表明，辐射后血脑屏障的通透性会增加。肿瘤的大小、放射线的量和同步治疗的时间似乎都影响血脑屏障通透性的改变。通透性的增加很可能是由组成血脑屏障的细胞的直接损伤以及随后炎症和氧化应激的增加引起的。不幸的是，这种通透性的增加并没有使化疗药物更好地进入中枢神经系统，这强调了需要进一步研究以阐明辐射如何改变血脑屏障通透性及其在药物传递中的意义。另一方面，放射治疗与免疫治疗联合应用于DMG和其他中枢神经系统恶性肿瘤均有阳性结果。

考虑到DMG患者的表观遗传、体细胞突变、非炎症性微环境和肾上腺功能受损，以及血脑屏障，研究人员在制定有效的改善预后的免疫治疗策略方面面临着一场艰苦的战斗。

参考文献：Persson ML, et al. Neuro Oncol. 2022;24(9):1408-1422.

敬请注意：本文仅供相关专业人员学习参考之用，文中的所有信息均不作为诊断和治疗疾病的依据。如出现文中描述的症状，请及时就医。另外，本文仅节选原文的一部分，内容可能不完整或与原文存在偏差，若需更完整的信息请参阅原文。

撰 稿：盖菁菁

审 校：张俊平

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