科研丨东南大学: 土壤导致小鼠肠道微生物群大量增殖以及血清总IgE水平降低(国人佳作)

编译：微科盟阿Z，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读   传统的农场环境能预防过敏性疾病。本研究将农场环境因素分为三类：环境微生物、土壤和有机质。为了探索土壤和环境微生物对肠道微生物群和免疫功能的影响，给小鼠饲喂灭菌土壤、土壤微生物或未灭菌土壤。宏基因组测序结果显示，摄入灭菌土壤(即吸入少量空气中的土壤微生物)增加了肠道微生物多样性和III型分泌系统(T3SS)基因的丰度，并降低了2,4-二硝基氟苯(DNFB)诱导的总血清IgE水平。土壤微生物的摄入增加了短链脂肪酸代谢和氨基酸生物合成相关基因的丰度。相比之下，土壤的摄入增加了肠道微生物多样性、T3SS基因及相关感染因子、短链脂肪酸代谢和氨基酸生物合成相关基因的丰度，降低了血清IgE水平。免疫功能与细菌分泌系统基因(尤其是与T3SS基因)呈显著正相关。综上所述，农场环境对过敏性疾病发挥保护作用的一个重要机制可能是作为“益生元”，促进一些含有细菌分泌系统基因的肠道微生物的繁殖和生长，尤其是含有T3SS基因的微生物，其丰度与小鼠的先天免疫功能呈显著正相关。    

论文ID

原名：Soil causes gut microbiota to flourish and total serum IgE levels to decrease in mice

译名：土壤导致小鼠肠道微生物群大量增殖以及血清总IgE水平降低

期刊：Environmental Microbiology

IF：5.476

发表时间：2022.3

通讯作者：周东蕊

通讯作者单位：东南大学儿童发展与学习科学教育部重点实验室

DOI号：10.1111/1462-2920.15979  

实验设计

结果

1 摄入土壤或灭菌土壤增加了肠道微生物多样性和丰富度

如图1所示，处理四组小鼠42天。收集小鼠的新鲜粪便样本(图S1)，并使用高通量测序分析肠道微生物群。我们使用515F-907R引物组通过对V4高变区进行PCR扩增，对粪便样本进行16S rDNA测序。微生物多样性或丰富度每增加四分之一，过敏性疾病的风险就会降低55%。共鉴定出1,921,486条序列，每个样本的平均序列为50,565个。我们使用稀疏法将操作分类单元(OTU)表中每个样本的reads数标准化为38680个序列，并分析各组肠道微生物群的多样性。稀疏曲线显示，Soil组和SS组的微生物多样性相似，高于MW组和Control组，这两组的微生物多样性相似。 如图1B和表S4所示，SS组的OTUs数量显著高于MW组或Control组(P<0.05)，但低于Soil组(P<0.05)。MW组和Control组之间没有显著差异。当使用Chao1指数估算丰富度时也得到了类似的结果(表S4和图1C)。然而，SS组和Soil组之间的Shannon指数没有显著差异(表S4和图1D)。从这个角度来看，摄入灭菌土壤显著提高了小鼠肠道微生物的多样性和丰富度，达到了与Soil组相似的水平。然而，当只摄入从土壤中分离的微生物时，肠道微生物群的多样性或丰富度均未发生显著变化。

图1 小鼠分组和实验处理的示意图，以及四个实验组小鼠的丰富度和多样性。A. Control：实验对照组小鼠；MW：喂食含有土壤微生物的饮用水的小鼠(表S2)；SS：喂食含有灭菌土壤饮食的小鼠(表S3)；Soil：喂食含有未灭菌土壤饮食的小鼠。Control组、MW组和SS组小鼠被安置在同一个SPF室。所有的鼠笼都覆盖着金属丝网，这使得微生物可以从MW鼠笼中扩散。Control组和SS组小鼠从MW组小鼠的笼子中吸入微生物。Soil组小鼠被安置在不同的SPF动物室内。四组小鼠的饮食、年龄、巢穴、照明、清洁度、室内温度和湿度都是一致的。B. 97%阈值下特有操作分类单元(OTUs)的箱型图。C. Chao1估计值。D. Shannon指数(n=9或10；*P<0.05，**P<0.01，双尾最小显著性差异检验)。

表1 影响肠道微生物群的农场环境因素总结。

2 肠道微生物组成的变化

未加权UniFrac距离矩阵的主坐标分析(PCoA)显示各组小鼠之间存在明显差异。具体而言，SS组和Soil组小鼠的肠道微生物结构相似，而MW组和Control组小鼠的肠道微生物结构相似(图2A)。还可以看出，SS组和Soil组之间的距离最短，其次是Control组和MW组之间的距离(图2B，表S5)。MW组和Soil组之间的距离最长。此外，宏基因组序列的Bray-Curtis矩阵的PCoA与16S rRNA基因序列的PCoA相似(图2C和D，以及表S5)。 使用RDP分类器鉴定了基于16S rDNA序列的最丰富的属。四个组中前20个最丰富属的组成存在明显差异(图2E和表S6)。Control组的饼图与MW组的饼图更相似，而SS组的饼图与Soil组的饼图更相似。使用前五个最丰富的门中每个门的属丰度/类型(图S2)和不同组间的物种丰度/类型结果(图S3)得出了相同的结论(图2F-I)。 随机森林是一种有监督的机器学习技术，它使用多个决策树来训练和预测样本。它是一个强大的分类器，可以利用OTUs/菌株之间的非线性关系和复杂依赖性来识别对微生物群结构构成很重要的OTUs/菌株。根据从预测集中删除该OTU/菌株所导致的误差增加，为每个OTU/菌株分配一个重要性分数。在本研究中，我们认为OTU的重要性得分至少为0.0005才具有高度预测性。SS组和SPF组在物种水平上有67个预测性OTUs，其中55个(82%)在SS组中过表达(表7)。然而，MW组和SPF组之间有36个预测性OTUs，MW组中只有25个OTUs(69%)过表达(表S7)。相应地，对Soil和SPF组的分析表明，有74个预测OTUs，其中Soil组的OTUs增加了63个(85%)(表S7)。有趣的是，与MW组相比，Soil组和SS组的预测OTUs分别为64和49个，其中54个(84%)在Soil组中过表达，41个在SS组中过表达(表S7)。 基于微生物宏基因组鸟枪法测序的菌株随机森林分析结果与上述16S rDNA测序分析结果相似(图S4和表S8)。表S8中列出的菌株符合两个标准；第一，该菌株的随机森林重要性得分至少为0.001，第二，t检验的p值小于0.05。与Control组小鼠相比，Soil组小鼠有128个预测物种，SS组小鼠有108个，MW组小鼠有52个，分别过表达96、85和47种微生物(图S4A和表S8)。 基于这些结果，我们得出结论，摄入土壤分离的微生物、灭菌土壤或农场土壤都会对小鼠的肠道微生物结构和组成产生影响。食用灭菌土壤的效果与Soil组更相似，而摄入土壤微生物的效果与Control组更相似。

图2 肠道微生物群落的变化。A. 16S rRNA基因测序的未加权UniFrac距离的主坐标分析(PCoA)。B. 每个条形代表平均值±SEM(n=9或10)。C. 宏基因组鸟枪法测序序列的未加权Bray-Curtis矩阵的PCoA。D.每个条形代表平均值±SEM(n=5)。E. 前20个最丰富属的饼状图。根据双尾最小显著性差异检验，*P<0.05，**P<0.01。F-I. 通过肠道菌群16S rDNA序列分类的相对丰度有明显差异的物种。土壤和SS组小鼠(F, G)以及MW组小鼠和对照组小鼠(H, I)中富含菌株。Control：实验对照组小鼠；MW：喂食含有土壤微生物的饮用水的小鼠(表S2)；SS：喂食含有灭菌土壤饮食的小鼠(表S3)；Soil：喂食含有未灭菌土壤饮食的小鼠。

3 摄入灭菌土壤增加了III型分泌系统(T3SS)基因的丰度

为了进一步了解摄入土壤或摄入土壤微生物影响小鼠肠道微生物群的机制，使用宏基因组鸟枪法测序序列数据对微生物种类和基因进行了分析。为了探索它们的生物学相关性，我们根据t检验分析选择了实验组之间存在显著差异且重要性得分超过0.001的微生物物种(表S8)。经确定，62.7-89.8%所选微生物的生物学功能之前尚未报道(图3B，表S8)。在所选物种中，有四种具有已报告的功能。一种是工程菌，第二种是产生抗生素的微生物，第三种是对小鼠以外的植物或动物致病的微生物，第四种是小鼠病原体(图3B、C，表S8)。与Control组小鼠相比，SS组和Soil组小鼠的肠道微生物群中小鼠病原体更为丰富(图3和表S8)，而MW组小鼠的小鼠病原体数量不多，但其他四种类型的微生物更多(图S4B和表S8)。 当比较各组间功能基因的丰度时，发现与Control组或MW小鼠相比，SS组编码T3SS和双组分系统的基因丰度显著增加(图4和表S9)。与MW组小鼠相比，Soil组小鼠含有更多编码T3SS(图S5)、双组分系统和丁酸代谢的基因(图4和表S9)。因此，摄入土壤或灭菌土壤会增加小鼠病原体和其他病原体的丰度，以及编码T3SS和双组分系统的基因。

图3 通过基于鸟枪发测序的随机森林分析确定的物种，在每两组小鼠的粪便微生物群中表现出显著差异。A. 过表达物种数量的柱状图。B. 过表达物种比例和每种功能微生物百分比的饼图。C. 灭菌土壤摄入对肠道微生物宏基因组物种影响的热图。每种颜色特征代表相同的功能微生物种类(n=5/组)。

图4 无菌土壤摄入对肠道微生物宏基因组基因丰度的影响。 A. 热图，SS和Control组、SS和MW组、Soil组和MW组的比较(n=5/组)。 B和C.京都基因与基因组百科全书(KEGG) III型细菌分泌系统条目图。 与Control或MW小鼠相比，SS小鼠和Soil小鼠粪便微生物群比例较高的KEGG条目。 突出显示的Kos的P值可在表S9中找到。 处理组包括在饮食中添加土壤(Soil)或在饮食中添加灭菌土壤(SS)或在饮用水中添加土壤微生物(MW)的小鼠。 未经处理的小鼠作为Control组。 

4 土壤微生物的摄入增加了SCFA代谢和氨基酸生物合成基因的丰度

与Control组小鼠相比，MW组小鼠在短链脂肪酸代谢中使用的酶基因的丰度增加(图S4A和表S9)，包括丁酸、丙酸和乙酸，以及参与氨基酸生物合成的基因丰度增加。与SS组小鼠相比，Soil组小鼠表现出类似的差异(图S4B和表S9)。 Soil组小鼠摄入与SS组小鼠相同的土壤，但土壤中的微生物仍保留在Soil组中。与Control组相比，Soil组小鼠不仅表现出T3SS和双组分系统的基因丰度增加，而且短链脂肪酸代谢和氨基酸合成的基因丰度也增加(图S6)。此外，在Soil组小鼠中，鞭毛组装(图S7)和细菌趋化性(图S8)的基因丰度，以及短链脂肪酸代谢(图S9)和氨基酸生物合成的额外基因丰度也增加了(图S6)。

土壤微生物的摄入在增加短链脂肪酸代谢和氨基酸生物合成相关基因的丰度方面发挥了重要作用。除了通过摄入土壤微生物或灭菌土壤诱导的共同功能外，摄入含有微生物的土壤除了增加相对丰度外，还促进了更多不同功能基因的萌发。 

5 摄入土壤或灭菌土壤降低血清IgE水平

为了分析摄入土壤、灭菌土壤和含土壤微生物饮水对小鼠免疫功能的影响，我们使用DNFB刺激四个实验组小鼠皮肤上的湿疹，然后测量血清IgE水平。结果显示，Soil组和SS组小鼠的血清IgE水平显著低于Control组小鼠(P<0.05)。此外，Soil组小鼠的血清IgE水平显著低于MW组小鼠(P<0.05；图5A)。虽然SS组的中位IgE值低于MW组，但差异无统计学意义(图5A)。对小鼠的皮肤损伤也进行了评分。Soil组和SS组的皮肤损伤评分显著低于Control组和MW组(P<0.05)，但Soil组和SS组之间或MW组和Control组之间没有显著差异(图5B)。 Soil组和SS组小鼠病原体和T3SS基因数量显著增加。为了确定这些病原体是否导致感染，对血液样本进行了血液学分析。结果显示没有感染迹象(表S10)。 为了进一步探索哪种菌株或基因与当时小鼠的免疫功能增强有关，我们进行了IgE水平与高通量测序检测到的菌株或功能基因之间的相关性分析(图5C、D和表S12)。 结果表明，具有显著相关性的微生物包括贝母病毒Y和土壤细菌 Burkholderia glumae 等(图S10和表S11)。 这些微生物在小鼠体内的重要性尚未报道，也没有任何关于它们对免疫的影响的报道。 功能基因的显著相关性包括6个T3SS基因和6个代谢途径基因(图S11和表S12)。 T3SS基因来自同一细胞器官，共同发挥促进细菌感染的功能。 因此，这些T3SS编码基因与IgE水平的关系可能比代谢途径的基因更为密切。 在京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库中登记了76个细菌分泌系统的基因，本研究对其中43个(56.6%)进行了测序。如表S13所示，Soil组中的15个(34.9%)基因和SS组中的18个(41.9%)基因显著高于Control组(P<0.05)。MW组中仅观察到三个基因的丰度高于Control组。Soil组的11个(25.6%)基因和SS组的9个(20.9%)基因比MW组更丰富。

综上，结果表明摄入土壤或灭菌土壤可以提高小鼠的免疫功能，并且不会引起明显的感染。免疫功能与细菌分泌系统基因呈正相关，其中与T3SS的正相关最为明显。

图5 摄入土壤、灭菌土壤或土壤微生物对免疫功能的影响。用2,4-二硝基氟苯(DNFB)处理的小鼠的总血清IgE水平(A)和皮肤损伤(B)。(根据双尾最小显著性差异检验，n=9或10/组；*P<0.05，**P<0.01)。(C)血清IgE水平与物种丰度之间的Spearman相关性。(D)血清IgE水平与功能基因丰度之间的相关性。x轴为物种ID或功能基因，y轴为相关系数。方框表示5种微生物和17种显著差异基因及其相关系数。    

讨论

为了探索农场环境中影响过敏性疾病防护的具体因素，我们给小鼠喂食农场土壤、消毒土壤和土壤微生物。结果表明，摄入灭菌土壤显著增加了肠道微生物的多样性和T3SS基因的丰度，并降低了DNFB诱导的血清IgE水平。土壤微生物的摄入增加了短链脂肪酸代谢和氨基酸生物合成的基因丰度。土壤(包括灭菌土壤和土壤微生物的成分)的摄入不仅增加了T3SS基因和相关感染因子在肠道微生物群中的丰度，还显著增加了与短链脂肪酸代谢和氨基酸生物合成相关的基因丰度。摄入土壤或灭菌土壤可显著提高小鼠的免疫功能，且不会引起明显感染。免疫功能与细菌分泌系统基因(尤其与T3SS)呈显著正相关。 根据本研究的结果，土壤在支持小鼠体内某些肠道微生物的存活方面发挥了重要作用。在没有土壤的情况下，只摄入土壤微生物会导致肠道微生物多样性和结构的变化，但变化水平明显低于摄入土壤或灭菌土壤的小鼠。因此，土壤可能对各种微生物菌株起到“益生元”的作用，或者可能是必要的，来建立它们生存所需的物理环境。土壤有不同的功能方式：(1)土壤是一种用于许多肠道微生物生存的矿物质。众所周知，土壤中含有丰富的微生物，其数量是人类肠道微生物数量的10倍。(2)土壤作为一种多孔隙结构，可能为微生物的生存提供物理环境。有些微生物隐藏在土壤颗粒中，这可能有助于它们避免被肠道中的抗生素等微生物产物或人体分泌的抗菌肽或IgA等杀菌剂杀死。 在通过空气接种微生物的条件下，摄入灭菌土壤增加了小鼠肠道微生物群的多样性。我们之前的研究发现，在SPF动物设施中，向小鼠垫料中添加消毒土壤会改变小鼠肠道微生物群的组成，但不会增加肠道微生物的多样性。在本研究中，实验设计是让SS组小鼠与MW组小鼠一起饲养，MW组小鼠通过饮水来摄取土壤微生物。开放式鼠笼无法阻止土壤微生物向SS组小鼠传播。结果表明SS组小鼠肠道微生物多样性增加。 在本研究中，与Control组小鼠相比，喂食土壤微生物的小鼠的免疫功能没有显著差异。此外，土壤微生物的摄入显著增加了短链脂肪酸代谢和氨基酸生物合成相关基因的丰度。短链脂肪酸在提高人体免疫力方面发挥作用。此外，一些报道表明，常驻和流动微生物都可以提高小鼠的免疫功能。在摄入土壤微生物的过程中，许多细菌会通过肠道，理论上，这会刺激小鼠的免疫系统并增强其免疫功能。可能有两个原因来解释我们当前的结果：(1)Control组和MW组在同一SPF动物设施中饲养。小鼠笼盖呈网状结构，土壤微生物从MW组小鼠的笼中扩散到Control组小鼠，使Control组小鼠的免疫功能增强；(2)我们仅评估了DNFB免疫刺激后小鼠的血清IgE水平，可能未检测到其他免疫变化。 在SS组和Soil组小鼠中均检测到致病微生物和T3SS基因，并且在Soil组小鼠中鞭毛组装基因丰富(表S9和图S6)。然而，在任何受试动物的血液中均未检测到感染，这可能是由于以下原因造成的：(1)感染发生在实验早期，在我们测试小鼠血液时已解决；(2)感染较弱，未能呈现临床表型。实验期间未观察到感染或死亡。在进化过程中，小鼠很可能与土壤保持良好的相互作用，或者在选定的土壤中可能根本没有强毒性致病菌。 本研究结果还表明，IgE水平与T3SS基因的丰度之间存在很强的相关性。T3SS存在于多种动植物病原体中，包括衣原体(Chlamydia spp.)。T3SS帮助病原微生物与宿主细胞建立接触，并在重塑宿主细胞骨架、宿主免疫反应和肠粘膜免疫中发挥作用。此外，T3SS也存在于植物根瘤菌中，并在与宿主细胞建立共生关系中发挥关键作用。T3SS的致病机制已被广泛报道，但其改善宿主免疫功能的机制尚需进一步研究。本研究采用小鼠模型进行研究，但人类和小鼠之间在生活方式和进化关系上存在巨大差异。因此，土壤对人体肠道菌群的影响可能有所不同，需要更多的实验证明。

结论

本研究的结果表明，农场环境对过敏性疾病具有保护作用的一个重要原因是，土壤可以作为“益生元”来增加肠道微生物群的多样性和丰富度，并促进含有细菌分泌系统基因的微生物的繁殖和生长。进一步的机理研究表明，土壤主要通过增加肠道菌群细菌分泌系统(尤其是T3SS)的基因丰度来改善小鼠的自然免疫功能。