【论肿道麻】BJC：液体活检用于监测和指导结直肠癌的治疗

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是世界上最常见且致命的癌症之一。尽管近年来在CRC的治疗和预防方面有所进展，但目前大多数治疗方案都会影响患者生活质量，使用时需权衡利弊。最近着力在CRC患者的多学科和分子治疗方面识别有效的生物标记物，从而开展个体化治疗。目前，从肿瘤核心部位取样活检是识别此类生物标记物的金标准取样方法，但技术可行性、肿瘤异质性和癌症演变限制了此方法的应用。循环肿瘤DNA（ctDNA）的基因分型可能突破上述局限。回顾性研究表明，ctDNA能够识别手术后和辅助治疗后的微小残留疾病，以及发现可用于转移性疾病定制治疗的药物分子位点的改变。这篇综述总结了ctDNA适用于CRC的现有证据，并回顾了正在进行的临床试验，评估液体活检如何用于指导局部、局部晚期和转移性CRC的治疗选择，并讨论了液体活检的广泛应用可以改变CRC患者的管理。

介绍

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球排名第三最常见和第二致命的癌症，占新发病例的10.2%，占癌症相关死亡的9.2%。初次诊断后5年的总生存率（overall survival, OS）从I-II期的87-90%到III期的68-72%，在IV期转移性CRC（metastatic CRC, mCRC）中降至11-14%。如今，结直肠癌的治疗策略主要根据癌症分期、患者状态和分子特征（手术标本或肿瘤核心组织活检测定RAS、BRAF、ERBB2和错配修复（mismatch repair, MMR））来制定。此外，在CRC和其他恶性肿瘤中还发现了新的分子生物标记物，如NTRK1-3易位和高肿瘤突变负荷（high tumour mutational burden, TMB）。在II期和III期CRC中，除了微卫星不稳定性（microsatellite instability, MSI）外，仍缺乏有效的生物标志物来识别更可能受益于辅助性细胞毒疗法的患者。对于转移性肿瘤行手术切除术后，尽管缺乏判断预后的生物标志物，通常仍会进行术后治疗。迄今为止，所有用于临床决策的分子分析都是基于肿瘤核心组织活检，这也是当前临床指南推荐的金标准。然而，单个实体组织检查受肿瘤的时空异质性和技术可行性问题等局限。因此，液体活检（liquid biopsy, LB）作为克服上述局限性的一种具有补充性和潜在替代性的无创检测方法日益受到重视。  

液体活检，定义为从血液或其他体液（如尿液、唾液、粪便或脑脊液）中收集肿瘤来源的生物标记物。ctDNA、循环肿瘤细胞（circulating tumour cells, CTC）和外泌体是迄今为止液体活检中最常见的肿瘤相关生物标记物。其中，从患者血液中分离DNA片段的ctDNA分析已经显示出捕获CRC分子复杂性的潜力，并具有创伤性最小和周转时间快的技术优势。对非转移性和转移性CRC的ctDNA监测可用以指导实时肿瘤相关基因组变化的评估和治疗选择。尤其是在mCRC中，ctDNA的全面性可以取代实体肿瘤组织活检，成为高负荷疾病更准确的检测工具。鉴于ctDNA在所有疾病阶段都有很好的回顾性数据，现有研究正致力于验证针对ctDNA进行干预在推动治疗决策方面的作用，以指导临床实践。

CRC中的循环肿瘤DNA

CRC是血液中ctDNA含量最高的实体肿瘤之一。但由于受到原发肿瘤和转移瘤位置等多种变量的影响，ctDNA和循环游离DNA（cfDNA）之间的比率可能在1%以下和40%以上之间变化很大，因此ctDNA的检测方法需要较高的敏感性和特异性。现有的应用于检测ctDNA的方法在灵敏度和特异性方面稳步提高。目前，基于高分辨率PCR技术，如BEAMing，灵敏度和特异度极高，但该技术只能检测少数基因座，而下一代测序（next-generation sequencing, NGS）可以捕获全谱的遗传改变，包括单核苷酸变异（SNV）、拷贝数变异和染色体重排，这取决于测序库和所利用的生物信息学工具。全基因组测序（Single Nucleotide Variants, WGS）可以进一步拓宽基因组分析，但成本较高，灵敏度较低。此外，Cristiano及其同事开发了一种方法，将癌症患者基因组中无细胞DNA的高片段模式与基于突变的无细胞DNA分析相结合，用于检测CRC的敏感性和特异性分别为81%和95%。这种综合方法证明了cfDNA中的WGS可用于癌症的筛查、早期检测和监测。鉴于ctDNA的潜在临床实用性和技术适用性的改进，通过液体活检分离ctDNA已成为改进CRC患者治疗方法的潜在工具（图1）。

图1：介入性液体活检可指导CRC的治疗决策  

结直肠癌筛查与诊断

多年前科研人员就提出了利用来自癌细胞的cfDNA作为无创的筛选技术。与健康对照组相比，CRC患者血液中的突变DNA水平更高。但对微小侵袭性癌症或癌前病变的次优检测限值限制其在临床上的广泛应用。此外，由于筛查时没有关于癌症突变特征的信息，因此需要对CRC频繁突变的基因组进行验证以达到可接受的敏感性，即使这种方法会增加因克隆造血等原因导致假阳性结果的风险。将已知的癌症蛋白质生物标记物与突变组相关联可以突破这一限制，如在CancerSEEK研究中，研究人员整合了16个基因（1933个位点）和血浆中的8个蛋白质生物标记物的突变，可以较好地识别8种常见癌症类型。该试验筛查CRC的敏感性仅为60%左右，但特异性大于99%，是多癌筛查的较好方法。

为了避免假阳性结果带来的限制，许多筛查方法将重点放在癌症基因组的特定特征上，以用作生物标记物。方法之一是研究癌症基因组的甲基化模式，与来自健康细胞的DNA进行比较。此法涉及对单个基因的评估，如FDA批准的EpiproColon试验，使用Septin9基因甲基化的敏感性和特异性分别为68-72%和80-82%；ColoSure试验表明波形蛋白甲基化状态具有较好的诊断准确性。此外，GRAIL在Streat研究（NCT03085888）中利用靶向亚硫酸氢盐测序结合机器学习预测与癌症相关的甲基化模式来评估数千个甲基化序列，以识别包括CRC在内的12种肿瘤的ctDNA，敏感性为60-73%，特异性大于98%。另一种检测癌症特异性循环DNA的方法依赖于DNA片段长度的分析（即片段组学），此法在识别包括CRC在内的七种常见癌症类型方面具有重要价值。LUNAR-2研究通过检测ctDNA甲基化和片段化筛查I-II期肿瘤的敏感性和特异性分别为88%和94%。  

有研究者提出，分析粪便中的cfDNA是提高无创的粪便免疫组织化学试验（faecal immunohistochemical test, FIT）敏感性的另一种方法，尤其是在早期肿瘤阶段和癌前病变中，传统粪便试验的敏感性较低。具体而言，在一项多靶点粪便DNA检测的随机临床试验中，检测CRC与FIT的敏感性从74%提高到92%，同时，伴有高度异型增生的息肉检出率也从46%大幅提高到69%，尽管粪便DNA检测的假阳性率高于FIT。总的来说，尽管使用cfDNA进行CRC筛查具有一定价值且成本越来越便宜，但现在断言其在临床上的最佳应用时机还为时过早。因此，根据现有数据，cfDNA分析只能在经过临床验证的筛查工具上进行。

有治疗目的的术后切除术

手术是对局部、局部晚期和少转移性结直肠癌患者的主要治疗方法。在这些患者中，术后血液中ctDNA的存在可以确定是否存在最小残留病灶（minimal residual disease, MRD），该病灶在放射成像中不可见，在概念上与血液学中的MRD相似。

局部和局部晚期肿瘤患者的术后液体活检

一项重要的回顾性研究表明，在治疗性手术后短时间内的液体活检阳性预示着几乎所有病例均在2年内发生肿瘤复发（图1）。十多年前，Diehl及其同事首次证明，在II-IV期结直肠癌患者中，接受治疗性手术后，ctDNA中位数在不到一天的时间内下降了97%，在10天内下降了99%。相反，如果不能达到预期的治愈性切除，ctDNA水平的下降幅度则要小得多或增加得多。此后，其他研究证实，ctDNA能够预测局部（I-III期）或少转移性CRC患者的术后复发。  

在高危II期（T4）和III期CRC患者中，ctDNA的预后作用尤其显著。到目前为止，由于缺乏真正的预测性标志物，这些患者的标准治疗（standard of care, SoC）是以氟嘧啶±草酸铂为基础的方案，尽管事实上约50%的病例仅通过手术治愈，而化疗提供的净生存优势相对较小分别约为3-5%和10-15%。过去几年存在的问题是：ctDNA能否安全地挑选出术后MRD需要接受辅助治疗的患者，同时对仅通过手术治疗就已经到达无病生存的患者减少治疗和毒副作用？在未经治疗的II期CRC患者中，ctDNA阳性确实预测了更高的复发风险。此外，在相同的临床背景下，在接受辅助治疗的患者中，ctDNA阳性也与更差的无复发生存率（relapse-free survival, RFS）相关。后来，同一研究团队证明，在III期患者中，ctDNA阳性也能显著预测术后和辅助治疗后的疾病复发。对纳入IDEA试验的805名辅助化疗治疗的III期患者进行回顾性分析表明，与阴性患者相比，ctDNA阳性患者的2年无病生存率（disease-free survival, DFS）更差（64% vs 84%，HR 1.75 95%CI 1.25–2.45）。此外，即使调整了临床病理风险因素，局部和局部晚期结直肠癌手术后的ctDNA阳性率与RFS更差独立相关。2022年ASCO胃肠道癌症研讨会上，GALAXY研究证实了ctDNA在1500多例不同分期的手术切除后的CRC肿瘤患者中的预测价值。Kotaka等人还证明，术后4至12周动态测定ctDNA在“阳性到阴性”与“阳性到阳性”的患者DFS发生率存在显著差异（HR 15.8；95%可信区间5.7–44.2）。更有趣的是，他们发现，在ctDNA阳性患者中，辅助治疗改善了II、III和IV期6个月和12个月的DFS，而对ctDNA阴性患者没有提供任何DFS优势（HR 1.3；95%可信区间0.5–3.6）。最后，在II期CRC辅助治疗中，ctDNA旨在减少过度治疗以达到最佳成本效益。

少转移性肿瘤患者的术后液体活检

在选定的IV期少转移患者中，可以对转移灶进行手术切除以达到治疗目的。ctDNA在此类患者中具有与上述非转移性肿瘤中相当的预测作用。Diehl及其同事首次报告了ctDNA检测对20例接受部分肝切除术治疗的肝内局限转移患者的预测潜力。其中，16例术后ctDNA阳性，除1例外，其余均复发，而ctDNA阴性的患者则无复发。最近，Tie等人证明，接受手术切除的单纯肝转移患者中，ctDNA阳性者RFS较低。值得注意的是，在接受术后治疗的3名患者中，有2名患者实现了ctDNA清除，支持术后治疗的有效性。  

尽管有大量回顾性证据表明，ctDNA是根治性切除的I-IV期结直肠癌患者肿瘤复发的潜在预测标志物，但其实际临床益处尚未在前瞻性干预试验中得到证实。我们使用ClinicalTrial.gov检索了旨在验证血浆ctDNA评估是否可用于干预性治疗CRC患者的临床试验。正在进行的PEGASUS试验中，140名高危II期和III期MSS患者在手术后一个月内接受ctDNA筛查，根据结果调整辅助治疗的强度（NCT04259944）。ctDNA阴性患者接受卡培他滨单药治疗，阳性患者接受CAPOX治疗3个月。在LB阴性臂中，使用一系列间隔很短的ctDNA评估来最大限度地降低假阴性的风险，以便在必要时快速升级到CAPOX。在LB阳性臂患者中，在卡培他滨加奥沙利铂（CAPOX方案）治疗的第三个月末再次进行ctDNA活检，若为阴性，则使用卡培他滨降低至维持期，如果仍然呈阳性，则改为5-氟尿嘧啶加伊立替康（FOLFIRI方案），这是在对辅助治疗耐药的情况下的SoC联合治疗。此外，ALTAIR（NCT04457297）试验正在研究三氟尿苷/替吡拉西与安慰剂在II-IV期切除的ctDNA阳性CRC患者中的作用，而VEGA（jRCT1031200006）研究旨在评估ctDNA阴性患者仅实行手术治疗是否不劣于辅助性卡培他滨加奥沙利铂（CAPOX）。其他试验如MEDOCC CrEATE、DYNAMIC-II和COBRA等都将重点放在II期结直肠癌患者上，以评估ctDNA在推动治疗决策中的作用。相反，在III期CRC中，DYNAMIC-III（ACTRN12617001566325）试验旨在评估基于ctDNA的治疗升级策略在RFS方面是否优于标准治疗。总的来说，目前正在进行多项研究试图通过不同的试验策略和设计，前瞻性地评估ctDNA在I-III期结直肠癌中的干预作用。如图1左上框所示，除了肿瘤分期和切缘状态等主要临床病理变量外，ctDNA可能会显著影响未来的术后治疗算法。事实上，血浆中没有ctDNA的根治性切除的CRC患者可能不会接受辅助治疗，而那些ctDNA阳性的患者将有可能接受辅助治疗或更密集的治疗方案。此外，当这些研究的结果可用时，对此类研究的荟萃分析将有助于得出可靠且可能改变临床实践的结论。

局部晚期直肠癌（locally advanced rectal cancer, LARC）的新辅助治疗

目前关于腹膜反折以下局部晚期直肠癌（locally advanced rectal cancer, LARC）的治疗共识包括新辅助放化疗（chemoradiotherapy, CRT）的多模式治疗。LARC的术前治疗需要详细的治疗前和治疗后疾病分期，这有助于降低局部和远处复发的风险，但并未显著改变生存机会。  

最近几项随机试验表明，作为全新辅助治疗（total neoadjuvant treatment, TNT）策略的一部分，术前强化化疗可使常规新辅助放化疗获得的病理完全反应（pathological complete response, pCR）率翻倍（25 vs 12%）。pCR率翻倍表明，更多病例可通过采取TNT策略，无需进行手术，这为更安全地实行无手术“观察和等待”方法奠定了基础。在研究术前或术后液体活检的研究中，ctDNA阳性与极高的复发风险和生存期缩短相关，大多数研究结果中危险比为两位数。Tie及其同事发现，在159名术前和术后检测到ctDNA的患者中，有13名和19名患者的复发率明显较高，危险比（HR）分别为6.6和13。同样，在GEMCAD 1402试验中72名接受TNT治疗的患者队列中，术前ctDNA检测到15%的MRD，并且与较短的DFS（HR 4；P=0.033）和OS（HR 23；P<0.0001）显著相关。在另一项研究中，17名ctDNA阴性患者的切缘阴性、淋巴结阴性切除率比9名术前ctDNA阳性患者显著增加一倍（88 vs 44%；P=0.007）。  

值得注意的是，其他研究转而关注LB在新辅助治疗期间监测早期反应方面的作用，在术前治疗结束之前、期间和之后进行顺序取样。Khakoo等人研究发现，术前CRT后的ctDNA阳性与原发肿瘤消退相关。在同一项研究中，在任何时间点（CRT前、CRT中或CRT后）ctDNA阳性与更短的无转移生存期（metastasis-free survival, MFS）相关，为新辅助治疗期间的早期预后评估奠定了基础。其他研究发现，CRT后、术前ctDNA阳性率与手术后病理特征（如病理性ypT分期、肿瘤消退分级和pCR率）之间存在相关性。另一方面，在接受TNT治疗的患者中，术前ctDNA阳性与病理反应之间未发现相关性，可能与研究所用方法敏感性过高有关。此外，目前正在进行的一项试验（NCT04842006）前瞻性地研究在LARC中TNT后ctDNA在确定佐剂方法中的作用。如图1右上框所示，通过影像学和内窥镜检查评估，在新辅助多模式CRT后获得接近临床完全反应（clinical complete response, cCR）或cCR的患者中，ctDNA可能在决定是否进行治疗性手术中发挥关键作用。

不能切除的晚期肿瘤

大量研究关注了LB在无法切除的转移性结直肠癌患者中的应用。其中第一个重要发现是，在绝大多数情况下，使用ctDNA与组织样本分析的进行肿瘤分子检测的结果一致。对106名mCRC患者的研究显示，通过等位基因特异性定量PCR进行的ctDNA分析在捕获BRAFV600E突变方面达到了100%的特异性和敏感性，在检测六个KRAS点突变时（G12A、G12C、G12D、G12S、G12V、G13D）的特异性和敏感性分别达到98%和92%。同样，在100名mCRC患者中，血浆样本中KRAS、BRAF和NRAS的突变状态在捕获实体组织和血液之间的“RAS途径突变”方面达到97%的一致性。在这两项研究和其他研究中，不一致的样本与继发于肿瘤内病变间异质性、先前治疗和/或低疾病负担的真实生物学差异有关。液体活检还有一个额外的优势，即ctDNA可捕获多个基因中发生的改变，特别是EGFR、ERBB2、PIK3CA或MAP2K1，揭示了新的潜在治疗靶点以及抗EGFR、抗BRAF和抗HER2药物等SoC靶向治疗的耐药机制。此外，最近一项研究发现，对结直肠癌患者的实体瘤组织和ctDNA均进行基因分型，仅考虑克隆改变时，整体高一致性（84.9–100.0%）增加到接近100%（97.0–100.0%）（图1）。通过GI-SCREEN网络，同一研究团队发现，ctDNA基因分型显著缩短了生物标志物评估的周转时间（标准病理评估时间3天 vs.11天），并提高了靶向药物试验的筛选入组效率（入组率4.1% vs. 9.5%）。同样，针对不同实体瘤（包括结直肠癌患者）进行的靶向研究表明，ctDNA可以提高患者的早期临床试验入组率。  

尽管CTCs的分离和分析可能为研究CRC基因组的完整性提供机会，但它并非研究具有潜在生物学价值的DNA小片段，目前ctDNA分析是评估疾病晚期mCRC分子改变的最有效策略。直接比较mCRC患者的ctDNA和CTC数量，研究发现CTC的中位数为0（从0到73不等），而ctDNA的中位数为732573基因组当量（GE，即cfDNA片段总数/mL）/mL（从174774到174078615 GE/mL不等）。同样，其他研究证实了CRC患者血液中CTC的缺乏和/或在这种情况下CTC分离的复杂性。

疾病监测与结直肠癌克隆的达尔文进化模型

在转移性结直肠癌中，不同疗程期间测定ctDNA可以动态监测结直肠癌的分子进化（图1）。研究发现，ctDNA的数量波动和定性分子变化反映了对经批准的抗EGFR药物产生耐药性的突变数量（图2a），揭示了CRC的分子进化，而这是组织活检无法评估的。通过对ctDNA的长期突变监测来确定肿瘤特异性突变克隆，为临床经验性使用抗EGFR再治疗策略提供了科学依据（图2b）。两项回顾性研究表明，与ctDNA上RAS野生型相比，ctDNA上携带RAS突变的mCRC患者再次使用抗EGFR药物时，其应答率和无进展生存率显著降低。这两项研究都表明，ctDNA中的RAS评估有助于选择接受抗EGFR再治疗的患者。最近，CHRONOS试验前瞻性地证实了这一假设（图2b）。在CHRONOS中，接近第三条或之后的治疗线的CRC患者评估ctDNA中RAS、BRAF和EGFR外域状态，只有在发现突变阴性时，才重新接受抗EGFR治疗。使用此方案达到了30%的缓解率和63%的疾病控制率，这一结果与根据经验选择患者的抗EGFR再治疗试验以及当前针对mCRC晚期患者的SoC化疗取得的结果相比，都是有利的。此外，CHRONOS研究认为，与之前提出的数学模型相比，及时对ctDNA进行RAS评估能更可靠地筛选进行抗EGFR再治疗的患者。以上结果表明，CRC患者血液中肿瘤DNA的基因分型可用于指导治疗，并可有效地纳入晚期CRC患者的管理中。

图2：肿瘤克隆会因此改变药物选择压力。

用于免疫治疗及其他领域的液体活检

迄今为止，对CRC的讨论都集中在ctDNA与肿瘤负荷之间的相关性或识别能预测对靶向药物反应或耐药性的分子改变。  

鉴于TMB与免疫治疗反应的相关性，以及最近美国食品和药物管理局（FDA）批准TMB作为生物标记物可用于彭布罗利珠单抗或多司他利单抗的癌症免疫治疗，TMB目前在结直肠癌和其他实体肿瘤中备受热议。TMB的定义为每兆碱基DNA的突变数（Mut/Mb），在结直肠癌中，当微卫星不稳定（microsatellite instability, MSI）或DNA聚合酶POLE和POLD的校对域发生致病性突变时，TMB通常会增加，从而导致肿瘤新抗原（tumour neoantigens, TNA）相应增加，这可能驱动对免疫检查点阻断的反应。值得注意的是，少数TMB高(≥20例Mut/Mb）的病例也发生在MSS和POLE/POLD野生型胃肠道肿瘤中，主要与其他DNA损伤反应基因的突变有关，尽管这些肿瘤对免疫治疗的有效反应尚待前瞻性评估，并且在不同的回顾性分析中也显示出不一致的结果。TMB评估的金标准是肿瘤组织标本。此外，对于任何其他遗传或基因组生物标记物，TMB在使用CRC中的标准细胞毒性药物治疗后会发生变化。因此，目前正在ARETHUSA试验（NCT03519412）中研究以ctDNA为基础的TMB评估作为预测替莫唑胺引发O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）甲基化mCRC细胞毒性后免疫治疗反应的标准（图1）。  

另一方面，MSI是目前与结直肠癌免疫治疗敏感性最相关的生物标志物，通常在实体组织标本上进行评估。然而，与TMB类似，MSI状态受到空间和时间异质性的影响，因此通过液体活检进行监测具有治疗价值。  

对结直肠癌液体活检的进一步探索是分析甲基化生物标记物，目前正迅速成为早期诊断和预后的有力方法。此外，ctDNA分析的另一个前沿领域（尽管目前尚处于推测阶段）是对突变特征的研究，既可以识别癌症演变，也可作为治疗或预测耐药性发生的预测因素。综上所述，如图1右下框所示，ctDNA具有很高的潜在价值，但在临床应用之前尚需进一步研究完善。

总结

液体活检在CRC患者的临床管理中越来越受到重视（图1）。回顾性数据表明，ctDNA可以识别需要辅助治疗的结直肠癌患者或LARC新辅助治疗后无需手术的结直肠癌患者。因此，一旦经过前瞻性证实，术后进行液体活检以识别MRD将可能广泛用于早期CRC。最新的CHRONOS临床试验表明，基于ctDNA的抗EGFR再治疗可以提高该治疗方案的治疗指数。目前，这是唯一支持在CRC患者管理中使用ctDNA的前瞻性和干预性研究证据。然而，如上所述，鉴于ctDNA捕获TMB和MSI特征的潜在能力，ctDNA也可能用于筛选可能受益于其他靶向治疗和免疫治疗的CRC患者。未来，液体治疗将可能成为合理指导CRC管理的核心，但尚需积累更多的研究数据证实ctDNA评估对CRC患者治疗的影响。

编译：王思洋、翁梅琳

审校：张军、缪长虹

参考文献：Mauri G, Vitiello PP, Sogari A, et al. Liquid biopsies to monitor and direct cancer treatment in colorectal cancer.Br J Cancer. 2022;127(3):394-407. doi:10.1038/s41416-022-01769-8  

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