Nature：血液癌明星药物度胺家族为何成「双刃剑」？

近年以来，蛋白降解领域已经成为新药研发的热门领域之一，与蛋白降解相关的基础和转化研究也层出不穷。近期，来自美国哈佛大学的一篇论文一经发表，即获得了来自邓迪大学教授、Amphista Therapeutics 创始人 Alessio Ciulli，耶鲁大学教授、蛋白降解明星公司 Arvinas 创始人 Craig Crews，哈佛大学教授刘如谦以及近日摘得诺贝尔化学奖桂冠的 Carolyn Bertozzi 等人的广泛关注。 其中，Alessio Ciulli 等人更是表示，该文章是今年蛋白降解领域的年度论文。在这篇发表于  Nature  的论文中，哈佛大学的 Christina Woo 团队 首次阐释了 E3 泛素连接酶 Cereblon （CRBN） 的天然靶向结合结构，并且初步揭示了血液癌药物明星——度胺类药物的作用机制。

该研究的通讯作者、哈佛大学教授 Christina Woo 表示，这项研究通过对度胺类药物与 CRBN 酶结合机理的研究，发现了 CRBN 酶识别的天然蛋白降解子结构，增进了对 CRBN 酶本身功能的理解。在其看来，通过对 CRBN 酶类天然结合结构域的初步了解，将有助于设计新的蛋白降解疗法，靶向不可成药的蛋白组。

作用机制长期不明，血液癌明星度胺药物成为“双刃剑”

早在 1991 年，当时正在美国洛克菲勒大学开展研究的 Gilla Kaplan 博士指出，沙利度胺 （thalidomide） 能够抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的生成，而 TNF-α 在免疫反应和炎症反应中都起到核心作用。当时尚且独立的制药公司 Celgene 在得知这项研究成果后，果断从洛克菲勒大学买下沙利度胺的新适应症专利。 此后，以沙利度胺为基础经过结构优化后的化合物——来那度胺 （lenalidomide） 、泊马度胺 （pomalidomide） 相继加入了度胺类药物家族，在各类恶性肿瘤、免疫性疾病的治疗领域受到广泛关注。

IMiD 药物化学结构 值得注意的是，度胺类药物的使用曾几经波折。早在 1953 年，沙利度胺即合成成功并曾用作孕妇群体的镇静安眠药进入市场。然而时隔不久，该药物被发现其对于新生儿具有致畸作用，因此退出市场。直到 2006 年，美国 FDA 批准其用于治疗多发性骨髓瘤，沙利度胺再次受到医学界的瞩目。 早期研究显示，以沙利度胺为代表的系列药物除了具有镇静催眠的作用外，还有较强的抗血管新生作用和免疫调节作用，其也被称为免疫调节药物 （IMIDs） 。这可能是导致其致畸作用的影响因素之一，然而，研究人员始终未能明确该类药物的具体作用机制。 尽管危险重重，但度胺类药物依然在药物市场获得了巨大成功。第二代 IMID 来那度胺先后获批用于治疗骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤等，其销售额也随之逐年增长。数据表明，自 2016 年起，来那度胺的年销售额长期以近 20% 的比例增长，其在 2019 年的年销售额已经达到了 108.23 亿美金。 虽然在获批的同时，该药物也得到了 FDA 的黑框警告。警告内容包括胚胎胎儿毒性，血液学毒性 （包括显著的中性粒细胞减少和血小板减少症） 和静脉和动脉血栓栓塞。但巨大的市场需求依然使得制药企业对于度胺类药物产生了巨大兴趣。

随着研究的不断推进，近年以来的多项研究指出，这些药物能够与名为 Cereblon （CRBN） 的 E3 泛素连接酶结合，从而导致多种与癌症相关的蛋白被泛素标记，并且被送到细胞中的蛋白酶体降解。这在一定程度上构成了度胺类药物多效性作用的基础，包括其对于多发性骨髓瘤在内的多种血液癌症的治疗作用，以及致畸作用。 然而，有关 CRBN 的内源性底物选择机制此前未曾揭晓。换句话说，究竟是什么样的结构能够与 CRBN 结合？对此，本次研究在回答这一问题上迈出了重要一步。

与度胺家族“形似”的天然结构同样具有细胞毒性

度胺类药物以泛素 E3 连接酶的底物适配子 CRBN 作为靶标。进一步来说，CRBN 酶能够通过识别在蛋白上存在的特定氨基酸序列来促进蛋白的泛素化和降解。事实上，E3 泛素连接酶主要就是通过这些特殊的氨基酸序列对底物进行识别，这些氨基酸序列被称为蛋白降解子 （degron） 。 这种蛋白降解子可以是连接两个蛋白的分子胶水、也可以是人工设计的 PROTAC 小分子或者底物蛋白上的代谢物及其翻译后修饰等等。在发现度胺类化合物能够与 CRBN 结合后，研究人员猜测，该类药物可能能够模拟细胞中的天然蛋白降解子结构从而与 CRBN 结合。然而，沙利度胺中与 CRBN 的结合结构域仍然是一个谜团。 为了破解 CRBN 的识别结构，研究团队设计了一个 蛋白降解筛选系统 ，将不同的候选蛋白降解子结构与识别 BRD4 的分子偶联在一起。如果某一候选结构能够与 CRBN 结合，就会引发 BRD4 分子降解，从而发现目标结构。 经过筛选，研究人员表明，一种由环化天冬酰胺 （cN） 或者环化谷氨酰胺 （cQ） 产生的翻译后修饰 （post translational modification，PTM） 结构，即肽链 C 端环状酰亚胺是一种能够被 CRBN 识别的天然 degron。

与 cereblon 结合并参与靶向蛋白质降解 进一步来看，含有 cN、cQ 的二肽以及沙利度胺的 PROTAC 嵌合体都可以实现目标蛋白的靶向降解，并且带有 C 端环状酰亚胺的二肽可用于替代沙利度胺。同时，该靶向降解过程表现出对于 PROTAC 剂量以及 CRBN 表达的依赖性，这说明 CRBN 在该过程中作为 E3 复合物的识别结构域发挥了重要作用。 由此，研究人员认为沙利度胺可能模拟了环化天冬酰胺 （cN） 或者环化谷氨酰胺 （cQ） 产生的翻译后修饰结构。 已经明确的是， C 端环状酰亚胺是一种自发形成、存在于人类蛋白质组中的天然结构。 于是，研究团队 CPTAC 数据库中下载了 NCI7 细胞系以及 6 种不同人源组织的蛋白质组数据，并鉴定了来自上百种蛋白质的千余种 cN 或 cQ 的翻译后修饰。数据表明，血红蛋白亚基 α （HBA） 和血红蛋白亚基 β （HBB） 发生修饰的概率最高。通过进一步构建 HBB 的 cQ 修饰蛋白模型，研究人员证实，该类 cQ 修饰的确可以被 CRBN 识别并降解。 与此同时，团队发现在加入沙利度胺之后，cQ 被降解的效率大大降低。其原因在于 cQ 修饰结构与沙利度胺的结构相似，因此在两分子之间发生了识别竞争， 进一步说明能够被 CRBN 识别的 C 端环状酰亚胺结构可能与沙利度胺识别结构域相同。

C 端环状酰亚胺在体外容易形成的 PTM 研究团队认为，CRBN 识别 C 端环状酰亚胺结构的发现将有助于针对 CRBN 生理功能和治疗作用调节过程的深入了解。Christina Woo 指出， 如果在多肽链中间出现了生成 C 端环状酰亚胺的分子内环化反应，实则是蛋白损伤的一种表现。 研究人员也发现，在没有 CRBN 酶的细胞中，含有 C 端环状酰亚胺或其下游水解产物的蛋白水平会升高。这些蛋白的不断积累可能对细胞产生毒性。 在该研究之后，Christina Woo 认为，继续开展关于 C 端环状酰亚胺的研究并将其与 IMID 分子进行比较，将促进科学界对于 CRBN 生理功能的全面了解，从而带来新的蛋白降解疗法。

参考资料 ： 1.https://doi.org/10.1038/s41586-022-05333-5 2.https://doi.org/10.1038/bcj.2013.38