综述丨CIRC RES: 衰老微生物群-肠-脑轴与中风风险和预后

编译：微科盟小木，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

微生物-肠-脑轴(MGBA)是肠道微生物与其宿主之间的双向通讯网络。许多环境和宿主相关因素会影响肠道微生物群。生态失调被定义为肠道微生物群的组成和功能改变，这些改变有助于疾病的发病机制、进展和治疗反应。当微生物群组成和功能的扰动超过其与宿主恢复共生状态的能力时，就会发生生态失调。生态失调会导致MGBA信号传导功能失调，从而调节宿主免疫、代谢和神经系统的发育和功能。生态失调引起的MGBA功能障碍与衰老和中风有关，并与常见中风风险因素(如肥胖、糖尿病和动脉粥样硬化)的发展有关。肠道微生物群的变化也反映在对中风的反应中，并可能损害损伤后的恢复。本文首先概述了用于研究MGBA的工具，并讨论其局限性和潜在的实验混杂因素。对MGBA的相关组分进行了介绍和总结，以便更好地了解MGBA信号传导中与年龄相关的变化及其在中风后的功能障碍。然后，我们将重点研究MGBA与衰老之间的关系，强调MGBA的所有组分都会发生与年龄相关的变化，这些变化可能受到肠道微生物群的影响甚至驱动。最后，总结了目前关于MGBA信号传导在中风风险因素(如肥胖、糖尿病、高血压和虚弱)发展中作用的临床和临床前证据，以及实验和临床人群中随着中风的发生，微生物群的变化。还描述了目前对基于微生物群的中风疗法的认识，如使用益生菌/益生元和补充细菌代谢物。生物医学科学这一新前沿领域的持续进展将有助于更好地理解MGBA对人类健康和疾病的影响。  

论文ID

原名：Aging Microbiota-Gut-Brain Axis in Stroke Risk and Outcome

译名：衰老微生物群-肠-脑轴与中风风险和预后

期刊：Circulation Research

IF：23.213

发表时间：2022.4

通讯作者：Pedram Honarpisheh

通讯作者单位：美国德克萨斯大学麦戈文医学院

DOI号：10.1161/circresaha.122.319983

综述目录

1 前言

2 研究肠道微生物的工具

3 微生物-肠-脑轴

4 细胞免疫途径

5 神经通路

6 衰老和MGBA

7 中风和MGBA

8 老年中风后的免疫反应不同

9 衰老会恶化中风引起的生态失调

10 基于微生物群的中风治疗

11 结论

主要内容

1 前言

微生物寄生在人体表面及其粘膜上。人类微生物组计划表明，即使在健康的受试者中，这些微生物的多样性和丰度在整个生命周期中也在不断进化，并因身体部位的不同而有很大差异。微生物最丰富的地方是胃肠道，所有胃肠道微生物及其遗传物质的集合分别被称为肠道微生物群和肠道微生物组。肠道微生物由约1014个细胞组成，包括原核生物(细菌和古菌)、真核生物(真菌、肠道原生动物和寄生蠕虫)、病毒和噬菌体。仅肠道细菌群落就有1000多个物种，基因数量是人类宿主的100倍，代谢能力与人类肝脏相当。在本综述中，微生物群这一术语特指肠道微生物群，主要是肠道细菌。盲肠和直肠的微生物组成存在个体间差异。从口咽到空肠(上消化道)的细菌负荷和多样性减少，变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)的丰度最高。从回肠到结肠(下消化道)的细菌负荷和多样性增加，其中厚壁菌门、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门是主要物种。无论样本采集和处理方法如何，细菌的个体间变异大于个体内变异。个体内和个体间的微生物群变化都会引起膳食分子和药物代谢的差异，并导致疾病风险因素。

人类肠道微生物群组成在出生时就已经确定。虽然可能有胎盘微生物组的产前贡献，但这仍然存在争议。在生命早期，包括阴道分娩与剖腹产、母乳喂养与配方奶粉喂养以及接触抗生素等因素是肠道微生物组成的主要决定因素。肠道微生物群的形成对宿主的代谢、免疫和神经系统的发育至关重要。这些结果揭示了母体微生物组的重要性及其对后代疾病长期风险因素的潜在影响。

微生物-肠-脑轴(MGBA)的改变与神经发育障碍(如自闭症谱系障碍)、神经退行性变(如阿尔茨海默病和帕金森病)、精神疾病(如抑郁和焦虑)和中风有关。MGBA通路可分为：(1)细胞免疫功能、(2)直接神经连接、(3)体循环因子。本综述将集中讨论由生态失调引起的MGBA功能障碍如何影响中风风险和预后。概述了MGBA结构(图1;表1)以及用于研究MGBA的工具。由于年龄增长是中风的主要临床风险因素，并且与生态失调独立相关，因此强调了微生物群在与年龄相关的MGBA变化中的作用。在中风实验研究中，年龄相关的生态失调对中风预后的影响还没有得到广泛的研究，因为大多数研究以年轻雄性小鼠为对象。总结了MGBA在中风病理生理学中的作用的临床和临床前证据，强调了在中风研究中考虑将衰老和生态失调作为MGBA信号传导中独立但相互依赖的生物学变量的必要性。

表1 MGBA中涉及的细胞类型总结。

图1 微生物-肠-脑轴信号传导的主要参与者及其解剖位置的图示，并作为整个综述的参考。管腔内容物和血液之间存在三个屏障：由杯状细胞维持的粘液层、通过紧密连接相互连接的选择渗透性单层肠细胞以及GBB(由肠神经胶质细胞、周细胞和内皮细胞组成)。Peyer氏斑(PPs)位于小肠肠系膜缘，具有被抗原呈递细胞(APCs)和淋巴细胞(主要是B细胞)包围的淋巴滤泡。隐窝干细胞位于绒毛根部并补充上皮细胞。杯状细胞分泌粘蛋白以维持粘液屏障。Paneth细胞分泌AMPs调节肠道微生物组成。肠内分泌细胞(EECs)是分化的神经内分泌细胞，参与胃肠道生理、与ANS的协调以及摄食行为。M细胞是肠道PPs中特异的抗原加工细胞，能够转胞吞腔内的抗原。BBB是一种高度选择性的半通透屏障，由紧密连接附着的内皮细胞、星形细胞终足和嵌入血管基底膜的周细胞组成。中枢神经系统淋巴管位于硬脑膜中，通过淋巴突起进入脑实质的途径有限，这使得脑源性抗原从大脑移动到充满脑脊液的空间和颈部淋巴结。颅骨骨髓含有大量的单核细胞和中性粒细胞，其转录特征与来自血液的单核细胞和中性粒细胞不同，可以在损伤时渗入大脑。DC，树突状细胞；LP，固有层；Mac，巨噬细胞；MG，小胶质细胞；Neut，中性粒细胞；PP，Peyer氏斑。

2 研究肠道微生物的工具

2.1 代谢组分析

低分子量分子(代谢物)，如维生素、脂肪酸、氨基酸、胆汁酸等，受微生物群和宿主的调控，在衰老和中风中充当重要的MGBA信号分子。基于质谱(MS)的平台，如气相色谱-质谱(GC-MS)、液相色谱-质谱(LC-MS)和毛细管电泳-质谱(CE-MS)，由于其能够检测广泛的代谢物，越来越多地用于MGBA信号的代谢组学分析。

2.2 微生物组和宏基因组分析

保守的16S核糖体RNA (16S rRNA或16S)基因被用来鉴定和比较细菌组成。16S基因具有识别细菌和非细菌的保守区域(除了一些也可以检测古菌的16S引物)，并具有区分单个细菌分类群的可变区域(V1-V9)。分类分配后，使用α(样本内)和β(样本间)多样性指标比较样本的细菌多样性。α多样性是对一个地点或样本内微生物群落组成的定性度量，该微生物群落的组成随着丰富度的增加而增加(分类群的数量和均匀度的增加(现有分类群的相对丰度))。β多样性使用各种系统发育指标(如加权和非加权UniFrac)和非系统发育指标(如Bray-Curtis或Jaccard)描述来自不同样本的2个或多个微生物群落之间的物种多样性。16S数据不能直接洞察肠道微生物群的生化功能。PICRUSt是预测宏基因组功能组成的计算方法的一个例子。微生物样本的综合宏基因组和代谢组学分析可用于确定衰老和中风中关键细菌与转化重要代谢和免疫途径之间的联系。

2.3 MGBA研究的实验模型

2.3.1 抗生素

尽管抗生素是操纵宿主肠道微生物群的有用工具，但抗生素给药可能对其他部位(如肺、皮肤、眼睛、口咽等)的微生物群产生脱靶效应。一些抗生素还可以通过减少免疫细胞的细胞呼吸作用来引起宿主代谢物的微生物依赖性变化和病原体的吞噬清除。抗生素可以改变细胞代谢，导致高血糖、肥胖和胰岛素抵抗，这些都是已知的中风风险因素。结肠细胞通过增加GLP-1(胰高血糖素样肽1)信号传导将其对短链脂肪酸(SCFAs)作为能源的偏好调整为对葡萄糖的偏好，以响应抗生素治疗后腔内SCFAs的突然减少。抗生素的效果取决于抗菌药物的覆盖范围、剂量、持续时间和宿主因素，例如年龄、性别、饮食、菌株和其他病理的存在，必须针对具体的实验条件仔细验证。

2.3.2 粪便微生物群移植

成功的粪便微生物群移植(FMT)需要精心设计和验证多个参数，包括供体和受体的年龄、性别、菌株、疾病和治疗状态。收集方法、冷冻时间与新鲜使用时间、冻融循环、氧气暴露和防腐剂必须进行评估和报告。使用FMT的一个重要的临床和临床前考虑因素是所有微生物组分(细菌和非细菌)均被转移。缓慢降解的代谢物、病毒、真菌和寄生基因也被引入受体。这些非细菌实体构成了转移感染的临床风险，并可能是实验混杂因素的来源。

体外系统，如肠道芯片或人类肠道微生物生态系统模拟器被用于研究微生物群对肠道稳态的直接影响。从单一健康供体粪便中提取的纯化肠道细菌培养物已被用于治疗抗生素治疗失败患者的复发性高毒性艰难梭菌(Clostridium difficile)感染。在同一研究中，受体在FMT后6个月仍然没有症状，并且他们的粪便样本与合成粪便替代物的相似性超过25%。体外方法可有效解决FMT的临床安全问题。诱导多能干细胞或胚胎干细胞生长的人类肠道类器官被用于研究临床病理，如对艰难梭菌毒素的反应。这些类器官是无菌的(除非引入细菌)，具有功能性上皮屏障，由类似Paneth细胞和杯状细胞的溶菌酶和粘蛋白产生细胞组成(见表1)。类器官模型提供了对氧气和营养水平的实验控制。为了加速药物的开发，已开发出包含可重构器官水平功能的活人体细胞的工程微芯片。

2.3.3 无菌动物模型

无菌模型(GF,不含可检测到的细菌)或限菌模型(一种或几种已知细菌)揭示了微生物群在免疫和神经系统发育中的作用。GF模型有局限性，如免疫反应缺陷、血脑屏障完整性降低以及小胶质细胞成熟和功能改变，因此可能与人类研究的转化相关性较低。表2总结了在GF小鼠中观察到的具体变化。人工饲养的动物也可能导致转化相关性较低的结论。其他模式生物，如对果蝇和斑马鱼的研究，已经探索了MGBA，并在最近进行了综述。育种者和小鼠品系之间也存在影响MGBA信号传导的差异。重要的是，GF小鼠MGBA免疫、神经化学和行为的基线差异是MGBA在中风中作用的临床前研究中的潜在实验混杂因素。

研究MGBA在中风中的作用的工具已经取得了巨大的进展。然而，潜在的缺陷使现有证据的解释和未来研究的设计具有挑战性。这些缺陷包括解剖学、免疫学、微生物群组成、包括衰老在内的多种合并症、样品制备、生物信息学方法以及在MGBA研究中区分相关性和因果关系的阈值的差异。例如，尚未研究肠道病毒组或微生物组的噬菌体在中风中的作用。选择性细菌定植的尝试仍然是人为的，忽视了复杂的微生物信号传导的影响，如群体感应和生物膜。尽管存在固有的局限性，但无菌模型在确定中风MGBA研究中的因果关系方面仍然很有价值，本综述稍后将对此进行讨论。

3 微生物-肠-脑轴

了解MGBA的细胞和特殊结构的综合解剖学和生理学对于我们理解其在健康和疾病中的作用至关重要。本节旨在简要概述MGBA组分(图1)，本节旨在简要概述MGBA成分(图1)，描述关键细胞及其与肠道微生物群的联系(表1)。

3.1 肠道屏障和通透性

肠腔和血液之间存在三种屏障：由杯状细胞维持的粘液层，通过紧密连接相互连接的选择渗透性单层肠细胞，以及由肠神经胶质细胞、周细胞和内皮细胞组成的肠道-血液屏障(图1)。肠绒毛和隐窝、指状突起和内褶由吸收营养的肠上皮细胞组成。肠上皮细胞、杯状细胞、Paneth细胞、肠内分泌细胞、隐窝干细胞和微褶(M)细胞与腔内微生物群保持稳态屏障(表1；图2A)。粘蛋白、AMPs(抗菌肽)的分泌、分泌型IgA进入管腔，以及紧密连接蛋白的表达(如E-钙粘蛋白，图2B)允许对营养物质的选择性渗透，同时防止细菌和有害分子的易位。

肠道相关淋巴组织(GALTs)包括固有层(LP)、肠系膜淋巴结和Peyer氏斑(PPs)(图1)。GALTs含有协调宿主对肠道损伤的局部和系统防御的免疫细胞。LP是上皮层下方的一层疏松的非细胞性结缔组织，含有大量的免疫细胞和神经末梢。PPs是沿着小肠肠系膜边缘的圆顶状结构，淋巴滤泡被抗原呈递细胞(APCs)和淋巴细胞(主要是产生IgA的浆细胞)包围。Peyer氏斑的滤泡相关上皮具有薄的粘液层和M细胞，用于将腔内抗原转运至LP。GALTs在衰老和中风中的作用将在下面的章节中讨论。

肠内分泌细胞(EECs)是参与胃肠道生理和摄食行为的分化神经内分泌细胞。肠嗜铬细胞是EECs的最大亚群，可合成全身90%以上的血清素(5-羟色胺，5HT)。一些EECs(neuropod细胞)直接与肠神经末梢突触并分泌5HT以启动反射，通过粘膜下神经丛调节腔内水分平衡，并通过肌间神经丛触发肠道蠕动(图1)。Neuropods感知来自腔内的机械、热和化学信号，并将这些信号转换为电脉冲。Neuropod产生的电脉冲可以通过neuropod和迷走神经传入纤维形成的5-羟色胺能突触传递。传入的感觉信号向脑干传播，传出(源于中枢神经系统[CNS])信号以毫秒的速度传递到肠neuropod，以调节肠内分泌细胞激素和神经递质的释放，包括5HT、生长抑素、神经肽Y、胆囊收缩素和GLP-1(图2C)。

5HT也是一种参与调节情绪、记忆和认知的CNS神经递质，尽管尚不清楚是否有足够浓度的肠道产生的5HT到达CNS。5HT不能通过血脑屏障(BBB)。无论是肠源性的、脑源性的，还是由其他细胞沿MGBA转运的，5HT的作用都是影响大脑免疫的主要途径。EECs产生的肠源性5HT被储存并从血小板和其他免疫细胞中释放。DCs表达多种5HT激活受体，通过分泌IL-6响应5HT，储存5HT，并在ATP介导的钙内流时释放5HT和其他细胞因子以激活B和T淋巴细胞。5HT通过5HT2B和5HT7驱动抗炎巨噬细胞极化。微生物调节的5HT可以直接和间接地影响脑损伤后的免疫反应，其中血小板、CNS边缘相关巨噬细胞(BAMs)和其他能够储存和释放5HT的浸润性骨髓细胞都参与其中。

肠道微生物通过控制EECs来调节饥饿感和饱腹感。EECs表达化学感应和模式识别受体(如TLR[toll样受体]-2和TLR-6)，它们检测细菌脂多糖，激活典型的NF-κB通路(图2C)，表明EECs除了在5HT介导的免疫调节和摄食行为中发挥积极作用外，还可以直接参与局部免疫反应。肥胖受试者中EECs的转录组学特征可以区分个体是否患有糖尿病。具体而言，肥胖糖尿病患者表现出GLP-1细胞分化和胰高血糖素前体成熟降低以及血浆GLP-1减少。EECs及其对5HT和GLP-1信号传导的调节是特化肠道细胞的一个典型例子，可以作为微生物群和CNS衍生的神经化学信号的传感器。这可以协调胃肠道分泌功能、全身免疫、喂养行为、肥胖和糖尿病，这些已知的中风风险因素。5-羟色胺能系统在中风预后中的作用是一个积极的临床研究领域。表1总结了EECs和其他特化上皮细胞随着衰老的变化，衰老是中风的主要风险因素。

淋巴系统作为激活的APCs到达淋巴结(LNs)和非组织驻留免疫细胞的出口管道，对于建立系统免疫反应至关重要。早在200多年前，一位意大利解剖学家(Paolo Mascagni)就描述了脑膜淋巴管的存在。Kipnis和其他人使用直接显微镜证实了小鼠颅内脑膜淋巴网络的存在，后来在非人类灵长类动物和人类中也有报道。虽然这些淋巴管位于硬脑膜，不能直接进入脑实质，但通过淋巴突起的有限通路允许脑源性抗原从软脑膜下脑进入充满脑脊液的空间，从而穿过蛛网膜到达硬脑膜淋巴管(图1)。小鼠和人的脑膜中有源自肠道的分泌IgA的浆细胞。这些细胞随着年龄的增长和肠道屏障的破坏而增加，在中风后可观察到。这些发现表明，脑源性抗原可以与脑膜APCs和分泌IgA的浆细胞相互作用，从而引发抗原特异性的适应性免疫反应，这需要肠道微生物的存在。

血脑屏障(BBB)是由内皮细胞、紧密连接、星形细胞终足和周细胞组成的半通透性屏障(图1)。微生物群及其代谢物与BBB相互作用。在炎症期间，BBB的通透性、粘附分子的表达以及大脑对中性氨基酸的摄取均增加。BBB的破坏使循环中微生物衍生的代谢物(如色氨酸代谢物、胆汁酸和SCFAs)直接进入CNS骨髓细胞和星形胶质细胞，这是BBB的重要调节因子。发掘微生物代谢物的调节作用是MGBA研究的一个活跃领域。

血液-CSF屏障是外周CNS通讯的重要部位。脉络丛和其他结构维持血液-CSF屏障(图1)。流向脉络丛的血流可以被5HT调节，正如上文所述，这可能是一种微生物依赖性途径。中风减少了流向脉络丛的血液，从而增加血液-CSF屏障的通透性。血液-CSF屏障包含跨膜蛋白(如ATP结合盒转运蛋白和溶质载体)，这对于在这些液室之间交换微生物衍生的代谢物至关重要，如硫酸吲哚酚(一种色氨酸代谢物)和三甲胺-N-氧化物。这些代谢物在中风中的作用将在下文讨论。

脑血流量(CBF)在BBB和血液-CSF生理学中起着重要作用。在喂食慢性生酮饮食的小鼠中发现CBF增加，这增加了嗜粘蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)和乳杆菌(Lactobacillus)，减少了脱硫孤菌属(Desulfovibrio)和Turicibacter，表明微生物群的特定变化可以调节CBF。一氧化氮合酶(NOS)和精氨酸酶在中风CBF一氧化氮依赖性调节中的作用已得到充分证实。精氨酸酶和NOS竞争降解L-精氨酸，而血浆L-精氨酸水平直接受微生物群调节。微生物依赖性精氨酸和色氨酸代谢分别影响一氧化氮介导或5HT介导的CBF调节，是中风或脑血管痉挛病理的临床相关途径。

图2 细菌与肠上皮的紧密接触，管腔上皮表面紧密连接蛋白表达，迷走神经纤维和EECs之间的信号分子。代表性荧光原位杂交(FISH)显示，与年轻小鼠(绿色箭头)相比，naïve小鼠(红色箭头)的细菌与肠道上皮细胞非常接近(A，顶部2张图，红色:细菌[非特异性FISH探针]，蓝色:DAPI, 10倍放大)。代表性免疫组化显示，naïve小鼠粘蛋白分泌减少(粉红色箭头)(A，下面2张, 棕色:MUC-2染色，蓝色:苏木精, 40倍放大)。代表性免疫组化显示肠上皮细胞表达肠E-cadherin紧密连接蛋白(橙色箭头)(B，盲肠，棕色=E-cadherin，蓝色=苏木精，10/40×放大)。迷走神经传入纤维、肠内分泌细胞、Paneth细胞和LP Th2淋巴细胞之间的信号网络。用来自SPF小鼠的微生物群或单个细菌(如Bacteroides thetaiotaomicron)定植GF小鼠，可以恢复GF小鼠EECs中血清素和GLP1(胰高血糖素样肽1)的产生。Th2细胞因子IL-4、IL-9、IL-13和EECs衍生的GLP2刺激Paneth细胞产生抗菌肽(AMPs)。EECs表达感知细菌脂多糖(LPS)的TLR-2和TLR-6以激活典型的NF-κB途径。传入的感觉信号向脑干传播，传出(源自CNS)信号以毫秒级速度传递到肠neuropod，以调节激素的释放，包括GLP1、CCK、生长素释放肽和5-羟色胺(C)。AMP，抗菌肽；CCK，胆囊收缩素；CNS，中枢神经系统。

4 细胞免疫途径

4.1 LP中的免疫监视

免疫耐受被定义为对免疫有效抗原缺乏不产生效应反应。除M细胞外(表1)，耐受性(CD103+) DCs对腔内抗原进行采样(图1)并从上皮下降以将其抗原呈递给naïve T细胞，诱导其分化为抗炎Treg细胞。Treg细胞到达LP分泌抗炎细胞因子(如IL-10和TGF-β)以维持免疫休眠。肠道微生物群调节杯状细胞和Paneth细胞的粘液层和抗菌功能(表1)，并在诱导LP免疫细胞(特别是LP淋巴细胞)方面发挥积极作用(表2)。微生物群在LP免疫和炎症中的作用已在其他地方进行了广泛的综述。

表2 在脏野捕小鼠、野生型小鼠(SPF)和GF小鼠中观察到的MGBA变化总结。

4.2 CNS骨髓细胞

肠道微生物群在整个生命过程中影响小胶质细胞(MG)的生物学特性(表1和2)。在损伤后的几分钟内，MG感知DAMPs(如ADP和ATP通过P2Y12受体)开始向损伤部位趋化。激活后，MG收缩其过程转化为变形虫形态，并开始与其他CNS细胞和外周来源的免疫细胞协调。微生物代谢物直接调节MG介导的神经炎症。色氨酸衍生的基于吲哚的配体激活MG AHR(芳香烃受体，免疫分化和神经炎症的调节因子)，从而抑制NF-κB通路的激活。微生物依赖性AHR激活可降低MG的VEGF-β表达，并增加星形胶质细胞的TGF-α分泌，以通过SOCS2依赖性途径抑制星形胶质细胞介导的神经炎症(图3A)。CNS BAMs分布于脑膜、脉络丛和血管周围空间(图1)，是CNS常驻的髓样细胞，与MG的区别在于CD38和MHC-II的表达较高，缺乏典型的MG标志物(Tmem119和P2RY12)。脉络丛是高脑血流量的部位，也是从外周循环招募消炎免疫细胞的部位。在血液-CSF界面，如脉络丛和脑膜，BAMs和其他APCs在稳定状态下和中风后持续监测和过滤脑源性抗原。

图3 通过AHR激活小胶质细胞(MG)的微生物依赖性。微生物依赖性MG AHR的激活通过MG减少VEGFB(血管内皮生长因子B)，从而增加星形胶质细胞转化生长因子α(TGF-α)的分泌，进而抑制星形胶质细胞介导的神经炎症(A)。与年龄相关的保护性细菌(如Akkermansia或SCFA产生菌)减少可导致肠道屏障功能降低，从而激活DCs以刺激gd T细胞，增加它们向大脑的迁移并提高IL-17的产生，从而导致中风后中性粒细胞额外募集到老年大脑中(B)。AHR，芳香烃受体；EEC，肠内分泌细胞。

5 神经通路

直接神经通路通过自主神经系统(ANS)连接胃肠道和中枢神经系统。ANS分为交感神经、副交感神经和肠神经系统(一些文献不包括肠神经系统作为ANS的一部分)。交感神经和副交感神经分裂包含传入(上行)和传出(下行)纤维，由节前和节后神经元组成。乙酰胆碱是所有突触前神经元和突触后副交感神经元的主要神经递质。去甲肾上腺素是突触后交感神经元的效应递质。除了乙酰胆碱，重要的信号分子，如NPY(神经肽Y)、VIP(血管活性肠肽)和ATP可以作为ANS的神经递质以及免疫细胞(如单核细胞)的趋化剂。

交感神经系统支配着几乎所有的身体组织。它的激活会增加血压、心率和糖原分解，并抑制参与消化的途径。细菌代谢物影响交感神经信号传导，微生物群对上行交感神经信号传导具有整体抑制作用(表2)。

副交感神经系统调节进食、焦虑、觉醒、记忆、情绪，还可以感知微生物代谢物。副交感神经主要通过迷走神经(VN，颅神经X，支配上消化道到近端结肠)和盆腔神经(支配远端结肠到肛门)发挥作用。VN通过激活肌间丛中的肠神经系统(ENS)运动神经元来调节肠道运动。VN承载着超过70%的副交感神经纤维，并支配着胸部和腹部器官，包括整个胃肠道。VN神经支配胃肠道固有肌层、LP和上皮，并能直接感知腔内信号。在培养的肠道类器官模型中，细菌衍生的SCFA被EECs感知，导致钙依赖性5HT释放从EECs传递到表达5HT3R(3型血清素受体)的相邻迷走神经末梢。这些发现表明，细菌代谢物可以触发神经化学信号，这些信号在几毫秒内上升到脑干的迷走神经核，对进食、觉醒和情绪相关的行为产生影响。

重要的是，用于治疗难治性抑郁症的VN刺激可能在中风后具有神经保护作用。VN依赖性和T细胞依赖性胆碱能信号传导调节Paneth细胞的抗菌肽产生和上皮细胞增殖。VN刺激激活α7烟碱型乙酰胆碱受体，它是参与中风反应的胆碱能抗炎途径的重要介质。α7烟碱型乙酰胆碱受体的激活可减少细胞焦亡(一种程序性细胞死亡形式)，并上调BBB紧密连接蛋白(如claudin-5和occludin)。综上所述，迷走神经胆碱能信号传导参与了沿MGBA自上而下(抗菌和肠道运动)和自下而上(血脑屏障通透性和细胞存活)的信号传导，直接影响对中风的反应。

肠神经系统(ENS)是一个由超过1亿个肠神经元和肠神经胶质细胞(EGCs)组成的广泛的、独立的网络。ENS由调节蠕动的肌间(Auerbach)神经丛和调节水和电解质运动的粘膜下(Meissner)神经丛组成。ENS神经递质包括乙酰胆碱、一氧化氮(NO，由肠神经元和EGCs释放)和5HT，EECs可在微生物代谢物(如SCFAs)增加时释放5HT。微生物衍生的色氨酸代谢物通过激活肠神经元中的AHR来增加肠道运动。这些发现表明微生物-ENS之间的通讯可以将腔内代谢物转化为调节肠道生理的神经化学信号，并可能在中风后并发症(如肠梗阻)中发挥作用。

5.1 体循环(激素、细胞因子和代谢物)

下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴调节身体对心理和生理压力的反应。应激诱导的HPA轴激活通过交感神经激活β-肾上腺素能受体、诱导肠道Th17细胞和改变小鼠肠道微生物群组成来增加胃肠道通透性，这表明HPA轴自上而下地调节微生物群组成，可导致中风引起的生态失调。除了HPA的神经激素作用外，宿主昼夜节律在稳定状态和中风反应下也会影响MGBA。例如，一项使用昼夜节律突变体Clock∆19/∆19基因敲除小鼠的研究表明，肠道微生物群对心肌梗死后恢复的有益作用需要功能性昼夜节律信号，但这尚未在中风模型中得到验证。

5.2 细胞因子

肠道微生物可以通过其代谢物和循环细胞因子的调节驱动中枢神经系统病理。生态失调可导致循环促炎细胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的增加，破坏紧密连接和增加肠上皮屏障、肠道-血液屏障和BBB的通透性。生态失调引起的这些屏障的破坏为脑源性抗原触发系统免疫反应和微生物群衍生代谢物进入中枢神经系统免疫区室提供了一个直接的双向通道。代谢物或细胞因子对CNS的直接作用很难从它们通过免疫和外周神经途径的间接作用中区分出来。胆汁酸、SCFAs和色氨酸代谢物代表了经过充分研究的一类微生物代谢物，它们介导MGBA通信，将在本综述的MGBA和中风部分进行讨论。

6 衰老和MGBA

衰老与营养吸收丧失、厌食、营养不良和虚弱有关。衰老会增加患癌症、神经退行性疾病、心脑血管疾病的风险。导致生物衰老的潜在机制包括DNA损伤增加、端粒缩短、自噬受损和免疫衰老。最近，肠道微生物群已成为衰老过程和衰老相关病理的关键介质。

6.1 衰老与肠道屏障

肠道屏障功能随着年龄的增长而恶化，这与老年人胃肠道感染的发生率增加有关。 屏障功能的丧失是由于与年龄相关的紧密连接蛋白和粘液生成的减少，这可以由微生物群调节。例如，与年龄相关的疾病患者中A. muciniphila的丰度低于与年龄匹配的健康对照组。补充A. muciniphila可改善与年龄相关的结肠粘液厚度减少。从健康婴儿中分离的乳杆菌和肠球菌(Enterococcus)菌株的益生菌混合物，通过增加胆汁盐水解酶活性降低肠道通透性(由高脂肪饮食引起)，诱导牛磺酸依赖性的紧密连接蛋白(Zo-1和occludin)表达。这些研究结果表明，年龄相关的肠道屏障功能丧失可以通过基于微生物群的疗法来逆转。

6.2 衰老和特化肠上皮细胞

IL-22的分泌随着年龄的增长而减少，其可刺激隐窝干细胞的再生能力。肠道固有淋巴样细胞(ILCs)产生IL-22可以由微生物代谢物如吲哚-3-甲醛(一种色氨酸衍生的AHR配体)诱导。微生物合成吲哚的能力随着年龄的增长而逐渐下降。这些发现表明，随着年龄增长，吲哚基代谢物的可用性会降低，降低了ILC3依赖性IL-22的产生，从而降低了隐窝干细胞的再生能力。SCFAs(如丁酸)可以通过抑制FoxP3依赖性HDAC抑制干细胞增殖。粪便中的SCFAs随着年龄的增长而减少，这可能解释了与年龄相关的隐窝干细胞增加。老龄小鼠粘液屏障厚度降低，M细胞抗原处理受损，特化浆细胞减少。随着年龄的增长，特化上皮细胞发生细胞特异性变化，如表1所示。由于这些与年龄相关的变化和中风引起的生态失调，微生物群可以侵入上皮并引发炎症(图2A)。

6.3 衰老与免疫系统

衰老与免疫系统的重塑和轻度炎症(分别称为免疫衰老和炎症)的增加有关。免疫衰老的特征是抵抗感染的免疫效能下降、对新抗原的效应反应受损、自身免疫增强和伤口愈合不良。炎症通常被视为免疫衰老的结果，其特征是血清促炎细胞因子(包括IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)水平升高，而抗炎细胞因子(如IL-10)水平降低。

6.3.1 先天免疫中的微生物群及其与年龄相关的变化

随着年龄的增长，骨髓细胞增殖和组织再分配增加，我们已经表明，大脑中外周来源的APCs随着年龄的增长显著增加。大脑中的这种髓细胞积累与年龄相关的肠道微生物变化(Akkermansia减少)和行为缺陷呈正相关。虽然中性粒细胞在循环中的比例似乎没有受到影响，但它们的功能(趋化性、吞噬作用、活性氧的产生[ROS])随着年龄的增长而受损。微生物群通过TLR和MyD88信号传导驱动中性粒细胞老化，微生物群的消耗(在GF或抗生素治疗小鼠中)减少了循环老化中性粒细胞(CXCR4highCD62Llow)的数量，并提高了内毒素诱导的脓毒性休克动物模型的存活率。

6.3.2 适应性免疫中的微生物群及其与年龄相关的变化

T细胞群中与年龄相关的变化包括naïveT细胞和Treg细胞数量减少，以及CD8+记忆细胞和Th17细胞数量增加。B细胞中与年龄相关的变化包括B细胞系前体的减少。随着年龄的增长，外周B细胞表型从naive B细胞转向具有抗原经历的B细胞，这些B细胞克隆多样性受限，产生新型高亲和力免疫球蛋白的能力受损。年龄相关的B细胞亚群被描述为高表达CD11c和转录因子T-bet的群体。随着年龄的增长，这些B细胞在血液和脑膜中积累，并在TLR7和TLR9配体刺激后发生夸张的增殖反应。

研究表明，SPF小鼠淋巴细胞增殖随着年龄增长明显向骨髓细胞增殖转变的现象在GF小鼠中被消除。GF小鼠中B细胞的扩增，表明微生物群对骨髓中的B细胞增殖有抑制作用。此外，在加速衰老模型(DNA修复蛋白ERCC1受损的Ercc1-/Δ7小鼠)中补充A. muciniphila可降低PPs中活化的CD80+CD273-B细胞的数量。这些发现表明肠道微生物群在淋巴细胞增殖的调节中起着重要作用，并为淋巴细胞显性疾病(如自身免疫性疾病)提供了可能的治疗机会，并作为一种潜在的辅助疗法与已批准的B细胞清除药物联合使用。

6.3.3 衰老与CNS免疫

表1总结了CNS免疫细胞中与年龄相关的变化。使用抗生素或GF模型的微生物群消耗已证明对AD中微生物群的不利影响。从WT对照组到APPswe/PS1dE9转基因小鼠(阿尔茨海默病模型)的FMT改善了认知缺陷，减少了淀粉样-β(Aβ)的沉积，并减少了大脑中的神经炎症(降低COX-2和CD11b的表达)。这些影响与粪便中SCFAs(丁酸)的增加有关。阿尔茨海默病GF小鼠模型显示Aβ沉积减少。在阿尔茨海默病GF小鼠中补充SCFAs可上调ApoE基因的MG表达并增加Aβ沉积，这表明微生物衍生的SCFAs可能通过调节MG表型和吞噬作用促进Aβ沉积。随着年龄的增长，中枢神经系统抗原的淋巴引流减少，表明老年中风患者脑源性抗原暴露于BAMs和其他APCs的时间可能比年轻中风患者更长。从老年供体到年轻受体的FMT增加了MG的激活(降低P2RY12并增加Iba-1和MHCII的表达)和全身神经炎症。此外，接受来自老龄WT小鼠粪便微生物群移植的GF小鼠在FMT后3个月表现出粪便SCFAs(乙酸、丙酸和丁酸)减少，并表现出抑郁样行为、短期记忆受损和空间记忆受损。

生态失调已经成为免疫衰老的治疗靶点。 复壮程序(共同饲养、血清注射和异慢性共生)表明，老龄小鼠的微生物群落和肠道免疫力与年轻小鼠相当。宏基因组数据显示，高丰度的Akkermansia和丁酸产生菌是老龄小鼠免疫恢复活力的原因。这些研究结果表明，微生物群可驱动与年龄相关的神经炎症，并可能导致中风后炎症。

6.4 衰老与MGBA神经通路

高达50%的老年人口经历慢性便秘和胃肠道相关问题。一项针对300多万退伍军人的7年临床研究发现，较高的便秘率与较高的全因死亡率和缺血性中风风险独立相关。对啮齿动物的研究表明，衰老降低了肠道平滑肌收缩力及其神经支配，并减慢了肠道转运时间，表明与年龄相关的ANS功能障碍可能由微生物群驱动，并加剧中风后并发症，如肠梗阻。

6.4.1 交感/副交感神经的微生物群及其与年龄相关的变化

与年龄相关的ANS功能变化包括神经递质功能下降，导致调节活动减弱(如CBF调节)和自主神经放电协调不良(如膀胱功能)。静息交感神经张力随着年龄的增长而增加，这与血浆去甲肾上腺素的增加以及儿茶酚胺和胆碱能受体敏感性的降低有关，表明中风后CAIP存在年龄相关性胆碱能功能障碍(如上所述)。从自发性高血压大鼠到正常血压大鼠的FMT增加了交感神经活动、血压和神经炎症，这表明微生物群可以介导交感神经驱动的病理生理学，这在衰老和中风中可见。

6.4.2 ENS中的微生物群及其与年龄相关的变化

在动物中，ENS神经元经历了与年龄相关的神经退行性变。随着年龄的增长，肠道神经元的丢失降低了肠粘膜中神经纤维的密度。衰老的肠道神经元肿胀和营养不良，并在肌间神经丛中表现出脂褐素积累和更高的ROS生成。还描述了与肠神经元损失成正比的与年龄相关的EGCs减少。虽然，微生物群和ENS之间存在通讯途径，但尚未阐明年龄相关的生态失调对ENS神经退行性变的直接贡献。

总之，MGBA的所有组分都经历了与年龄相关的显著变化，其中许多变化可以直接受到微生物群的影响甚至驱动。鉴于这些观察结果以及中风是一种老年疾病的事实，对中风病理生理学和结果的研究必须考虑宿主和微生物群中与年龄相关的背景，包括生态失调、胃肠道功能障碍、免疫重塑和其他现有的CNS或系统性病理。

7 中风和MGBA

中风是导致死亡和长期残疾的主要原因。继发于血栓形成或栓塞引起的脑供血丧失的缺血性中风是最常见的亚型，这将是本节的重点。由于急性治疗、静脉溶栓剂(阿替普酶[组织型纤溶酶原激活剂，TPA]和替奈普酶[TNK])和血管内血栓切除术的进步，缺血性中风后的生存率有所提高。由于排除标准由时间、出血风险和对专业资源的需求决定，只有不到10%的中风患者接受了这些治疗。中风幸存者的长期功能预后不良是中风患者生活质量下降和社会经济负担增加的主要原因。

7.1 中风风险因素与MGBA

中风后感染率约为30%，中风后感染与预后不良相关。高达50%的中风患者还会经历胃肠道相关并发症，包括胃肠道出血、肠蠕动丧失和生态失调，导致住院时间延长、死亡率升高和康复较差。中风诱导的信号级联并不止于扰乱胃肠道稳态和微生物群。一波自下而上的信号向CNS传播，有助于中风的亚急性和慢性反应阶段。本节将描述生态失调和衰老如何影响MGBA信号传导，在中风预后中发挥有害但可能可逆的作用。虽然中风是一种老年疾病，但大多数临床前研究都是在幼龄动物身上进行的。

多项研究表明，与品系匹配的年轻小鼠相比，老年小鼠短暂性大脑中动脉闭塞后的梗死体积更小，即使缺血持续时间和深度相同。然而，尽管梗死面积较小，但与年轻小鼠相比，老年小鼠的预后较差，死亡率较高。一些利用光化学诱导的中风模型的研究报告了老年动物中相同或更大的梗死体积。除年龄外，多种因素包括检验的物种、手术方法(再灌注vs .永久性缺血)和侧枝循环的差异(在小鼠中可能是菌株依赖性的)都会影响实验性中风后的梗死体积。然而，在大多数使用短暂性大脑中动脉闭塞模型的研究中，与年轻对照组相比，老年小鼠中风后表现出水肿减少、梗死面积更小，但死亡率更高，神经系统预后较差。重要的是，老年中风患者与年轻患者相比有显著不同的风险特征和合并症。

个体内和个体间微生物群的变异是中风风险因素中的驱动因素。例如，对来自多个国家的非洲裔参与者的口腔和粪便微生物群的分析表明，患有高血压、高血糖和高甘油三酯血症等脑血管风险因素的参与者口腔中链球菌(Streptococcus)、普雷沃氏菌(Prevotella)和韦荣氏球菌(Veillonella)富集。一项对100名动脉粥样硬化患者的研究表明，血浆色氨酸、吲哚、吲哚-3-丙酸和吲哚-3-醛水平与动脉粥样硬化的进展呈负相关。重要的是，这些特定的吲哚代谢物在GF小鼠中检测不到。相反，犬尿氨酸/色氨酸比率与动脉粥样硬化呈正相关。这表明色氨酸代谢从吲哚途径(由微生物群调控)向犬尿氨酸途径(由宿主调控)的代谢分流可能对动脉粥样硬化(中风的主要风险因素)产生不利影响。表3总结了主要的中风风险因素(包括动脉粥样硬化、小血管疾病、血压、糖尿病、肥胖和身体活动)，并提供了它们与肠道微生物相关的证据。

糖尿病和肥胖等中风风险因素可通过FMT传播(表3)。靶向微生物群降低代谢功能障碍可能是控制中风代谢风险因素的临床策略。MGBA的功能障碍通过代谢物、循环中的细菌和自主神经调节失调导致高血压。越来越多的证据表明，肠道微生物群可以独立促进重要中风风险因素的发展。因此，这些风险因素可能会受到肠道微生物群的调节或传播。

表3 中风的主要风险因素及其与肠道微生物相关联的证据。

ACVD，动脉粥样硬化性心血管疾病；BP，血压；FMT，粪便微生物群移植；ICAC，颅内颈动脉钙化；SVD，小血管疾病。

7.2 MGBA在中风中的作用具有性别依赖性

在两性大鼠中使用内皮素-1诱导的大脑中动脉闭塞模型，结果显示，与雌性相比，雄性表现出更高的死亡率、更严重的感觉运动缺陷和更高的血清促炎细胞因子(IL-17A、MCP-1和IL-5)水平，以及中风引起的肠道通透性增加更快。对老龄小鼠大脑中动脉闭塞后(14天)亚急性时间点的分析表明，与第3天具有相似梗死体积的雌性小鼠相比，雄性小鼠死亡率更高，出血转化率更高，血液和大脑中CD8+ T细胞反应更高，以及中风导致的肠道通透性增加更高。这些研究强调了性别作为中风后MGBA中生物学变量的重要性。这些研究强调了性别作为中风后MGBA的生物学变量的重要性。利用跨性别FMTs和性别特异性评估中风后MGBA反应的实验是有必要的。

7.3 年龄相关性衰弱与生态失调和较差的中风预后有关

相当大比例的老年中风患者身体虚弱，这与脑血管疾病的发病率和中风后生存期较短有关。虚弱可以通过低握力、低能量、步行速度慢、低体力活动和无意的体重减轻来评估。虚弱的一个标志是微生物群多样性的丧失和分类群变化，如细长真杆菌(Eubacterium dolichum)和Eggerthella lenta增加，普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)减少，SCFA产生菌(如丁酸产生菌)减少，色氨酸代谢物减少，以及脂多糖和肽聚糖的产生增加。较高的微生物群多样性与较低的脆弱性、改善的免疫功能和增强的认知能力之间存在着很强的正相关关系。例如，口服Akkermansia充分改善了老龄小鼠肠道中与衰老相关的表型并延长了健康寿命，衰弱指数的改善和肌肉萎缩的恢复证明了这一点。这些发现表明，识别衰老过程中微生物群落的关键变化，可以为开发细菌疗法以促进健康衰老和中风后恢复提供理论依据。

7.4 MGBA在中风后并发症中发挥作用

中风后肠梗阻是导致中风结局、残疾和死亡的主要因素。临床上，肠梗阻的特征是腹胀和肠鸣音消失。重要的是，衰老是发生中风后肠梗阻的风险因素。全国住院患者样本分析显示，75岁以上的患者患中风后肠梗阻及相关并发症的概率是年轻患者的2倍。中风后肠梗阻可导致细菌过度生长综合征、肠道屏障通透性增加和营养吸收不良，进而加剧全身炎症。一项针对55例小肠细菌过度生长(SIBO)患者的安慰剂对照临床试验显示，每周使用FMT胶囊(由健康供体制备)治疗4周可显著增加细菌多样性，并显著改善胃肠道症状。中风后自上而下的信号传导机制(可能通过ANS和循环因子)导致肠梗阻仍然是一个重要的临床问题。

8 老年中风后的免疫反应不同

缺血核心区血流的突然减少导致细胞快速死亡。该核心外围的组织仍处于风险之中，但仍可挽救。核心损伤通过谷氨酸兴奋性毒性、异常钙信号传导和氧化应激触发级联炎症和细胞凋亡，再灌注损伤通常会加剧这种反应。依赖于低亲和力模式识别受体(如TLRs和RAGE)，CNS驻留细胞、BAMs和外周来源的先天免疫细胞快速感知血管闭塞后立即产生的DAMPs(如ADP、HMGB1和S100)。血流中断会激活内皮细胞并启动凝血级联反应。BBB破坏和脑源性趋化因子梯度的建立，补体系统被激活，血源性免疫细胞的粘附和迁移在几分钟内完成。

衰老几乎影响了所有与中风早期反应有关的过程。例如，与年龄相关的血浆凝血因子水平的增加(如纤维蛋白原、V、VII、VIII、IX和XI因子)导致老年人处于促凝状态，并增加中风后并发症的风险。相对于梗死面积，出血性转化在老年小鼠中(与年轻小鼠相比)更明显，这与中性粒细胞早期涌入老年大脑产生MMPs(金属蛋白酶)并导致BBB破坏有关。随后的补体激活和吞噬细胞和粒细胞(即MG、肥大细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)的募集启动了损伤神经胶质细胞的清除。虽然清除碎片是必要的，但持续性炎症可导致慢性组织损伤。衰老改变了对缺血性中风的免疫反应，通过靶向骨髓或微生物群操纵外周免疫可以逆转这种年龄依赖性对中风的反应。

8.1 老年动物中风后的MG反应

MG的完全消耗(使用双重CSF1R/c-Kit抑制剂PLX3397)会恶化中风结局，这表明MG在中风后发挥净有益作用，可能是通过抑制受损神经胶质细胞介导的中风后炎症。衰老会影响MG对中风的反应。与年轻MG相比，老年MG产生的TNF-α较少，但产生更多的ROS，并且用年轻骨髓重组的老年小鼠在中风后MG激活降低(FGF的产生和总体粒度降低)。此外，从年轻健康小鼠到老年小鼠的中风后FMT降低了MG激活(降低Iba1并增加P2RY12)。这些结果表明，中风后MG的年龄依赖性作用可能受到肠道微生物调控的影响。

8.2 老年中风后的先天免疫反应

老年动物中风后中性粒细胞浸润增加。老年中性粒细胞吞噬功能降低，但在中风后产生更高水平的ROS和MMP-9。CNS BAMs、DCs和血液来源的单核细胞也是中风后早期反应者。CCR2介导的单核细胞衍生巨噬细胞的募集可通过促进吞噬活性和碎片清除在中风早期发挥保护作用；但它们的持续存在会导致慢性炎症。脾脏和骨髓是单核细胞的主要来源，并促进包括肠道炎症在内的全身炎症。事实上，急性中风患者外周血单核细胞TLR4表达上调与中风的严重程度和炎症损伤呈正相关，表明这些单核细胞参与中风诱导的系统性炎症反应。目前尚不清楚与年龄相关的微生物群变化是否会改变中风后外周来源的中性粒细胞和单核细胞的参与。

DCs可提前到达并在中风发作后的几天内被检测到。在微生物群的控制下，DCs通过分泌IL-23、诱导γδ T细胞表达IL-17并促进中性粒细胞浸润来促进炎症信号传导。在老年小鼠中，中风前脑APCs数量显著更高，并与微生物群中特定的与年龄相关的变化相关(如Akkermansia的丰度与脑APCs数量呈负相关)。中风后浸润骨髓细胞的组成显示，较大的单核细胞贡献迁移到年轻大脑中，但中风后3天有较大的中性粒细胞贡献渗透到老年大脑中。颅骨骨髓含有大量的单核细胞和中性粒细胞，其转录特征与血液来源的对应物不同。重要的是，随着年龄的增长，颅骨骨髓中髓系群体的组成发生了变化，老年颅骨中中性粒细胞明显增多(图4A，原始未发表的数据)，这可能解释了老年中风后与年轻小鼠相比中性粒细胞浸润增加的原因。

图4 颅骨骨髓免疫功能随年龄增长而改变。颅骨骨髓中髓样细胞群的组成随着年龄的变化而变化，年龄较大的颅骨中中性粒细胞的相对频率明显较高(A)。naïve老年小鼠的颅骨骨髓淋巴细胞区室中CD8+ T淋巴细胞和活化的CD11bhigh B淋巴细胞显著高于年轻小鼠(B)。

8.3 老年中风后的适应性免疫反应

中风后1-3天开始出现亚急性反应。由于缺血性损伤和局部炎症，包括BBB、脑膜淋巴管和血液-CSF屏障在内的关键界面受损，使脑源性抗原和细胞因子渗漏到体循环中。在APCs(主要是DCs)的帮助下，自适应臂参与了抗原特异性反应和对呈递的大脑抗原的免疫记忆的发展。B淋巴细胞和T淋巴细胞在淋巴样器官(如脾脏和颈部淋巴结)中进行克隆扩增，并返回循环以产生全身反应。循环淋巴细胞亚群增加(如CD4+CD28-超过8%)与中风后复发和死亡的风险增加有关。血液中IL-17+ T细胞的增加与中风后认知功能障碍的加重相关，表明淋巴细胞的抗原激活对中风的长期后遗症如认知能力下降和自身免疫有贡献。事实上，自身反应性B细胞和T细胞早在中风后4天即可检测到，中风后2周收集的中风患者的循环淋巴细胞对脑抗原(如髓磷脂)的免疫反应比对照组更强。

从非中风SPF小鼠到GF小鼠的中风前细菌定植(通过共同饲养)对GF小鼠具有神经保护作用(减少梗死体积，增加IL-1β和TNF-α)。这种微生物群的有益作用在淋巴细胞缺陷型GF (GF Rag1-/-)小鼠中被消除，表明来自健康供体的微生物群导致中风后淋巴细胞介导的神经保护。最近的报告表明，从局部颅骨骨髓中提取的脑膜B细胞提供暴露于脑抗原的持续B细胞供应。此外，我们发现，与年轻颅骨相比，naïve老年小鼠的颅骨骨髓中含有显著更高的CD8+ T淋巴细胞和活化的CD11bhigh B淋巴细胞(图4B，原始未发表数据)。在没有急性CNS损伤的年轻小鼠中，血源性抗原经历的B细胞存在于老年小鼠的脑膜中，但在年轻小鼠中不存在。

未来的研究需要确定这些年龄依赖性骨髓细胞和淋巴细胞的异质性是否对中风后反应有不同的贡献。急性脑缺血后肠道微生物群的接近性、时间参与和细胞特异性调节，加上随年龄增长淋巴清除速度缓慢，可能导致长期暴露于新型CNS抗原，这可能导致中风患者自身免疫和长期认知能力下降的发生率增加。

这些研究结果表明，衰老改变了中风后的先天性和适应性免疫反应，中性粒细胞浸润增加，外周来源的APCs更早参与，以及与来自外周淋巴器官(如外周骨髓、脾脏和胸腺)的免疫细胞相比，颅骨骨髓来源的免疫细胞的贡献可能不同(图5)。可以推测，与年龄相关的保护性细菌(如Akkermansia或SCFA-生产者)的减少可能导致肠道屏障功能降低。然后激活DCs以刺激γδ T细胞，增加它们向大脑的迁移并增强IL-17的产生，从而导致中风后从血液或颅骨骨髓中额外募集中性粒细胞进入老年大脑(图3B)。未来的实验需要阐明与年龄相关的肠道微生物群变化在中风后细胞特异性免疫反应和中风的长期结果(如认知能力下降)中的作用。

图5 老年和年轻中风差异的关键因素以及与年龄相关的肠道微生物群变化对中风后反应的作用。相当大比例的老年中风患者身体虚弱，这与脑血管疾病的发病率有关，预示着中风后生存期较短。中风后老年动物的中性粒细胞浸润及ROS产生增加。在老年小鼠中，中风前脑抗原呈递细胞(APCs)的相对频率显著更高。与年轻小鼠颅骨相比，naïve老年小鼠的颅骨骨髓含有明显更高的中性粒细胞、CD8+ T淋巴细胞和活化的CD11bhigh B淋巴细胞。免疫和自主神经系统的主要年龄相关变化有助于中风后的年龄特异性反应。老年微生物群与短链脂肪酸(SCFAs)和色氨酸代谢物的生成减少有关，这两种物质都是免疫和生理屏障(如BBB和肠道屏障)的主要调节因子。中风后补充SCFA产生菌和菊粉可显著降低神经炎症并改善中风预后。ANS，自主神经系统；HPA，下丘脑-垂体-肾上腺。

9 衰老会恶化中风引起的生态失调

中风后自上而下的信号传导由三个方面介导：(1)对脑源性信号的系统免疫反应(如单核细胞和中性粒细胞迁移)、(2)影响肠道屏障功能的HPA轴的激活以及(3)交感神经的激活和副交感神经驱动的丧失破坏了ENS介导的肠道运动以及EECs和Paneth细胞的胃肠道分泌物。这些自上而下的过程引起中风后生态失调，通常叠加在与年龄相关的生态失调和免疫衰老的背景下。中风后生态失调通过自下而上的信号传导加剧全身炎症，形成损伤和持续炎症的恶性循环。

9.1 MGBA在中风后作用的临床研究

表4提供了关于MGBA在中风中作用的临床研究的最新总结。研究发现，与健康对照组相比，中风患者样本中的细菌多样性有所下降。Yamashiro等人发现，在日本中风患者队列中，瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)增加和SCFAs(乙酸和戊酸)减少与中风后炎症标志物(C反应蛋白升高和白细胞计数增加)呈正相关。Xia等人报道中风患者中副拟杆菌属(Parabacteroides)、Oscillospira和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌富集，而Prevotella、罗斯氏菌属(Roseburia)和粪杆菌属(Faecalibacterium)则减少。Xu等人表明，较高丰度的肠杆菌科细菌与较差的预后呈正相关。一个定义明确的针对中风后生态失调的疾病特异性微生物指纹图谱需要对合并症、地理、饮食、药物、种族、性别和年龄进行适当控制的大型患者队列。

表4 MGBA在中风中作用的临床研究总结。

CRP ， C 反应蛋白； ESR ，红细胞沉降率； IBD ，炎症性肠病； MACE ，主要不良心血管事件； NIHSS ，美国国立卫生研究院卒中量表； TIA ，短暂性脑缺血发作； TMAO ，氧化三甲胺。

9.2 MGBA在中风后作用的临床前研究

表5提供了关于MGBA在中风中作用的临床前研究的最新总结，分为使用年轻动物模型和使用老年动物实验性中风模型的研究。在临床前模型中，与SPF小鼠相比，GF小鼠和抗生素治疗小鼠中完全缺失微生物群会导致更差的中风预后，这表明年轻微生物群的净有益作用。此外，从非中风SPF小鼠到GF小鼠的中风前细菌定植降低了梗死体积，增加了MG/巨噬细胞计数，并增加了GF小鼠的脑细胞因子(IL-1β和TNF-α)，表明来自年轻健康供体的中风前微生物群有可能在中风后发挥神经保护作用。另一方面，从SPF小鼠到GF小鼠的中风前FMT可增加GF小鼠中风后脑梗死体积，加重神经功能缺损。一直以来，从中风患者到抗生素治疗小鼠的中风前FMT增加了受体小鼠的梗死体积和神经功能缺损。这些结果表明，来自健康供体的微生物群在中风前定植具有神经保护作用，但对不健康微生物群的定植(如老年人、既往有中风或其他神经系统疾病的患者)对中风预后具有不利影响。既往中风对新中风免疫反应的影响具有重要的临床意义，应进一步研究。

重要的是，老年小鼠不仅具有基线失调状态，而且更容易受到中风引起的生物失调的影响，这是通过增加肠道通透性和细菌易位导致的败血症来衡量的。老年小鼠接受来自年轻供体的中风前FMT治疗后，生存率提高，循环细胞因子(IL-6、TNF-α、Eotaxin和CCL5)减少，并改善了中风后的行为结果，虽然梗死面积没有改变。这表明，老年中风患者的微生物群年轻化可能是一种很有前景的预防疗法。除少数研究外，大多数临床前研究都是在年轻小鼠中进行的，并且在中风发作前进行了微生物群操作，这两者都显著降低了结果的转化值(表5)。

表5 MGBA在中风中作用的临床前研究总结(按年龄划分)。

FMT，粪便微生物群移植；IEL，上皮内淋巴细胞；IL-10，白细胞介素10；MCAO，大脑中动脉闭塞。

10 基于微生物群的中风治疗

10.1 益生菌和益生元

益生菌(活细菌)和益生元(促进微生物群组成和活性变化的选择性发酵成分)可以替代临床FMT。例如，中风前给药人参皂苷提取物可通过增加长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)来调节GABA-b受体，对大鼠具有保护作用。中风前给药益生菌也可以抑制促炎细胞因子(TNF-α和IL-6)的产生，减少海马神经元损伤，并恢复小鼠卒中低灌注模型中的空间记忆行为。最近的一项meta分析显示，中风患者补充肠道益生菌与血清TNF-α、IL-6和IL-10水平下降有关。补充益生菌还降低了中风后并发症的发生率，包括食管反流、腹胀、便秘、腹泻、胃潴留和胃肠道出血。

10.2 短链脂肪酸

膳食纤维和抗性淀粉通过细菌发酵降解为乙酸、丙酸、丁酸和其他类似分子(5碳或更少)，称为SCFAs。SCFAs可降低肠道炎症细胞因子，调节肠道分泌，促进肠道蠕动。虽然宿主可以产生一些SCFAs(如乙酸)，但大量SCFAs是由肠道微生物群产生的。SCFAs通过多种方式发挥作用，包括结合GPCRs (G蛋白偶联受体)、通过细胞膜的被动扩散、刺激组蛋白乙酰转移酶、抑制HDAC3(组蛋白去乙酰化酶3)、稳定HIF(低氧诱导因子)和具有血管活性。SCFAs(FFAR2/3)的GPCRs在上皮细胞、肠内分泌细胞、先天免疫细胞以及迷走神经传入纤维上表达。SCFAs(丁酸)增加了AMPs和促炎细胞因子(IL-6和TNF-α)的产生，表明SCFA在宿主抗菌防御中发挥作用。SCFAs可降低小鼠巨噬细胞产生的脂多糖诱导的TNF-α、IL-1β和IL-6。这些发现表明，SCFAs的作用是细胞和通路特异性的。鉴于其半衰期短(25分钟至3小时)，需要进一步的证据来确定生理相关浓度的SCFAs是否能够到达大脑。

10.3 中风中产生SCFA的细菌

与年龄相关的SCFA产生菌的缺失与中风风险因素、与年龄相关的认知能力下降和中风恢复有关。对高血压患者的粪便宏基因组分析显示，SCFA的利用率下降，而从高血压患者供体到GF小鼠的FMT显示了通过微生物群传递高血压表型的可能性。GF小鼠与丁酸产生菌的单定殖提高了BBB的完整性。我们的实验室研究表明，与具有年轻微生物群的GF小鼠相比，单是老年微生物群就足以产生较低的粪便SCFAs，并导致GF小鼠认知缺陷增强。这表明，在没有急性缺血性中风的情况下，与年龄相关的生态失调(以SCFAs减少为特征)会导致中风风险因素和认知能力下降。

新出现的证据表明，即使在具有年轻FMT或任何靶向操作微生物群的老年小鼠中风后初期，也可以利用微生物群组合物进行治疗用于改善恢复。中风后3天开始使用SCFA产生菌(B. longum、C. symbiosum、F. prausnitzii和L. fermentum)和菊粉(SCFA产生菌的益生元底物)进行中风后细菌治疗，(1)增加了大脑和血浆中的SCFAs水平，(2)增加了粘蛋白相关基因的表达，并改善了肠道屏障功能，(3)减少大脑(而非肠道)中产生促炎性IL-17的γδ T细胞的频率，以及(4)改善老年小鼠中风恢复(改善神经功能缺损、运动功能、握力和抑郁表型)。这些有益作用与梗死面积无关。值得注意的是，这些对中风预后的影响与宿主的实际年龄无关，而是由微生物群或其代谢物的年龄介导。作为对这一发现的补充，最近的一项研究表明，IL-17+ γδ T细胞从肠道LP运输到软脑膜并增加中风后的神经炎症。中风后SCFAs的有益作用可能是通过增加缺血脑组织中的抗炎性IL-10和减少肠道来源的IL-17+ γδ T细胞来介导。这些结果表明，靶向微生物群组成和功能的中风后疗法可能是一种有前景的临床策略，为中风的治疗提供了一个更长的治疗窗口。

胆汁酸(BAs)由肝脏中的胆固醇合成，促进脂质的乳化和吸附。BAs通过AMPs和免疫调节改变肠道微生物群的组成。相反，肠道微生物通过胆盐水解和脱羟基作用将初级BAs转化为次级BAs。肠腔中的BAs通过直接途径(体循环)和间接途径向CNS发出信号，通过FXR(法尼醇X受体)信号传导和TGR5-GLP-1 (Takeda G蛋白偶联受体-GLP-1)信号传导介导。BAs破坏了BBB间隙连接蛋白(occludin)，增加了BBB通透性。在微生物群调节的BAs激活TGR5后，一部分EECs(L-细胞)产生GLP-1。GLP-1可被迷走神经传入纤维表达的GLP-1受体感知，参与糖代谢和能量稳态。BAs代表了影响MGBA信号传导的微生物-宿主代谢的复杂相互作用。

10.4 中风中的BAs

BAs在胆固醇稳态中发挥重要作用，并与动脉粥样硬化的发展有关，动脉粥样硬化是中风的主要风险因素。最近的一项研究表明，中枢神经系统TGR5信号的直接激活可以抵消饮食诱导的肥胖，而下丘脑TGR5的基因下调则可以促进肥胖。BAs还调节炎症和代谢紊乱。例如，BAs通过TGR5-cAMP-PKA轴抑制NLRP3炎症小体激活(一种主要的宿主防御机制)。一项针对777名AIS患者的单中心回顾性研究根据血清总BAs的四分位数分为4组，结果显示，入院血清BAs升高与中风后3个月死亡率降低相关，表明BAs对缺血性中风患者具有保护作用。有趣的是，同一研究中血清BAs最高的患者WBC计数最低，这表明BAs具有潜在的抗炎作用。另一项研究表明，粪便中BA排泄量降低可能是中风的独立风险因素。从不同样本类型(血清与粪便)的高水平相关临床数据中可靠地推断出机制见解具有挑战性。然而，这些回顾性研究清楚地表明了微生物群在BAs稳态中的作用，以及BA介导的多种中风风险因素的调节。未来的研究需要确定与年龄相关的肠道微生物群变化和中风引起的生态失调对中风风险和恢复背景下的BAs代谢的影响。

10.5 调节色氨酸代谢物的细菌

色氨酸的宿主代谢是通过TDO(色氨酸2,3-双加氧酶)和IDO(吲哚胺2,3-双加氧酶)通过犬尿氨酸途径，以及通过色氨酸羟化酶的5HT途径进行的。色氨酸的微生物代谢是通过色氨酸酶阳性细菌和色氨酸酶阴性细菌通过吲哚途径进行的。微生物群衍生的基于吲哚的代谢物和宿主衍生的基于犬尿氨酸的代谢物是AHR的生理相关内源性配体。例如，AHR的激活促进naïve T细胞分化为抗炎性Treg细胞，且通过微生物依赖性吲哚基配体激活AHR可减少EAE中星形胶质细胞介导的神经炎症。色氨酸也是5HT合成的前体，它可以调节宿主EECs和ANS之间的信号传导，如上所述。未来的研究需要检查AHR的微生物依赖性色氨酸配体在中风后神经炎症中的作用。

衰老与氨基酸代谢失调有关，氨基酸代谢失调是导致免疫衰老和炎症的一个原因。多种氨基酸(如谷氨酰胺、精氨酸和色氨酸)都与年龄相关的免疫重塑有关。色氨酸由宿主(犬尿氨酸和5HT途径)和微生物群(吲哚途径)代谢。衰老与IDO/TDO介导的色氨酸分解为犬尿氨酸代谢物的增加有关，并导致年龄依赖性血清犬尿氨酸升高。色氨酸从吲哚途径(由微生物调控)向犬尿氨酸途径(由宿主调控)的代谢分流与中风后炎症反应有关。Cuartero等人发现，犬尿氨酸激活AHR会加剧缺血后的急性脑损伤。中风后药理抑制AHR可降低脑内炎症细胞因子(IL-1β、IL-6、IFN-g、CXCL1和S100b)水平，并改善中风预后，这表明宿主衍生的犬尿氨酸代谢物激活AHR通路在中风反应中起着不利作用。然而，AHR激活的作用是高度配体和细胞特异性的，未来的研究需要阐明微生物衍生(基于吲哚)和宿主衍生(基于犬尿氨酸)的AHR配体在中风后的作用。

10.6 氧化三甲胺

饮食对微生物群有深远的影响。例如，通过大量摄入胆碱前体(左旋肉碱和磷脂酰胆碱，在红肉和鸡蛋中发现)可以增加微生物群产生的氧化三甲胺(TMAO)。微生物群衍生的TMAO与心血管事件的风险增加有关。TMAO的产生涉及通过微生物裂解酶将胆碱和左旋肉碱转化为TMA(一种有气味的气体)。TMA通过门静脉到达肝脏，之后黄素单加氧酶将其转化为TMAO。健康参与者在用抗生素抑制微生物群之前和之后膳食摄入TMAO前体(如磷脂酰胆碱)后血浆和尿液中TMAO水平的临床研究表明，TMAO的产生依赖于微生物群的代谢。血浆中胆碱和甜菜碱水平较高会使主要不良心脑血管事件(包括中风)的风险增加1.9和1.4倍。重要的是，TMAO对中风严重程度和预后的不利影响可以通过FMT转移，前提是存在微生物裂解酶将胆碱转化为TMA。另一项研究表明，在喂食富含胆碱的饲料以增加TMAO合成的小鼠中，促炎Ly6Chigh单核细胞的水平较高，但如果在喂食富含胆碱的饲料的同时服用抗生素，则这种炎症性单核细胞的增加会被消除。FMT研究表明，中风严重程度具有可传播性，TMAO途径可能是这种可传播性的介质。具体而言，微生物cutC基因(胆碱转化为TMA所需的基因)足以增加中风后TMAO的产生并增加梗死面积。已经回顾了TMAO在脑血管疾病中的作用。饮食的改善可能对宿主和微生物群都有很大的影响。

结论

人们对神经系统疾病的看法已经从以大脑为中心的单一器官观点演变为更综合的系统观点。中风和神经退行性疾病会诱发系统性反应，其中肠道微生物群起着关键作用。越来越多的证据支持肠道微生物群在中风后年龄依赖性MGBA信号传导中的作用。这些观察结果鼓励了微生物学、免疫学、内分泌学和神经科学领域之间的合作。在临床环境中，目前正在研究微生物群组成的差异，以优化治疗选择、监测治疗疗效，并提高临床预后。许多基本问题仍有待回答，临床前模型的局限性继续影响着转化研究。重要的是，常见的临床前中风模型与典型的中风患者之间仍存在显著差异。典型的小鼠模型使用的是没有血管风险因素的10至12周大的雄性小鼠(相当于青少年)。相比之下，典型的中风患者是75岁，具有多种血管风险因素，服用多种药物。需要适当的衰老动物模型和转化方法来利用在衰老和中风中操纵MGBA轴的潜力。了解宿主及其微生物群共同进化的作用提供了新的治疗视角，以帮助患有神经发育、行为、神经退行性和脑血管疾病的患者。