尿路结石病:抑制剂、启动子和大分子在肾结石形成中的作用

尿路结石病:抑制剂、启动子和大分子在肾结石形成中的作用

肾结石的形成绝对取决于泌尿道中微溶性盐（主要是草酸钙）的成核。在日常条件下，尿液中草酸钙过饱和，偶尔我们都会在尿液中排出草酸钙晶体。然而，我们并非都患有肾结石。为什么？因为尿液中含有一系列低分子量和高分子量成分，这些成分能够抑制晶体的成核，或者，如果晶体有核，则通过生长或聚集成足以阻塞肾脏集合小管的颗粒来防止它们扩大。相同的分子也可能影响晶体附着在肾上皮上或直接在肾上皮上成核的可能性。有些也被阻塞在尿晶体的矿物质体积中，通过破坏它们的晶体结构，它们可能有助于它们的肾内降解、溶解和处置。本章回顾了关于尿低分子量成分和大分子在结石矿物晶体形成中可能和矛盾的作用及其在人肾结石发展中的潜在功能。    

1介绍

尽管本章中介绍的大多数信息主要与草酸钙（CaOx）有关，因为它是人类肾结石中最丰富和最普遍的矿物质成分，但在许多情况下，它同样适用于其他钙盐。我广泛使用术语抑制剂来描述延迟结晶过程的任何方面或晶体附着到细胞的分子或离子，尽管事实上，在最严格的意义上，它应该仅用于描述那些与晶体表面结合的物质。 1 我省略了植酸盐以外的植物产品的报告，并将抑制作用的基本物理化学机制的详细讨论留给了专家，例如Kavanagh的第 3章 和发表的评论。 2-4  不包括通过增加过饱和度来促进结晶，因为这在前一章中也有讨论。  

3.尿路草酸钙结晶

结石形成涉及几个关键事件的级联，首先是尿液中微溶性盐的过饱和度 - 最常见的是CaOx。尿液中CaOx的过饱和度不断波动，这取决于水合作用的状态和含有钙和草酸盐的食物的饮食摄入量。尽管如此，在日常条件下，大多数人的尿液都被盐过饱和，这可能导致尿液收集系统内的晶体成核。虽然没有晶体就不会形成结石，但它们的成核并不是结石病的代名词，因为我们所有人都偶尔会经历结晶。 事实上，只有大约10%的人会结石，这表明大多数晶体不受阻碍地通过肾脏，并在尿液中无害地排出。因此，从晶体成核到结石的进展需要将晶体保留在肾脏内，这被认为是通过游离部分或固定颗粒机制发生的。这两种机制之间的主要和关键区别在于，自由颗粒结石的形成被假设为一个物理过程 - 由大量晶体引起的肾小管的机械，对数干扰阻塞。另一方面，固定颗粒结石的形成被视为一系列生理过程的产物，涉及上皮细胞表面损伤以及其表面上的分子基序与晶体表面上的原子阵列、离子和大分子之间的相互作用。  

2.1自由颗粒结石形成

图 4.1 显示了结石形成的“自由粒子”理论所涉及的事件。 4.1.   图 4.1

插图描绘了“自由粒子”结石形成所涉及的事件。尿液中草酸钙（CaOx）的过饱和导致晶体成核，然后晶体可以生长并聚集形成较大的晶体簇。如果过饱和度足够高，大量的晶体可以通过对数干扰过程成核并阻塞小管，这可能会磨损上皮膜并导致低（红星）和高（红色“蠕虫”）分子量的释放 血液和组织成分 尿液中CaOx的过饱和导致晶体成核，如果尿液保持过饱和，晶体可以通过在其表面上沉积额外的溶质（生长）和聚集形成簇来扩大。每个过程在图 4.1 中分别描述，但两者都可以同时发生。单独生长不会导致肾内晶体被困，因为即使是高度的过饱和度也无法在新形成的晶体表面上充分沉积新的CaOx以引起肾小管阻塞。 另一方面，聚集能够在短时间内形成更大的晶体颗粒，因此被认为是颗粒增大的两种机制中更重要的。 复发性结石形成者比健康受试者排泄更多的大CaOx晶体簇的观察结果 支持了这一点， 但在没有高度过饱和度和大晶体数的情况下，单独聚集也不太可能在短时间内阻塞小管。然而，如图 4.1 所示，两个过程同时发生都可能导致晶体潴留，特别是在产生大晶体阵雨的条件下，这将产生局部炎症、损伤以及组织和血液成分释放到尿液中。   因此，自由粒子理论提出，管状闭塞是通过晶体的自发成核发生的，随后晶体生长并聚集到可以阻塞收集管道的大小。该理论受到挑战，因为新形成的晶体不会在肾脏中停留足够长的时间，以允许生长产生足够的颗粒增大以实现管状闭塞。 然而，这在理论上肯定是可行的， 从未被反驳过，并且得到了工作的支持，证明人造结石扩大到生理上麻烦的大小与高生理浓度的钙和草酸盐以及悬浮在周围介质中的晶体数量有关。 然而，目前人们普遍认为，大多数结石更有可能来自“固定颗粒”机制。  

2.2固定颗粒结石形成

结石形成的“固定颗粒”理论倾向于将晶体直接成核到肾上皮上，或将先前沉淀的晶体附着在肾上皮刷状边界膜上，如图 4.2 所示。   图 4.2

“固定粒子”结石形成的示意图。尿液中CaOx的过饱和导致晶体成核，然后晶体可以直接附着在上皮细胞膜上，在那里它们可以作为晶体以后成核的屏障。在连续的尿过饱和期间，结合的晶体可以生长并与随后成核的其他晶体聚集。附着、生长和聚集的组合随后导致肾小管闭塞、上皮损伤以及低（红星）和高（红“蠕虫”）分子量血液和组织成分的释放 上皮表面晶体的存在将有效地减小管腔直径，阻碍尿液的流动和上游形成的任何晶体的通过，并增加它们粘附在已经附着在管壁上的晶体的可能性。随着时间的推移，小管会被晶体阻塞，如上所述，会引起局部刺激和损伤，并将血液和结构分子释放到尿液中。二水合CaOx（COD）的成核发生在培养的肾细胞上， 许多研究表明，相同的细胞结合CaOx一水合物（COM） 10-15 和COD。 16 肾小管内结合已被证实在成岩大鼠 17 和患有原发性高草酸尿症的患者中体内发生。 18 读者可以参考Khan的第 5章 ，详细了解导致细胞损伤和晶体粘附在肾上皮细胞上的因素。在这里，讨论将主要限于尿液本身和抑制或介导晶体粘附的选定分子。  

2.3结石形成的抑制剂理论

很明显，从过饱和尿液到晶体再到结石的进展是通过几个中间步骤进行的，涉及自由或固定颗粒机制。然而，无论哪种机制在体内起作用，我们中很少有人会形成结石，尽管我们的尿液通常被CaOx过饱和。因此，人体必须能够防止泌尿道内的晶体成核，或者如果晶体有核，则它们保留在肾脏中。这个概念并不新鲜。 五十年前，霍华德和托马斯 表明，来自健康个体的尿液可以抑制Rachitic大鼠软骨的钙化，而来自结石形成者的尿液则不能。他们提出，健康个体的尿液中含有防止钙化的“预防剂”，而钙化在结石形成者的尿液中不存在或缺乏钙化。古怪的术语“预防者”后来被“抑制剂”取代，后者迅速成为所谓的结石形成的抑制剂理论的主要主角。该理论的基础如图4.3 所示，其中显示了从过饱和尿液中新沉淀的CaOx晶体。低分子量和高分子量抑制剂立即附着在晶体表面，并通过聚集或沉积额外的钙和草酸离子来延缓或阻止晶体颗粒的增大。     图 4.3

该图描述了抑制剂在结石预防中的假定作用。尿液含有低分子量（星星）和高分子量（“蠕虫”）成分，它们附着在新形成的晶体表面并抑制或延缓其生长和聚集，使它们在尿流中无害地通过 由于通过饮食或药物操作纠正一个人的抑制缺陷来预防结石的令人兴奋的可能性，研究人员开始探索能够防止肾结石形成的天然和合成药物。这主要是通过测试这些试剂对（1）实验动物诱导的结石晶体形成的影响来实现的;（2）结石晶体附着在培养的肾上皮细胞上;或（3）石盐在体外简单的结晶系统中结晶。这些方法产生了大量有价值的信息，但必须记住，它们仍然只是模型，迄今为止收集的大量信息并不总是一致的也就不足为奇了。造成这种情况的原因有很多：  

3测量结晶和细胞粘附的抑制和促进

3.1结晶的复杂性

如图 4.1和4.2 所示，在结石发病机制中，“结晶”现象实际上包括几个不同但相互依存的步骤，即成核、生长和聚集，每个步骤都可能受到给定分子的不同程度的影响。例如，成核可以通过充当异质种子的特定大分子促进，或者螯合钙和草酸离子以产生高局部过饱和水平的CaOx。它也可以通过结合钙或草酸盐的分子来预防，从而将过饱和度降低到不太可能发生沉淀的水平。单一试剂可以通过与胚胎晶体表面结合来抑制胚胎晶体的生长和聚集;或者它可能影响聚集，但对生长没有影响。或者，即使不不可逆地附着在晶体表面，它也可能抑制，例如Tamm-Horsfall糖蛋白（THG）发生的情况，它可以通过妨碍来防止晶体之间的碰撞。 20  

3.1.1工作材料的不确定性：特性、纯度和来源

除了那些涉及低分子量材料（可以从知名公司获得高纯度状态）之外，许多研究都使用了大分子，其身份尚未得到明确证明，要么通过使用特定抗体的蛋白质印迹，要么通过使用其他结论性技术的直接序列分析。即使一个分子的身份是已知的，并且它已经从人类尿液、血液或组织中纯化出来，它也可能无法纯净。它也不一定是生理活性形式。例如，完全完整的尿骨桥蛋白（OPN）在SDS-PAGE上以50-60 kDa的速度迁移， 21 但通常有多个条带是明显的， 22 因为蛋白质被内源性尿丝氨酸蛋白酶消化。23， 24 OPN的完全磷酸化是抑制羟基磷灰石形成 25 和CaOx晶体生长所必需的， 26 但很少提及抑制研究中使用的OPN的磷酸化程度。   纯化蛋白质的过程，特别是如果它涉及重复的冻融步骤，会导致不可逆的分子碎裂和对其体内活性至关重要的官能团的去除。然而，蛋白质在各种结晶系统中的影响通常没有关于其纯度状态的任何信息。工作也经常使用质量可疑的大分子的商业制剂进行。Rodgers等人 27 表明，人血清白蛋白的商业制剂被其他蛋白质污染，其抑制作用不同于从人尿液中纯化为均质的蛋白质。大分子甚至可能来自外来物种。 28 因此，已发表的研究结果可能与生理条件下实际发生的情况几乎没有相似之处。  

3.1.2方法的多样性

自Howard和Thomas的开创性工作以来，19已经设计了一系列富有想象力的体外结晶系统 2 ， 29 ， 以 评估尿液本身，无机离子和小分子，分馏和总尿大分子，脂质，单个尿蛋白和糖胺聚糖（GAGs）以及人造聚合物的抑制作用。这些实验模型基于简单的无机溶液，人造无机尿液，凝胶以及整个或加工过的尿液，并且需要使用封闭批次，连续或恒定成分结晶器以及其他不太传统的技术，包括冷冻 30 和非常新颖的“石头农场”。 31 使用这些技术，研究人员根据粒度分析、浊度、放射性示踪剂和原子吸收分光光度法测量了成核、生长、聚集或这些过程的组合的速率和程度，仅举几例——无声地证明了尿石症研究人员的丰富创造力！正如使用如此不同的方法所预期的那样，其中大多数方法涉及使用无机水介质而不是尿液，研究结果往往是不确定的，生理上无关紧要，令人困惑，有时甚至是完全矛盾的。THG再次是一个有用的例子。根据用于诱导结晶的特定方法，THG促进和抑制CaOx晶体形成。 32  

3.1.3必要但不完美：实验细胞模型

永远不可能忠实地再现人类肾单位中运行的所有物理或生化条件，因此始终有必要从体外实验中产生的数据中推断生理条件下可能发生的情况。   显然，永生化培养细胞并不代表实际衬里泌尿道的上皮细胞，因此我们不能确定浸泡在合成培养基中的培养细胞的晶体粘附是否真正反映了人类肾脏中发生的事情。此外，研究使用了不同的培养细胞系，例如，来自小鼠内髓质集合管（IMCD）， 33 人肾癌（CAKI-I），34正常大鼠肾脏（NRK-52E）， 35 非洲绿猴肾（BSC-1），狗肾（MDCK）和小鼠成纤维细胞BALB / c3T3。 36 反应条件（pH、时间、试剂浓度、培养基）以及所用细胞的来源（近端、远端或集合管）各不相同。37， 38 粘附还取决于细胞是受损还是完整， 39-41 增殖，再生或汇合。 10 ， 38 ， 40 ， 42 最后，大多数细胞附着系统使用水溶液作为结合介质，不能替代尿液本身。即使使用了尿液，经过几个小时的静态储存，尿液也已经从膀胱排出，只是经过各种清理程序，其中一些程序被公认为会改变其大分子含量。所有这些差异都不利于对实验结果的直接比较。  

3.1.4所见即所得：不一定是现实生活中实际发生的事情

鉴于实验模型明显且不可避免的不足，绝不能假设抑制剂对结晶的影响，或在实验条件下晶体附着在细胞上，准确地再现了它在体内结晶中实际具有的影响。最重要的是，晶体在体外甚至在动物模型中结晶或附着在细胞上，“不是”结石形成的同义词。多年来一直强调石材研究的这一公理，以及模型的优点和不足; 29 因此，令人失望的是，根据从无机模型获得的数据，牛血清白蛋白在抑制人类尿结石形成方面起着重要作用（我强调） 28 ！   总的来说，这些因素必须引起对实验结果与生理条件相关性的合理怀疑。从体外工作中产生的数据进行推断是无效的，通常使用与现实生活相距几光年的材料和条件，对启动子或抑制剂的预期作用做出假设，不仅在肾脏内的全尿中，而且在结石形成中。事实将永远是体外效果   体外效应≠体内效应≠结石形成中的特异性作用。   体外效应≠ 体内效应 ≠ 结石形成中的特异性作用 。 体内≠作用≠结石形成中的特定作用。   尽管如此，撇开我们对实验方法的任何合理疑虑，有压倒性的证据表明尿液中含有各种低分子量和高分子量物质，这些物质对CaOx晶体的形成，生长和聚集以及这些晶体与肾细胞的附着具有深远的影响。当然，关于某些泌尿成分的生理意义的夸张主张应该谨慎看待，但否认它们在生理条件下可能是惰性的，是在面对多年精心进行的实验工作、化学和物理原理以及朴素的常识。  

4.CaOx结晶的抑制剂和启动子

4.1CaOx晶体成核的促进子

如图 4.1和4.2 所示，结石形成的首要条件是晶体成核。人们普遍认为，CaOx晶体在体内的沉淀必须是非均相的，因为尿液中的过饱和度水平很少足以使晶体均匀（自发）形成。尿液不是一个明确的解决方案。它包含许多颗粒，包括整个细胞、膜囊泡和其他细胞碎片——由于正常的代谢周转，或者由于高草酸盐浓度 43 ， 44 或晶体本身引起的细胞损伤，碎片从尿路上脱落。   膜碎片和脂质是结石和尿晶体的常见成分。 46 从结石基质中提取的脂质可以催化无机亚稳溶液 47 中CaOx的沉淀，尿颗粒和膜囊泡可以使人尿中的CaOx晶体成核。 48 然而，目前体外研究的有限证据表明，脂质组装作为COM晶体成核的起始位点，作为结石形成的第一步。尽管如此，有一些迹象表明，与细胞表面唾液酸部分偶联的糖蛋白和脂质可以作为成核模板。例如，COD晶体可以直接成核到培养的肾细胞表面， 9 几乎完全通过（001）面，除非首先用蛋白酶或神经氨酸酶处理细胞，这会导致切换到（100）晶面。 49 因此，在体内高过饱和度的条件下，尿路上皮细胞表面的分子阵列可能控制具有特定习性和取向的CaOx晶体的成核。   据我所知，没有研究最终证明任何单个尿大分子通过分子模板特异性地诱导CaOx成核。普通尿大分子 50 和硫酸软骨素（CS） 51 可促进无机介质CaOx成核，THG 32 ， 52 增强尿液中CaOx的沉积。还有间接证据表明，尿大分子在成核点积极参与CaOx晶体的形成，因为断裂的尿COM晶体显然含有集中在其中心的有机物质。 53-55  事实上，他们有可能真正启动这个过程，尽管这是通过分子模板还是异质成核发生仍然没有意义。因此，体内成核很可能是由脂质或细胞碎片 46 ， 48 诱导的，或者可能是由结合和螯合钙离子的大分子诱导的。然而，几乎所有已被检查其效果的泌尿成分都被证明可以作为抑制剂。  

4.2CaOx 结晶抑制剂

无数的天然和合成物质延缓CaOx结晶。该列表包括金属离子——尤其是镁;简单的二羧酸和三羧酸，如酒石酸和柠檬酸;其他低分子量化合物，如焦磷酸盐和植酸盐;大分子，包括蛋白质和GAG;各种植物和蔬菜的提取物;不同长度的合成肽;和染料星系。 56 因为我们的目标是发现结石是如何形成的，所以很明显，只有尿液中天然存在的抑制剂才值得关注。然而，无毒、低分子量的化合物易于吸收并排泄到尿液中，并抑制CaOx结晶，通过作为治疗剂给药提供了预防结石的可能性。尽管如此，以下信息主要涉及在肾细胞中发现和/或存在于人类尿液中的抑制物质，我将从尿液本身的研究开始。  

4.2.1尿液对CaOx结晶的影响

尿液是CaOx结晶的有效抑制剂 - 无论其如何测量。1970年代初开始发表许多论文，比较结石形成者和健康对照对CaOx结晶至少一个方面的尿液的抑制作用。 其中一些5 ， 50，57-59 报告在结石患者的尿液中缺乏抑制活性，尽管不一致。例如，Springmann等人 59 表明，来自对照受试者的5%尿液比来自结石患者的尿液更能有效地抑制晶体聚集，但在成核速率，线性生长或最终晶体质量方面没有观察到这种差异。许多其他人也无法找到差异， 60-66 这可能并不出乎意料，因为大多数报告都涉及在无机反应系统中使用低浓度的尿液。此外，在大多数研究中，没有对尿液样本进行筛查以确认没有血液，特别是在结石形成者中，这将不可避免地改变尿液的大分子含量，从而改变抑制活性。   随着人们越来越认识到稀释样品不足以评估尿液的抑制能力，并且结果高度依赖于所使用的方法，到1980年代末，通常放弃了对单个尿液样本的总体抑制活性的测量。尽管在1999 67 和2000年代初短暂地重新审视了它， 68 ， 69 但方法论的缺点从未被克服。因此，健康受试者尿液和结石形成者尿液的抑制活性之间的差异从未得到明确证明，重点已主要转移到测量对单个药物的CaOx或磷酸钙（CaP）结晶的影响，以及它们在结石患者中的排泄模式。这些研究的结果将在下一节中讨论。  

5CaOx晶体-细胞粘附的抑制剂和启动子

5.1尿液和通用尿液大分子

人尿抑制晶体粘附。 70 此外，据报道，来自儿童的样本比来自成人的样本具有更强的抑制作用， 71 来自健康成年人的样本比来自结石形成的样本显示出更大的效力。 72 活性与大分子级分 71 ，73， 74 相关，其作用与蛋白质浓度 73 成正比，并且与结合介质的pH值有关。 75 与人造尿液产生的晶体相比，尿液中沉淀和生长的晶体与细胞的结合程度较低， 73 这与自然形成的结石晶体对肾上皮细胞的伤害比无机晶体少的观察结果一致。 76 尽管如此，观察到的尿液抑制作用的大约一半可归因于小分子， 73 其中至少两个可能是柠檬酸盐，这减少了COM 77 和羟基磷灰石 78 晶体与培养的肾上皮细胞和镁的附着，这也减少了结合。 79 ， 80   刚才描述的研究检查了尿液本身或大分子“汤”（超滤后剩余的总尿大分子的未分化制剂）或含有不同数量大分子的尿液组分的影响。尽管他们已经表明，未分化的通用尿大分子制剂以及未鉴定的低分子量尿成分在体外抑制CaOx晶体与肾细胞的结合，但大多数工作都涉及特定的单个大分子的测试。  

5.2细胞粘附的大分子抑制剂

据报道，越来越多的天然存在和合成的大分子可抑制 COM、COD 或羟基磷灰石晶体与培养的肾细胞的附着。这些包括纤连蛋白，36， 81 ，82 OPN，77比康宁， 83 硫酸乙酰肝素/syndecan-1， 43 肝细胞生长因子， 36THG ， 36 硫酸软骨素A和B，12，77硫酸乙酰肝素， 12 ， 77 转化生长因子β-2， 36 和人类肾脏中不存在的各种分子，如肝素，戊聚糖多硫酸盐，聚天冬氨酸和聚谷氨酸。 12 合成分子已经过测试，因为它们至少在理论上可以构成未来预防性治疗的基础。例如，胆固醇拮抗剂Atorvastin已被证明可以抑制尿石症大鼠模型中CaOx晶体的保留。 84 许多蛋白质水平的改变伴随着COM 85 和COD 86 晶体与MDCK细胞的附着。尽管这些发现可能表明天然大分子的合成是对晶体附着的保护性反应，并且可以防止结石形成，但它们也可能只是代表对晶体引起的炎症的反应。其中一些是启动子，而不是抑制剂。  

5.3晶体-细胞粘附的大分子促进子

与其他报道相比， 12 ， 77  CaOx晶体与培养的肾细胞的附着增加已被证明在骨桥蛋白存在下发生， 35 ， 87 并且这种影响通过干扰蛋白质表达的药物减轻。 88 跨膜受体蛋白CD44及其两个配体透明质酸和OPN强烈地被列为肾脏晶体保留的介质。 39 ， 40 ， 42 还有证据表明，与核仁蛋白相关的膜联蛋白II， 74 a 100 kDa蛋白， 89 β-微管蛋白， 90 和I型和IV型胶原 34 介导COM与肾细胞的结合，这一过程似乎也涉及唾液酸残基的存在。91， 92 破坏参与CaOx晶体内化的氯离子通道CLC-5的表达，阻止晶体的内化并使它们留在细胞表面。93， 94 虽然这乍一看似乎可以通过排出的尿液去除来防止结石形成，但它们在上皮表面的存在可能会为进一步的晶体积累和聚集提供中心。因此，内化不一定是一件坏事。事实上，自相矛盾的是，它已被提出构成对尿石症的一种防御形式。  

5.4幸运的逆境：吞噬作用、晶内蛋白和晶体溶解

由于只有当晶体留在肾脏内时才能形成结石，因此假设晶体粘附会促进结石发病机制。然而，一旦附着，晶体不一定会留在细胞表面。报告晶体粘附到细胞 10，11 ， 13 ， 14 ， 95 的相同研究也表明，结合后晶体吞噬到上皮细胞的细胞质中。CaOx晶体也被培养的巨噬细胞吞噬， 96 以及肾巨噬细胞和多核细胞为应对大鼠和人类的急性和慢性草酸病而招募。 97   内化后，晶体溶解在溶酶体包涵体体内9， 12 ， 96，98 ， 99 ，如图 4.4 所示。附着后，晶体通过吞噬作用转移到细胞中，这一过程通过形成吞噬溶酶体而成功，其内部环境是高度酸性的，并含有溶酶体蛋白酶的强效混合物。最终，晶体被降解，矿物质溶解，废物通过顶端或基底外侧膜通过胞吐作用去除。无机晶体可能需要长达 7 周的时间才能溶解在培养的上皮细胞 9 、 12 、 98 、 99 中，而在巨噬细胞中只需 4 天。 96 但是尿液晶体降解和溶解得更快，因为它们充满了蛋白质。 图 4.4  

该图说明了晶体粘附到肾小管壁后肾脏中可能发生的事件。（1）COM晶体附着在肾小管细胞的顶刷边界膜上，然后（2）晶体吞噬到细胞质中;（3）形成含有晶体的吞噬体，以及溶酶体向吞噬体的迁移;（4）吞噬体和溶酶体融合形成吞噬溶酶体;（5）溶酶体蛋白酶破坏晶内蛋白，酸性pH值破坏矿物质。然后，废物将通过顶端或基底外侧膜通过胞吐作用去除。在没有吞噬作用的情况下，附着在上皮上的大量晶体可能通过对数干扰机制引起肾小管闭塞

5.4.1晶内蛋白

所有从尿液中沉淀的CaOx晶体都含有晶内蛋白 ，这些蛋白在生长过程中与晶体表面不可逆地结合，并在被连续的溶质层吞没时成为矿物体积的组成部分。蛋白质掺入CaOx晶体具有高度特异性。例如，尿凝血酶原片段1（PTF1）是COM， 22 ， 102，103 有机基质的主要成分，但它几乎不与COD结合。 22 OPN的情况正好相反，OPN与COD不可逆地结合，但不是 COM.22 人血清白蛋白（HSA）在脱矿质COD晶体提取物中不存在，但在COM内部发现，通过附着在无机晶体的侧面到达那里，但附着在尿晶体的末端。   一旦被捕获，晶内蛋白质通过产生充满有机物质的孔在矿物晶格中形成缺陷。如图 4.4所示 ，这种晶体更容易受到尿液中蛋白酶的攻击，也更容易受到吞噬溶酶体内含的蛋白酶的攻击。溶酶体蛋白酶将消化蛋白质相并打开整个矿物的通道，从而能够进一步挖掘到结构中。这将增加暴露的晶体表面的面积，从而促进晶体矿物在吞噬溶酶体的酸性内部的溶解。 105 因此，晶内蛋白应有助于内化晶体的分解和溶解，从而提供对结石发病机制的自然防御。这一观点得到了定性研究 53 和定量数据的支持，证实尿COM晶体比无机晶体更快地降解和溶解，这两个过程的速率与其中嵌顿的晶内蛋白质的数量成正比。   因此，肾内固定晶体 - 结石形成的先决条件 - 似乎也可以通过提供一种从肾小管腔中去除阻塞晶体然后将它们完全破坏在细胞内的方法来预防疾病。因此，矛盾的是，促进细胞附着在尿路上皮的大分子也可以被视为结石形成的抑制剂。  

5.5总结

从上述讨论中可以明显看出，尿液中天然存在的各种大小分子在体外深刻地影响了肾结石形成过程中发生的所有关键过程。虽然目前无法明确确定其中任何一种是结石发病机制的关键启动剂或抑制剂，但多年来，其中一些已经受到如此严格的审查，因此需要给予具体和详细的关注。  

6低分子量抑制剂

6.1焦磷酸盐

6.1.1焦磷酸盐对结晶的影响

要鉴定和分离的第一个尿液抑制成分是焦磷酸盐。 107 焦磷酸盐存在于结石 108 和无机溶液中，通过不可逆地结合到CaOx晶体表面来抑制CaOx晶体成核、生长 109 、 111 聚集、112以及生长和聚集的组合 113 。在未稀释的尿液中，焦磷酸盐不影响诱导可检测的自发CaOx晶体形成所需的草酸盐量或晶体聚集的程度。 114 然而，它确实减少了从未稀释的尿液中沉积的 CaOx的质量114 ，除非当结晶是由全尿蒸发引起的， 115 在这种情况下它对CaOx或CaP的沉淀没有影响。这种不一致强调了将从无机溶液获得的数据外推到尿液中预期结果的无效性，并且还表明测量值在很大程度上取决于用于获得它们的方法类型。   因此，很难对焦磷酸盐在生理条件下的影响得出任何明确的结论，尽管我们可能会得出结论，除非尿液非常浓缩，否则它可能抑制CaOx在体内的沉积。然而，如果焦磷酸盐是体内CaOx结晶的重要尿抑制剂，则可以合理地预期其在结石形成者中的尿浓度或输出量可能会降低。  

6.1.2尿中焦磷酸盐的排泄

一些作者报告说，与健康对照组相比，结石形成者的焦磷酸盐排泄显着减少， 116-120 ，但其他人则没有。 121-123 因此，即使焦磷酸盐在生理条件下确实抑制了尿液中的CaOx结晶，结石的形成也不能明确归因于其尿量减少。  

6.1.3总结

随着人们越来越重视抑制剂在预防异位钙化中的作用124以及骨代谢与结石形成之间的联系，焦磷酸盐 125 在医学文献中卷土重来。尽管如此，尽管它无疑能够抑制尿液和水溶液中的CaOx结晶，以及CaOx结石碎片在体外的再生， 126 尚未被证明是结石发病机制的主要参与者或有用的治疗剂。  

6.2镁

6.2.1镁对结晶的影响

镁与尿石症的关联始于1932年，当时Cramer表明膳食镁缺乏会导致大鼠肾内钙化和肾小管变性。 虽然镁与草酸盐形成强离子配合物，这无疑解释了它对CaOx晶体成核， 生长， 和聚集 的抑制作用，但它也可能通过结合CaOx晶体表面并掺入晶格而起作用，就像羟基磷灰石一样。 130 无论镁影响的基础是什么，即使所有研究都使用无机溶液作为反应介质，实验结果也不一致。据报道，镁对CaOx成核， 生长， 或复合生长和聚集没有影响。 113 在尿液中，镁抑制生长 并增加诱导可检测的自发CaOx沉淀所需的草酸盐量，但对聚集没有明显影响。  

6.2.2尿中镁的排泄

镁对CaOx结晶的矛盾影响，以及它在结石发病机制中没有显着作用的逻辑结论，可能解释了未能证明结石形成者和健康对照之间离子输出的明确差异。几项研究发现，结石形成者比健康对照组排泄的镁少， 134-136 ，但更多的人无法检测到任何差异。 63 ， 111 ， 137 – 141 在结石患者中反复未能表现出异常低的尿镁浓度促使研究人员发现重要因素是否不是镁本身，而是镁与钙输出的比例。然而，在至少 11 项独立研究 138 中观察到的 Mg/Ca 比率降低与结石频率之间的相关性同样可能是由于结石形成者倾向于提高钙水平。  

6.2.3镁在实验模型中的影响

对实验动物进行镁的饮食管理几乎没有提供澄清。Su等人 142 观察到在正常尿镁浓度下，镁给药对高草酸大鼠的CaOx沉积没有影响，但同一小组后来使用相同的模型得出结论，镁作为MgO是有益的。 143 镁对高草酸尿症大鼠CaOx沉积的影响似乎也取决于其给药形式，即氧化物，氢氧化物，硫酸盐，三硅酸盐或柠檬酸盐，并且奇怪的是，其有益作用似乎是由于柠檬酸盐浓度的增加。 144  

6.2.4总结

尽管镁与钙尿石症有着悠久的历史关联，并且进行了大量调查，但我们仍然对它与该疾病的真正参与并不明智，特别是因为许多人体试验未能最终证明镁给药可减少钙结石复发。 145，146  因此，根据现有证据，镁对结石形成的影响可能相对较小。  

6.3柠檬酸盐

6.3.1柠檬酸盐对结晶的影响

研究表明，柠檬酸盐抑制CaOx晶体成核， 109 在水性介质中生长 和聚集，CaOx在未稀释的 114 和浓缩尿液中的沉积。 147 虽然这种影响至少部分归因于其螯合钙的能力，但柠檬酸盐也与CaOx晶体表面结合。最近的原子力显微镜研究表明，它与COM晶体的大平面特异性结合，148， 149 这也必须有助于抑制COM晶体的生长和聚集。因此，柠檬酸盐既是螯合剂又是晶体毒药。然而，尽管柠檬酸盐在无机培养基中抑制CaOx结晶有充分的证据，但它对尿液中的晶体聚集没有明显的影响， 114 尽管据报道大聚集体形成与体内低柠檬酸盐排泄之间存在临床关联。 150 然而，很明显，柠檬酸盐是尿液中和无机条件下CaOx沉积的有效抑制剂，多年来积累的证据现已确定低枸橼酸尿症是CaOx结石形成的关键因素。  

6.3.2尿中柠檬酸盐的排泄和实验模型的影响

60多年前，有人提出钙结石是肾脏缺陷的产物，导致肾脏无法调节柠檬酸盐输出以补偿尿钙排泄的增加。 151 如果属实，则预计结石形成者会排泄异常低水平的尿柠檬酸盐，并且通过施用柠檬酸盐纠正缺陷应可防止进一步发作。许多作者报告说，结石形成者排泄正常水平的柠檬酸盐，122， 140 ， 152-154 ，但更频繁地报告了结石形成者的低枸橼酸尿症。135， 141 ，155-158 Goldberg等人 159 引用了 11 篇报告结石形成者减少柠檬酸盐排泄的论文。   只要对单次或多次24小时尿液分析的诊断准确性以及正常范围的定义仍然存在争论， 160 关于结石患者和健康对照之间任何尿代谢物的输出或浓度存在明确差异的合理怀疑将始终存在。柠檬酸盐也不例外。然而，尽管并不总是可以证明明显的差异，但从大量受试者那里获得的流行病学数据显示，结石风险与尿柠檬酸盐水平成反比， 160 这表明柠檬酸盐是结石形成的重要天然抑制剂。临床试验结果证实了其预防结石复发的功效（见Hess的第 14章 ），科学研究证明它减少了COM 77 和羟基磷灰石 78 晶体与培养的肾上皮细胞的附着，并且研究表明它可以延缓实验诱导的肾钙质沉着症中的晶体沉积。 161-164  

6.3.3总结

很难说柠檬酸盐在体外和体内都不是CaOx结晶的有效抑制剂，这种简单的三羧酸现在是结石治疗的既定药物也就不足为奇了。尽管如此，至少还有一种天然的低分子量尿液成分也显示出治疗尿石症的治疗前景。  

6.4植酸（肌醇1，2，3，4，5，6-六磷酸盐）

植酸是一种天然糖，存在于大多数种子和谷物中，它在其中充当主要的磷汇。 165 该化合物含有六个磷酸基团，每个基团有两个羟基部分，当电离时，使分子能够螯合二价金属离子，包括Zn2+毫克2+铁2+，以及与本综述最相关的是 Ca2+.植酸盐和金属离子之间形成的复合物往往是不溶的，因此很难从胃肠道吸收， 165 这一特性对钙结石形成者具有巨大的潜在优势，因为它通过将责任转移到肠道来减轻肾脏必须处理过量钙的问题。在认为膳食植酸盐可能在结石发病机制中起重要作用的建议之后， 166 多次尝试在两者之间建立联系。  然而，最近，关于植酸在钙结石形成中可能作用的研究主要由格拉塞斯和他的同事进行。   尿植酸盐排泄与膳食摄入量直接相关 171 ，据报道，结石形成者低于健康对照组。 该化合物的消耗已被充分证明可以减少高钙尿症168和成岩大鼠 的尿钙排泄，特别是当作为钾盐给药时。 173 植酸盐还减少成岩大鼠 的CaOx肾钙质沉着症，以抑制体外冲击波碎石术引起的COM 126 和COD 176 结石颗粒的体外再生，并降低人造结石的生长速度。 6.4.1总结

因此，初步看来，植酸盐似乎是预防结石复发的理想手段，特别是在尿液中排泄过量钙的个体中。但它也有其缺点——可能很严重。任何将其用于预防结石的建议都依赖于其与钙离子紧密结合的能力。然而，它对其他二价离子（如铁和锌）的亲和力同样强。它们也是必需的矿物质，它们以不溶性植酸盐复合物的形式排泄会导致矿物质消耗和缺乏， 177 这一因素导致主要以谷物和豆类为主食的人群发展低植酸盐谷物和豆类菌株。出于同样的原因，只有当钙摄入足够量的钙并避免植酸盐含量高的食物时，才建议CaOx结石形成者进行素食，因为钙排泄量减少太大会增加草酸盐尿量的风险。  

6.5摘要：低分子量抑制剂

上面讨论的低分子量抑制剂易于纯化和给药，并且完整地在尿液中排泄。然而，目前尚不清楚它们是否在防止体内CaOx结晶中起明确作用，并且除柠檬酸盐外，尚未常规用于预防结石。  

7大分子启动子和抑制剂

在关于泌尿抑制剂的章节中包括关于大分子的部分是由两个简单的事实规定的：尿液中存在数千个大分子，所有结石都含有它们。统称为有机基质，大分子仅占肾结石重量的2-3%。有机基质分布在整个结石结构中， 179 主要由 GAG 和蛋白质以及三种类型的脂质组成：磷脂、胆固醇和糖脂。 180 在这里，我们将只考虑GAG和蛋白质，其中大多数直到最近才被具体鉴定，并且尚未检查其对CaOx结晶的影响。  

7.1糖胺聚糖 （GAG）

7.1.1肾结石中的GAGs

GAG是一类主要的尿大分子，通过电泳迁移为三个主要条带可分割成快速和缓慢移动的组分。最丰富的GAG是 硫酸软骨素A和C和硫酸乙酰肝素（HS） ， 以蛋白聚糖的形式排泄。 根据尿液样本的不同，很少或没有硫酸角素  或硫酸皮肤素  通过尿液排泄。透明质酸由健康受试者和结石形成者排泄， 186 但一些作者只检测到少量，如果有的话。GAGs硫酸乙酰肝素187和透明质酸 已被证明存在于CaOx肾结石基质中，但硫酸软骨素是最丰富的尿GAG，仅在磷灰石结石中检测到。  

7.1.2硫酸软骨素 （CS）

从各方面来看，CS似乎是CaOx结晶的活性抑制剂，因为据报道它抑制晶体生长 51 ， 112 ， 189 ，尽管程度不同，取决于它结合的晶面。 190 它还抑制CaOx晶体聚集，112生长和聚集的组合， 113 成核，191，促进192团聚，51， 193 质量沉积， 51 和COM附着在培养的肾细胞上。 12 但CS也促进成核， 51 特别是来自健康受试者的成核， 192 以及晶体生长速度和悬浮密度。 191 CS似乎是CS结晶的有效抑制剂 - 至少在无机条件下。然而，其他更相关的生理数据讲述了一个不同的故事。CS促进大鼠大结石形成， 194 对大鼠肾脏中的CaOx沉积没有影响， 195 并且不影响CaOx质量沉积，聚集或诱导未稀释尿液中自发CaOx沉淀所需的草酸盐量。 20  

7.1.3硫酸乙酰肝素

HS是第二丰富的尿GAG，存在于结石 187 中，是除CS之外唯一被详细研究的天然尿GAG。HS蛋白聚糖是肾小球基底膜的主要组成部分，在其分子组织和功能中起着关键作用。 184 HS被掺入CaOx晶体中，但牺牲了更丰富的CS 196 ，并增强了CaOx晶体成核并抑制冷冻尿液中的生长。 182 ， 197 它不影响尿CaOx介稳极限，也不影响盐在未稀释的超滤尿液中的质量沉积，但抑制晶体聚集 196 和COM附着到培养细胞上。 12 然而，晶体粘附的抑制仅在远高于尿液中发现的浓度时发生。 12 在基因工程培养的细胞中，晶体附着也减少，以合成高水平的HS蛋白聚糖 198 和致岩大鼠中肾脏HS蛋白聚糖mRNA增加。 199 ， 200 HS在晶体和结石中的存在，加上其对晶体聚集和细胞粘附的抑制作用，表明它可能在抑制体内尿液中的CaOx结晶中发挥作用;但目前，该 GAG 的定义功能仍有待明确证明。  

7.1.4透明质酸

透明质酸存在于CaOx结石中， 187，188 ，虽然它少量存在于尿液中，但它是肾髓质中细胞外基质的主要成分。 201 与CS和HS， 202 一样，培养的肾小管细胞产生的HA在细胞增殖期间和物理损伤后被激活，显然是细胞修复机制的一部分。 39 暴露的HA分子的结构和大尺寸使其能够形成水合凝胶状基质或“涂层”，其从迁移和增殖的MDCK细胞 40 的表面延伸几微米，并结合其电负性，使其能够结合COM晶体。 42 有人提出，这种HA介导的晶体结合促进了它们在肾小管内的卡压，以及在肾间质中形成兰德尔斑块， 201 尽管这两个过程尚未明确证明导致结石形成。  

7.1.5肝素

肝素不存在于人尿中。尽管如此，它也在大多数研究中进行了测试，这些研究检查了CS可能作为一种可能的治疗剂的特性，但可能是因为它是免费提供的并且很容易包含！肝素抑制CaOx晶体生长，112晶体聚集，112两种过程结合， 113 成核，191，192生长和团聚， 51 团聚， 193 和质量沉积。 191，193  

7.1.6合成GAG

几种合成GAG（戊聚糖多硫酸钠[SPP]，G871，G872）已被测试为预防结石的潜在治疗方法。尽管一项研究报告G871和872抑制CaOx晶体在无机介质中的生长和团聚，但大多数注意力都集中在SPP上。 203 在相同条件下，SPP抑制生长 195 ， 203-207 和团聚203， 206 ，尽管据报道它也促进了聚集。 204 研究合成GAGs的理由可以在报告中找到，与CS不同，SPP的抑制效力保留在尿液和体内。它延缓未稀释尿液 207 中的CaOx晶体生长和成岩大鼠中的CaOx晶体沉积。 195 ， 207，208  然而，这些发现必须保持学术性，直到随机安慰剂对照研究的表现毫无疑问地证明SPP的临床有用性。 209  

7.1.7尿排泄GAGs。

文献中充斥着许多论文，试图证明尿浓度或GAG的输出量可以用作结石病的标志物。几篇论文表明，未分化的结石形成者， 122 ，210-212复发性结石形成者，213和I型高钙尿症214的结石形成者排泄异常低水平的GAGs，但他们被报告所淹没，即结石形成者的GAG排泄与健康对照组（包括儿童）的排泄无法区分 213-219 。据报道， 220，221 名儿童排泄的GAGs量高于成人 211 ，特别是CS， 185 尽管他们的HS产量低于父母。 185 Harangi等人 220 表明，患有肾高钙尿症的小儿结石形成者排泄的硫酸角质明显少于对照组或吸收性高钙尿症患者。然而，他们确实排泄了更多的硫酸皮肤素，使得所有组的总GAG排泄量相等。  

7.1.8概括：尿 GAG 对结石形成重要吗？

在过去的 40 年中，人们花费了大量精力来发现尿 GAG 是否在结石发病机制中起保护作用。当然，有充分的证据表明CS可以抑制CaOx结晶，肝素和几种合成GAG也是如此，但仅限于无机溶液。此外，很明显，无论是在儿童还是成人中，低GAG排泄量都不是尿石症的一致标志。那么，为什么当对过去文献的批判性评估得出的结论是，作为一个群体，它们不是时，为什么仍然存在尿GAG不仅是CaOx结晶的抑制剂，而且是结石发病机制的抑制剂。因此，当与蛋白质一样，当GAG的尿浓度会随着导致或由结石形成而导致的任何细胞炎症或损伤而改变时，为什么要费心测量GAG的尿液排泄？也许现有数据可能证明在结石形成者调查中测量 HS 排泄是合理的，但目前尚无科学依据常规确定 CS 或总GAG 排泄量是结石病的标志物，应停止这种做法。  

8蛋白质

下一节仅详细介绍了已通过免疫或氨基酸序列分析或其他蛋白质组学技术明确鉴定的蛋白质。因此，尽管肾钙素在过去的文献中占有突出地位， 222 但没有包括关于肾钙素的信息，因为它从未被证实是一种实质性蛋白质，并且因为它与THG和白蛋白， 223 和α间胰蛋白酶抑制剂的关系存在混淆。 224  

8.1肾结石中的蛋白质

到2004年，使用凝胶电泳、蛋白质印迹或氨基酸测序分析等技术，在肾结石基质中明确检测到了大约30种蛋白质（图 4.5 ）。 图 4.5  

2008年已知存在于人类肾结石中的蛋白质。 在CaOx结石中检测到黄色突出显示的那些直到2007年（包括2007年）   然而，在过去的十年中，越来越多地使用更复杂的蛋白质组学工具来分析尿液。虽然这主要是为了发现各种疾病的蛋白质标志物， 但229 蛋白质组学工具已被越来越多地用于识别肾结石中存在的蛋白质。 85 这些技术包括高压液相色谱和串联质谱（HPLC-MS），表面增强激光解吸电离-飞行时间（SELDI-TOF）和基质辅助激光解吸电离-飞行时间（MALDI-TOF）。由于这些技术与已发表的蛋白质数据库的快速自动计算机搜索相结合，可以快速分离和分析极低浓度的大量肽，因此在过去几年中，在结石中鉴定出的蛋白质数量呈双曲线增长。2007年，Mushtaq等人 228 将髓过氧化物酶和α-防御素添加到结石基质的已知成分列表中，而Canales等人 225 鉴定了68种不同的蛋白质，其中50多种以前从未被观察到过。Chen等人 230在10 块CaOx结石的基质中检测到11种低分子量蛋白。然而，所有这些研究都被最近的一份报告 227 所掩盖，该报告显示结石基质中存在令人难以置信的158种蛋白质，其中包括28种被归类为常见的蛋白质。   由于许多检测到的肽是前体分子或同一母体蛋白的不同链或片段，因此很难确切地说出结石基质中现在已知存在多少蛋白质以及哪些单个蛋白质。尽管如此，现在很清楚，钙肾结石的有机基质中可以出现200多种蛋白质（图 4.5 ）。但他们都是石头开发的活跃主角吗？几乎不。虽然常识允许我们接受OPN，钙粒蛋白和凝血酶原片段1的特性似乎使它们能够在CaOx结晶和结石形成中发挥积极作用，但它可能正在挑战轻信的极限，表明假设的蛋白质FLJ11036，FLJ13089，FLJ35382或XP373506，或形态发生1的凌乱相关激活剂，很可能对疾病的发展承担很大的责任！事实上，图 4.5 中列出的几乎所有蛋白质很可能与决定结石形成的方向完全无关。当然，其中少数几个在石头中的存在可能是由于它们通过充当异质种子或通过隔离钙和草酸盐离子来产生高浓度的局部CaOx来诱导CaOx成核。然而，它们可以通过不完全抑制结晶或作为肾小管内损伤释放的炎症分子而轻易到达结石中，如图 4.1和4.2 所示，以及Merchant等人的发现所表明的 227        现代基因组技术进一步复杂化了我们新发现的轻松识别蛋白质的能力所产生的混乱。正如将在以下各节中看到的，用于评估蛋白质是结石形成重要参与者的可能性的一个标准是测量其在肾钙化动物模型或培养细胞中的基因表达变化。但同样，我们被信息淹没了。仅在一项研究中，就发现 231 个至少173个基因在大鼠实验性肾钙质沉着症的一个或多个时间点受到至少两倍的调节！   因此，大分子存在于结石中，或者其mRNA或cDNA在成岩条件下升高这一简单事实，并不能让我们得出关于其解剖学起源、它如何进入结石或是否在结石形成中发挥特定作用的明确结论，因为它很可能是一种产物。的石头，而不是原因。许多结石大分子是血液的成分，通常不会在尿液中发现。通过研究尿液中新鲜沉淀的CaOx晶体的有机基质，这个问题在很大程度上得到了克服。 232，233  这种晶体不含继发于细胞损伤的大分子，因此可以研究尿液中通常发现的参与结石形成关键结晶阶段的大分子。这种方法，结合更好的技术和特定抗体的商业可用性，使得对几种大分子的研究足够详细，至少使我们能够推测它们是否可能是过程中的真正功能，或者只是偶然的内含物，我们现在将转向这些。  

8.2塔姆-霍斯福尔糖蛋白 （THG）

毫无疑问，THG是与尿石症相关的研究最深入的蛋白质。在至少两次综合评论中描述， 早期工作将不在此详细介绍。   尽管THG在尿液和肾管型中占主导地位，但其确切功能仍然未知。它在结石基质 227 中的丰度可能反映了它在尿液中的排泄量高于任何其他蛋白质，但似乎与它完全不存在从整个人尿液中沉淀的CaOx晶体不一致。 100，101 ， 233 报告THG被掺入CaOx尿晶体中，236-239 它在CaP晶体中的含量比COM更丰富， 236 并且它与COM晶体结合并阻止它们附着在培养的肾细胞上 72 ， 74 无疑源于这些研究未能在EDTA脱矿和蛋白质分析之前完全洗去浅表的，松散结合的THG。 101 THG未掺入CaOx晶体的事实表明它不会不可逆地结合到它们的表面。这一观察结果与以下观察结果一致：它不会改变CaOx晶体的习性或衍射模式，也不会在体外240或体内 241 中成核，并且在小鼠胚胎干细胞中的THP基因失活后，钙晶体在成人肾脏中自发形成。 242  

8.2.1THG对结晶的影响

根据环境条件和方法，THG对CaOx结晶表现出一系列令人沮丧的影响，这可能反映了其自我结合成分子量为数百万的聚合物庞然大物的能力。尽管有许多报道表明THG对合成无机介质中的CaOx沉积没有影响， 243 据报道它可以抑制CaOx的沉积。 189 ， 244 然而，在尿液中，它促进CaOx 32 ， 52 和CaP 245 沉淀。尽管如此，它是未稀释的超滤尿液中CaOx晶体聚集的有效抑制剂，30， 246 可能是由空间位阻引起的， 20 因为它不与晶体表面结合。  

8.2.2THG对晶体-细胞相互作用的影响

THG对CaOx结晶的不一致影响也延伸到CaOx晶体与肾细胞的结合。THG的唾液酸含量对于保护尿路免受疾病侵害至关重要， 247 细胞表面蛋白的唾液酸残基被认为在晶体附着到肾上皮细胞中起着决定性的作用。34， 91 据报道，该蛋白对 77 没有影响，并抑制 36 晶体粘附到培养的肾细胞上，并且还可以防止MDCK细胞中草酸盐诱导的根基损伤，这至少部分归因于其糖基化程度和粘附在细胞膜上的能力。 248  

8.2.3THG的结构特点

检查THG分子结构和排泄的研究也产生了令人困惑的发现。有人认为，结石形成者可以合成和排泄具有不同物理化学特征的THG（见 234，235 ），其中之一是改变的电泳迁移模式。 249 一项研究报告说，来自结石患者的THG缺乏唾液酸， 250 其结果是促进晶体聚集。 251 然而，最近发现来自结石成型者的 252 THG 比健康受试者含有更多的唾液酸，并且抑制结晶的效力较低。因此，如果 THG 与结石形成者和对照组之间存在差异，它们肯定不一致，这可能解释了至少两组研究人员未能发现任何差异的原因。 253，254  

8.2.4THG在动物和细胞模型中的表达

有一篇报道说，培养的肾上皮细胞中THG的表达不受CaOx晶体的影响，并且在成岩大鼠中没有诱导CaOx晶体形成， 241 而另一篇论文表明其基因表达，尿排泄，生化性质和功能在岩石大鼠中不受影响。 255 然而，其他研究表明，乙二醇处理的大鼠的肾脏THG mRNA和蛋白质表达减少，256并且蛋白质的正常肾脏分布被改变， 257 现在以围绕单个晶体及其聚集体的细纤维网的形式出现。 258 THG在成岩大鼠中的强烈表达不是由晶体诱导的，而是由肾小管扩张引起的肾小管损伤引起的，导致推测THG可能通过充当晶体粘合剂来促进结石形成， 241 这似乎与其无法与CaOx晶体不可逆地结合不一致。 100，101 ， 233  

8.2.5尿排泄四氢钾

结石形成者和健康受试者对THG的排泄通常没有差异， 219 ， 259-261 ，与最近的研究报告钙262-264和纯尿酸 265 结石形成者中的THG显着低于健康对照组。用柠檬酸钾治疗后，钙结石形成者的尿液THG水平升高， 266 以及健康受试者也因钙和草酸盐水平升高而升高，这是结石形成者缺乏的“自我保护”机制。 262  

8.2.6总结

THG在人类结石形成中的真正作用仍然是一个谜，主要是因为它在不同的环境和不同的实验模型中表现出相互矛盾的效果。然而，即使它确实在尿石症中发挥了一些功能，它无疑也不是唯一可能涉及的蛋白质。随着蛋白质组学技术的出现以及认识到其他尿蛋白也具有使它们在尿石症中发挥作用的特性，近年来对THG的兴趣趋于减弱，并且THG与尿石症之间任何关联的真正基础可能永远无法完全阐明。  

8.3骨桥蛋白

骨桥蛋白（OPN）是一种富含天冬氨酸残基的糖磷酸蛋白，是肾结石基质的丰富 227 成分，存在于兰德尔斑块的颗粒中 ， 该分泌在远端肾单位的管腔上皮和Henlé的厚升环 中，其中尿液最集中，成核的可能性最高。 虽然OPN传统上主要与骨矿化有关， 但现在它被认为是由各种细胞类型制造和分泌的多功能分子，并发挥多种作用，从细胞粘附，趋化性，细胞信号传导，防止细胞凋亡和侵袭，到肿瘤细胞的迁移和锚定非依赖性生长。 鉴于其无处不在和广泛的生理作用，它成为许多广泛审查的主题也就不足为奇了。 它也是与结石形成有关的任何蛋白质中研究最广泛的。  

8.3.1OPN对结晶的影响

OPN在无机条件下有效抑制CaOx晶体生长 和成核和聚集 ：其在尿液中的作用尚未报道。该蛋白质诱导COD 33 优先成核和延缓CaOx沉积的能力源于步进销 148 ，这是通过与生长的晶体表面的特定相互作用实现的。尽管据报道OPN优先附着在无机COM晶体的顶部和顶面之间的边缘 282 以及侧面 148 上，但它并没有在很大程度上掺入从无机溶液[我们自己未发表的观察结果]或人尿中沉淀的COM晶体的矿物块中。 22 然而，OPN与晶体表面的结合确实会导致它们在某些条件下聚集。 283 在原子力显微镜研究 190 以及其在胶原颗粒表面的存在促进了无机溶液中COM的沉积和聚集的实验中也观察到了OPN增加与其结合的晶体粘附性的能力。 284 因此，OPN似乎具有增加表面粘附性的能力，这一特性也延伸到培养细胞的特性。  

8.3.2OPN对晶体-细胞相互作用的影响

尽管有报道称OPN对尿酸晶体与培养的肾细胞 285 的附着没有影响，并减少了CaOx 77和CaP 98 晶体的附着，但它实际上增加晶体粘附的证据更令人信服， 72 ， 87 ， 286 特别是因为OPN反义寡核苷酸在MDCK  88 和NRK-52E细胞中减轻了这种影响。 35 事实上，如前所述，OPN已被强烈地牵连为肾脏中晶体保留的重要介质， 39 ， 40，42 这一特性取决于其磷酸化程度 24 和自身的分子结构，而后者又受到其结合表面特征的影响。 287 总的来说，普遍的观点是OPN，其在培养的猴肾细胞中的表达受到COM晶体的刺激， 12 是体内晶体附着在细胞上的主要介质。因此，尽管它鼓励晶体的保留，但矛盾的是，它可以通过促进吞噬作用和细胞内破坏来去除晶体，从而作为一种防御机制。  

8.3.3OPN在动物和细胞模型中的表达

在用各种成岩剂处理的动物中也观察到细胞培养模型中观察到的响应CaOx晶体激发的OPN增加。在大鼠中，OPN分泌在肾脏中结石矿物沉淀可能性最大的两个部位。 288 OPN mRNA和蛋白质本身的表达在诱导肾CaOx晶体沉积后显着增加。289-296 然而，雌二醇，孕酮和/或睾酮，295，298-300维生素K， 298 别嘌呤醇，301和绿茶 302 抑制了这种增加！在小鼠中也报告了类似的增加， 303，304 只，包括遗传性高钙尿症小鼠。 289 然而，通过注射乙醛酸诱发CaOx晶体形成的OPN敲除小鼠比野生型小鼠保留的晶体更少，这完全符合蛋白质在培养的上皮细胞中促进晶体结合的能力。 305  

8.3.4尿排泄OPN

尿OPN水平难以测量。即使是健康对照组 21 ， 23 ， 281 ， 306-309 的正常范围也有很大差异，平均值从低至0.76mg / L 21 到高达10mg /  L.308 尽管存在如此巨大的差异，但大多数作者报告说，患者组中OPN的尿量显着降低。 309-312  然而，Bautista et al.23 沒有觀察到差異，Hedgepeth et  al.313 也沒有觀察到半定量方法的差異。在观察到OPN输出减少的情况下，它被解释为结石形成的原因，尽管在一种情况下，作者推测这可能是由于蛋白质掺入结石中造成的。 309 情况很可能是这样。   如上所述，OPN与COM和COD晶体结合，并被监禁在后者中。因此，尿液中的任何晶体都会有效地从溶液中去除蛋白质，并导致其浓度被显着低估，正如最近所证明的那样。 314 测量值也随环境钙浓度而变化，可能是由于分子的Ca依赖性构象的改变。 314 当然，这些问题并不局限于OPN：任何与结石矿物不可逆结合或其分子构型受Ca影响的分子的测量都将不可避免地受到尿液中任何晶体的影响，无论它们是在体内自发形成的还是后来在体外储存期间形成的。显然，体内尿液中钙浓度和CaOx晶体的形成无法控制：因此，在高钙尿症和结晶尿症特别普遍的复发性结石形成者中，严重错误的可能性最大。因此，比较结石形成者和健康受试者中任何结合CaOx或其他结石晶体的大分子的尿排泄的报告，或提倡测量尿蛋白作为尿石症标志物的报告，必须谨慎对待，特别是在尚未确认无血尿的情况下。  

8.3.5总结

有充分的证据表明，OPN可以在结石形成中发挥重要作用。尽管如此，目前可以说OPN在结石发病机制中的作用的明确证明取决于进一步信息的产生。  

8.4凝血酶原片段 1 （PTF1）

凝血蛋白可能与结石病有关的第一个线索是在30多年前发现的，当时在钙结石中首次检测到富含γ-羧谷氨酸（Gla）的蛋白质。 315 然而，直到1991年，尿液PTF1（最初称为晶体基质蛋白）才被发现是从全人尿液中新鲜沉淀的CaOx晶体的可溶性有机基质凝胶中的主条带。 233 晶体基质蛋白随后被证明与凝血酶原 103 ， 316 有关，后来被证实是其F1活化片段。 102 ， 316   尿PTF1是一种糖蛋白，分子量约为31kDa，其色谱性质与其在血清中的表亲不同。 102 该蛋白存在于钙中，但不存在于鸟粪石结石中，这表明其发生不是结石本身引起的肾内出血的结果， 317 并且局限于 Henlé 袢的厚升支和远端回旋小管，其在结石形成者中的表达大于对照组。 318 与长期以来认为凝血酶原仅在肝脏中合成的观点相反，很明显它也在肾脏中制造，因为编码该蛋白的mRNA已在人肾 319 ，320和大鼠 320-322 肾脏中检测到。  

8.4.1PTF1对结晶的影响

PTF1 是一种非常强的 CaOx 晶体生长和聚集抑制剂，可在无机溶液 280 ， 323 和未稀释的超滤人尿中生长和聚集。 324 该蛋白在两种培养基中的效力可归因于其Gla（γ-羧谷氨酸）结构域。 323，325  该结构域位于PTF1及其母体凝血酶原的N末端，含有10个Gla残基，其完全γ羧化对于血液的有效凝固以及PTF1与CaOx晶体的结合是必不可少的。华法林通过抑制凝血酶原的γ羧化来减少血液凝固，从而抑制PTF1片段的羧化。已经表明，华法林治疗产生的Gla缺陷形式的蛋白质不会掺入CaOx晶体中， 326 而Gla残基数量的化学减少也降低了蛋白质对无机介质中CaOx结晶的抑制作用。 327 据报道，结石形成者PTF1的Gla含量低于健康受试者，其抑制活性也低于健康受试者。 PTF1的结合特性和抑制效力似乎除了其Gla结构域外，还取决于分子O-糖基团的唾液酸化程度，329 而其碳水化合物部分会影响其对晶体成核和聚集的影响，但不影响生长。330 然而，同样明显的是，PTF1在尿液中的抑制效力与尿液本身的组成有关，因为从黑人和白人受试者的尿液中分离的PTF1的活性在从每组获得的尿液中进行测试时不同，331 尽管它们之间没有任何结构差异。332 这一观察结果与模型研究一致，该研究表明抑制活性是由各种蛋白质分子和COM晶体表面之间可能接触点的数量以外的因素决定的。104 ，333   PTF1以高度选择性的方式与CaOx结合。它在无机介质 104 和尿液中贪婪地附着在COM晶体上， 22 但不情愿地与COD结合，并且仅在低钙浓度下。 22 蛋白质特异性地结合到COM晶体的末端顶端面，这种偏好不能简单地用蛋白质的Gla残基与COM晶体表面上的Ca或草酸盐阵列之间的相互作用来解释。 104 在与顶端面结合时，PTF1成功地与HSA（HSA也更喜欢附着在这些面上）竞争，迫使它结合到晶体的侧面。 104  

8.4.2PTF1对晶体-细胞相互作用的影响

尽管PTF1的浓度在研究中没有直接定量，但据报道，该蛋白的COM晶体包被与晶体与培养的肾上皮细胞的结合减少有关。 72 尽管如此，我们实验室未发表的数据显示，附着在COM晶体表面的PTF1有效地抑制了它们与MDCK细胞的结合，并且晶内PTF1促进了它们的降解和溶解 - 两者都以剂量依赖性的方式。因此，PTF1可能有助于减少晶体附着的可能性，从而减少从结晶尿到结石形成的进展。此外，如果确实发生附着和内化，它还可以通过促进细胞内晶体溶解来帮助防止结石的发展。  

8.4.3PTF1在动物和细胞模型中的表达

PTF1的表达已被证明在用草酸盐 334 攻击的MDCK细胞中增加，两项研究已经检查了尿石症动物模型中凝血酶原的基因表达。一项报告了通过施用乙二醇而呈高草酸尿症的大鼠肾脏中蛋白质的mRNA显着增加， 320 但另一项报告的情况恰恰相反。 335 这种差异可能归因于标准化mRNA提取的方法学差异。  

8.4.4尿中PTF1的排泄

尽管已经进行了至少两次尝试来量化尿液中PTF1的排泄，但结果几乎肯定是不可靠的。如上所述，尿液中存在排尿前或排尿后形成的CaOx晶体将不可避免地导致低估与它们不可逆结合的任何蛋白质。已经证明PTF1在晶体存在下测量浓度的降低， 336 无疑是其对COM晶体表面非凡亲和力的结果。除了一项半定量研究无法证明结石形成者和对照组尿液中的PTF1含量之间存在任何差异 313 外，只有另一份关于尿液PTF1浓度测量的报告。 308 尽管该研究观察到结石形成者尿液中的浓度降低，但它没有考虑到在排尿之前或之后尿液样本中可能存在CaOx晶体的可能性。  

8.4.5总结

充分的证据表明，PTF1可能在结石形成中起重要的调节作用。然而，与所有其他被假定具有相似功能的蛋白质一样，目前没有明确的证据表明它是结石发病机制的专性参与者。  

8.5α间抑制剂 （IαI）

自从Sørensen和他的同事从尿液中分离出一种与α间胰蛋白酶抑制剂相关的糖蛋白以来，现在已经快20年了，现在通常称为α间抑制剂（IαI），它抑制了CaOx在无机介质中的生长。 337 IαI是一种复杂的Kunitz型蛋白酶抑制剂，由四条重链组成 - H1，H2，H3和H4。这些与包含比孔蛋白和硫酸软骨素的蛋白聚糖复合物有关，硫酸软骨素是尿液中主要的蛋白酶抑制剂。 338 重链 3 存在于由兰德尔斑块组成的小球中，存在于收集管、Henlé 的细环和结石形成者肾脏的间质基质中，而 bikunin 仅存在于收集管顶膜和环状细胞质中。 339 IαI肽链家族由至少五个不同的基因编码。 338 虽然重链通过转移到透明质酸与完整IαI的生理功能直接相关，但 338 迄今为止最受关注的是分子的比库宁部分。Bikunin似乎具有不同的生理功能，作为蛋白酶抑制剂，生长因子，细胞内钙水平的调节剂，细胞外基质的一种成分，并且与本综述最相关，钙尿石症的潜在调节剂。 Atmani和他的同事扩展了Sørensen等人的初始工作337 ，研究一种密切相关的35 kDa尿蛋白，该尿蛋白抑制CaOx晶体生长，他们最初称之为富含糖醛酸的蛋白质，341 他们后来证明它与IαI具有同源性。342 富含糖醛酸的蛋白质最终被鉴定为比孔宁。343 H1和H2344 以及比孔宁227 均在钙结石的有机基质以及尿液沉淀的CaOx晶体中得到阳性鉴定。    

8.5.1IαI对结晶的影响

尽管抑制研究表明，比库宁是无机介质中CaOx结晶的抑制剂， ，但它在预期的生理浓度下几乎没有影响。 349 它对未稀释的人尿的影响从未有报道过。然而，一致认为，IαI本身及其重链都没有显着降低CaOx结晶，即使在无机介质中也是如此 ;活性似乎局限于IαI的比孔宁片段，在那里它定位于分子的羧基末端结构域。 据报道，来自结石形成者尿液的蛋白质是比从健康受试者中分离的蛋白质更有效的CaOx结晶抑制剂。   8.5.2 IαI对晶体-细胞相互作用的影响   在唯一一项检查比孔蛋白对晶体细胞附着影响的研究中，据报道该蛋白抑制COM对MDCK细胞的粘附。  

8.5.3IαI在动物和细胞模型中的表达

Bikunin存在于大鼠尿液353中，并在正常大鼠肾脏中表达，主要在近端小管和Henlé环附近的薄下降段 352 中表达，尽管该蛋白在成岩条件下重新分布到皮髓质连接处。 354 在实验性CaOx肾结石 355-357 以及暴露于草酸盐的MDCK细胞中，比孔蛋白mRNA在大鼠肾脏和尿液中的表达水平升高。 358 然而，在受到CaOx晶体攻击的MDCK细胞中，基因表达不会增加。 358  

8.5.4尿排泄IαI

尽管据报道，完整的IαI三聚体分子以及其中两条重链的二聚体比健康男性更频繁地检测到结石形成者， 313 ， 359 这可能仅代表对泌尿道中结石或晶体存在的非特异性炎症反应，而不是蛋白质的合成作为防御成石条件的特定形式。无论如何，研究结果并不一致，因为其他研究表明，结石形成者尿液中的比昆宁水平相对于对照组降低。351，360 当然，如上所述，尿液中比孔宁水平降低的报告可能只是反映了蛋白质与尿晶体的结合，因为在这两项研究中， 361 ， 359 项都没有考虑到可能存在尿晶体。  

8.5.5总结

与上面讨论的其他蛋白质一样，越来越多的证据表明IαI与钙结石形成之间存在关联。然而，这种关联的性质仍然不确定，目前还不能保证这种蛋白质是由草酸盐、晶体或结石诱导的炎症的产物，或者它是否在这个过程中起着指导作用。  

8.6钙粒蛋白（钙卫蛋白）

钙粒蛋白（24kDa）是两种钙结合蛋白的异二聚体，包括轻链和重链，存在于中性粒细胞的细胞质中并在单核细胞膜上表达。 361 它与炎症性疾病的参与鼓励了其作为几种疾病的泌尿标志物的测量，包括类风湿性关节炎、肺部疾病和肠癌。 361 该蛋白质存在于鸟粪石 362 和CaOx结石 228，230 ， 269，363 的有机基质中，并由MDCK细胞在接种到裸鼠中时形成的CaP沉积物附近表达。 364 人类尿蛋白已被证明在纳摩尔浓度 365 下抑制CaOx晶体的生长和聚集，并被认为是尿石症的几种标记蛋白之一， 366 尽管其有用性再次受到始终存在的结晶问题的影响。尽管钙粒蛋白的特性和在结石基质中的存在强烈表明它参与了结石的形成，但它是石材界的相对较新者，迄今为止收集的信息很少：在确定它是否在尿石症中发挥指导作用之前，需要收集更多信息。  

8.7人血清白蛋白 （HSA）

在THG之后，HSA是尿液中最丰富的蛋白质。人们早就知道它存在于结石基质 367 中，并且在它与其他尿蛋白结合的所有五种肾结石中检测到它导致推测它在结石基质的形成中发挥特定作用。 368 HSA被掺入无机COM晶体中，特异性地结合到它们的端顶端面，但由于来自更强结合的PTF1的竞争，它附着在从尿液中沉淀的COM晶体的侧面。 104 因此，结石基质中的大多数HSA可能是由于结石本身造成的损伤及其生理普遍性造成的非特异性内含物造成的。HSA对COM矿物的亲和力很小，因为它包含在COM晶体中的含量比其在尿液中的高浓度232， 233 所预期的要少得多，并且在COD晶体基质中无法检测到[我们自己未发表的观察]，尽管它在溶液 中的 存在往往有利于COD的形成。 369       HSA对无机溶液 或未稀释的超滤人尿液中的CaOx晶体生长影响很小。 20 然而，它在晶种亚稳溶液中强烈阻滞晶体聚集， ，但在尿液中仅对较弱。来自黑人受试者的 20 ， 27 HSA比来自白人的HSA更有效地抑制聚集，这归因于每个来源的蛋白质之间的结构差异。 27 有几篇论文表明，HSA促进了无机溶液中的CaOx晶体成核，特别是当它被吸附到固体载体上时， 一份报告表明，来自正常对照的HSA比来自结石形成者的成核剂更强。 369 石形成者 261 尿液中HSA浓度升高可能是结石引起的肾出血的症状，而不是表明蛋白质在结石形成中的关键作用，特别是因为它伴随着转铁蛋白（另一种血液蛋白质）的尿排泄增加。  

8.7.1总结

HSA在钙结石形成中起特定作用的证据并不令人信服，它在结石中的不变性发生可能更可能反映其在尿液，血液和组织中的丰富性，而不是与晶体或其他蛋白质的特定相互作用的结果。  

8.8纤连蛋白

纤连蛋白（FN）是石头传奇中相对较新的参与者。FN在血浆中以高浓度存在，是一种多功能蛋白质，可介导与细胞外基质的各种细胞相互作用，是细胞粘附，迁移，生长和分化的重要主角。 375 尽管FN吸附到CaOx晶体上， 376 其抑制COM晶体与培养的肾上皮细胞结合的能力81以及随后的内化 36 ， 81 取决于与细胞的相互作用，而不是晶体的涂层。FN的这些作用似乎与所用细胞的类型有关，因为它促进晶体与人肾癌细胞系CAKI-1的结合。 34   FN还抑制暴露于草酸盐和COM晶体诱导的MDCK细胞损伤， 377 并且细胞的FN含量与与其结合的晶体量成比例上升。 376 在成岩大鼠模型中，发现蛋白质在附着晶体的小管上表达。 375 虽然它抑制了无机晶种结晶体系中的CaOx晶体聚集， 376 但它对晶体生长只有轻微的影响。 284 ， 376 报告在有沉默结石的复发性结石形成者中尿 FN 浓度升高，而在无沉默结石中，尿 FN 浓度降低 378 更可能反映前一组存在血尿，而不是蛋白质的肾脏分泌增加。  

9结论

积累的大量知识告诉我们很多关于低分子量和高分子量物质成分的信息，这些成分已被视为促进剂或抑制剂。但是什么的抑制剂或促进者？草酸钙在无机溶液中结晶？在尿液中？晶体与肾上皮细胞的粘附？结石本身？当然，这里报告的研究的目的是阐明抑制剂和启动子在结石形成中的功能，但目前，除了柠檬酸盐之外，没有明确的证据表明任何单一分子直接有助于预防或推进结石。我们不应该期望有。   很多因素会影响微溶性晶体在尿路中沉淀并引发结石发病机制的可能性——从遗传学到饮食，从水质到气候，从地理到尿液和细胞组成。即使我们挑出一组因素——所谓的抑制剂或启动子——我们发现它们的影响是多方面的和矛盾的。图 4.6 显示了尿分子影响导致结石形成的事件的各种方式，包括细胞外炖尿和肾脏内的细胞内。

图 4.6

尿大分子在结石形成中可能的细胞外和细胞内效应 根据已发表的文献，根据所使用的实验系统，他们似乎几乎可以做任何事情。例如，没有晶体的成核，石头就无法形成。但增强的成核实际上可能是保护性的，因为更高的成核率会产生较小的晶体，不太可能被困在肾小管中。晶体附着在肾上皮上是结石形成所必需的，但它们的附着并不一定导致结石，因为细胞可以吞噬和摧毁它们。因此，启动子可以抑制，抑制剂可以促进。   

适合预防结石的天然低分子量物质是有限的，尽管导致某些植物提取物明显成功的化学制剂尚未得到充分研究。蛋白质很可能产生有关分子基序的信息，这些信息可以合成并用于结石的处理。那么我们应该研究哪些呢？最有可能的候选药物是骨桥蛋白、凝血酶原片段 1、钙粒蛋白、透明质酸、膜联蛋白、纤连蛋白、基质 Gla 蛋白、胎儿和骨钙素。为什么？因为大自然是经济的。参与CaOx晶体形成和保留的大分子 - 特别是蛋白质 - 几乎肯定与人类和其他生物中已知的结合钙的大分子相同，其盐类贪婪地调节健康的钙依赖性生理功能，控制健康骨骼，牙本质和软骨的沉积和组装，并防止其他异位钙化。  

Cite this chapter

Ryall, R.L. (2010). The Possible Roles of Inhibitors, Promoters, and Macromolecules in the Formation of Calcium Kidney Stones. In: Rao, N., Preminger, G., Kavanagh, J. (eds) Urinary Tract Stone Disease. Springer, London. https://doi.org/10.1007/978-1-84800-362-0_4