肾结石的遗传学和分子生物学

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Gambaro, G., Soldati, L., Vezzoli, G. (2010). Genetics and Molecular Biology of Renal Stones. In: Rao, N., Preminger, G., Kavanagh, J. (eds) Urinary Tract Stone Disease. Springer, London. https://doi.org/10.1007/978-1-84800-362-0_2

肾结石的遗传学和分子生物学

迄今为止，钙肾结石的遗传学研究通过检测基因座与结石病之间的联系不平衡或关联来评估单个候选基因。他们已经确定了钙敏感受体（CaSR），维生素D受体（VDR）和碳酸氢盐敏感的腺苷酸环化酶基因的潜在参与。除了对人类的研究外，对不同基因敲除小鼠品系的研究使我们能够将磷酸盐重吸收载体NPT2基因，caveolin-1基因，调节钙和尿酸盐重吸收的蛋白质NHERF-1基因，骨桥蛋白和Tamm-Horsfall蛋白包括在可能的决定因素中。然而，基因之间以及环境因素与基因之间的相互作用通常被认为是钙结石形成的基础。因此，迄今为止，遗传学研究未能显着提高我们对钙肾结石原因的理解，尽管它们使我们能够评估问题的严重程度并建立应对它的标准。我们对导致钙结石的原因的进一步了解可能源于使用现代生物技术和生物信息学为研究人员提供的工具。

1介绍

对患者的代谢研究证实，钙肾结石可能与单价和双价电解质排泄的各种缺陷有关。这些疾病中最著名的是原发性高钙尿症，见于 50% 的结石患者。1其他疾病（例如低枸橼尿症、肾性低磷血症、高尿尿症以及钠和氯化物排泄升高）较少伴随结石形成性疾病。因此，仅凭这些条件的强度就不可能预测钙结石的发作，这导致我们假设许多因素相互作用和/或结合在一起，使个体易患钙肾结石。

在过去的十年中，肾脏病学研究的重点是确定钙肾结石的遗传原因。然而，我们对这一主题的理解没有实质性的提高，因此无法制定有效的预防和治疗标准。在诱发因素中，我们倾向于考虑遗传和环境起源的因素，尽管两者之间的区别是模糊的，因为肾结石可能是基因和环境之间相互作用的结果。因此，1-4肾结石是具有多因素发病机制的复杂疾病之一，如高血压、糖尿病、缺血性心脏病和骨质疏松症。研究其原因注定是困难的，尽管我们的生物/分子知识和新生物技术的进步为我们提供了强大的分析工具。这些方法无疑使遗传研究取得了进展，但我们对致病图的复杂性以及充分理解它所需的承诺的认识也同样有所提高。

阿拉伯数字遗传连锁研究

钙肾结石的遗传研究始于1990年代后半期。早期研究使用连锁方法进行，评估结石形成家族成员中肾结石与染色体位点的共偏析。这些方法在指向特定疾病所涉及的基因方面是强大而准确的，特别是在单基因疾病中，这就是为什么它们被应用于肾结石的原因。5一些研究还评估了与该疾病有关的表型，例如高钙尿症。

一些连锁研究根据流行的病理生理学假设考虑了被认为具有致病作用的候选基因的位点。该策略应用于300多对患有肾结石的法国 - 加拿大兄弟的样本，其染色体位点编码25（OH）维生素D的肾脏1α（α）羟化酶，维生素D受体（VDR）或钙敏感受体（CaSR）被测试。使用特定的多态性标记物测定每个区域。25-二羟基维生素D的1α（α）-羟化酶位点（染色体位点12q13.1-q13.3）是该样品中第一个研究的位点，但结果可以证实它没有作用。6使用六种不同的标记分析了染色体 12q12-14 上的 VDR 位点，其中四种与肾结石连锁不平衡，只有一种与高钙尿症，但意义较低。7最后，在法国-加拿大兄弟系列中，没有发现CaSR（3q13.3-21）的位点与肾结石的发病之间存在联系。8

当按世代研究石材形成者家庭成员时，联系研究产生了更显着的结果。一项研究重新考虑了VDR在印度家庭中的位点，并基本上证实了在法国 - 加拿大兄弟中获得的结果。9另一项研究证实，七个欧洲家庭中没有CaSR基因突变。10只有一项基于家庭的研究使用了覆盖全基因组的染色体标记（全基因组扫描）：这种方法使他们能够在没有任何初步致病假设或候选基因定义的情况下进行。在用多态性标记探索全基因组后，研究结果提示可以找到与肾结石有关的基因的位点。换句话说，全基因组扫描可以根据获得的结果开发致病假说。采用这种方法，在患有吸收性高钙尿症和肾结石的三个家庭中，确定了染色体1q23.3-q24与高钙尿症之间的联系。11对这一发现的解释被委托给随后的病例对照研究，该研究发现高钙尿症与可溶性（碳酸氢盐敏感）腺苷酸环化酶（sAC）基因的六种多态性之间存在关联。相同的多态性也与低骨矿物质量有关。12sAC基因的功能作用尚未明确，尽管我们知道它在肾脏，肠和骨细胞中表达，并且其功能由碳酸氢盐激活并由二价阳离子调节。13然而，sAC基因与高钙尿症之间的联系在一项针对九个家庭的欧洲研究中没有得到证实。14

尽管连锁研究的可靠性更高，但使用其他策略进行的研究，例如分析基因型与钙肾结石之间的关联，要多得多。这种趋势的原因在于所涉及的许多实践和理论问题。首先，很难找到至少涵盖三代人且数量足够大的家庭群体，以便进行联系研究。另一个问题在于连锁研究无法识别具有稀缺表型效应的基因。3，5这个问题特别适用于肾结石，因为结石可能不是由一个或几个具有强烈主要效应的基因突变引起的，而是由许多基因引起的化合物变化引起的，每个基因都不能单独引起疾病。15在这种情况下，因果底物可能如此多变和异质，以至于进行遗传研究和识别单个基因变得极其困难。

除了这些具体问题之外，还将个人归类为结石者还有更普遍的困难;事实上，肾结石可以在任何年龄发展，甚至可能被忽视。也可能是具有易感遗传遗传的个体不会形成结石，因为具有抗岩石作用的其他基因或营养素胜过岩石因素。16在肾结石情况下，这种现象的一个明显例子是为高钙尿症患者规定的低钠饮食。这些人的成岩风险因钙排泄水平较高而增加，但限制钠和氯化物的膳食摄入量会降低与高钙尿症相关的结石形成潜力，高钙尿症已知具有遗传成分。17也可能有几个遗传原因在复发性肾结石患者中起作用，但在一生中只产生一块结石的患者中则不然。18

3遗传关联研究

将基因型与钙肾结石相关联的研究是遗传连锁研究最常见的替代方案。他们评估等位基因或基因型在肾结石患者中是否比没有肾结石的患者更常见或更不常见。寻找这种关联可能涉及分析整个基因组或仅分析候选基因。在肾结石中，迄今为止只测试了候选基因2，但使用全基因组标记进行分析代表了前进的方向。19在关联研究中，对患者和对照进行基因分型，以获得沿候选基因序列排列的单碱基多态性。这些多态性的平均频率为每 1，200 个碱基 1，并有助于表型的变异性。它们可以放置在编码区域并引起氨基酸变化，或者放置在未转录的区域并保持蛋白质中的氨基酸序列不变。它们对表型的潜在影响通常仍然未知，这是此类分析的一个关键缺点。20

使用这种方法分析的第一个基因是VDR基因，考虑未转录的3′区域或转录起始密码子的多态性。这些多态性在各种研究中与钙肾结石有关，一些研究还观察到携带等位基因变异到 3′ 末端区域多态性的患者在生命早期发展为结石，并且具有更具侵袭性的疾病形式和较低的尿柠檬酸盐排泄水平。21-23虽然一些工作没有证实这些关联，24总体上获得的结果给人的印象是VDR基因多态性可以在钙肾结石的发作中发挥作用。所鉴定的VDR基因多态性是否对疾病具有重要的功能影响，或者这种关联是否仅仅是由于它们与其他功能相关的多态性共分离（即它们处于连锁不平衡状态）还有待观察。它们与肾结石的功能联系通常可以通过VDR-维生素D复合物激活肠道钙吸收这一事实来证明（图2.1）。然而，VDR-维生素D复合物似乎也能够减少尿柠檬酸盐排泄。事实上，它可以抑制磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶的表达，该酶可以通过刺激近端小管细胞管腔上的柠檬酸盐重吸收载体来限制其肾脏排泄。25

图 2.1  

肠道对钙的吸收被认为在结石形成中尤为重要。跨细胞吸收由转运系统介导，该系统涉及钙通过钙通道TRPV6从管腔转移到肠细胞中，而在基底外侧膜上，钙泵（PMCA）和钠-钙交换将钙离子带入间质。PMCA仅参与空肠和十二指肠的吸收，其中吸收是活跃的。在细胞质中，钙结合素9k（CBP）结合吸收的钙离子并引导它们走向基底外侧膜的载体。维生素 D 受体 （VDR） 复合物控制所有这些载体和 CBP 的基因表达，并通过非基因组效应调节 TRPV6 活性。VDR复合物与称为VDRE（维生素D反应元件）的特定基因序列结合，该基因序列可抑制维生素D依赖性蛋白质的基因。除了这些机制外，还有细胞旁钙吸收

全尺寸图像  

通过分析CaSR基因，研究其外显子7（3′-末端）的多态性以及第一内含子和启动子附近未转录的5′区域的多态性，获得了特殊结果。外显子 7 的 Arg990Gly 多态性与有和无肾结石患者的高钙尿症有关。转染CaSR基因的HEK293胚胎肾细胞体外结果表明，Arg990Gly多态性可引起CaSR基因的功能增益。26，27这一假设得到以下事实的证实：携带等位基因变异的原发性和继发性甲状旁腺功能亢进患者的 PTH 平均循环水平低于精氨酸等位基因携带者。28因此，密码子990处的甘氨酸等位基因在抑制Henle环厚升支细胞中的钙重吸收方面效果较差，从而使载体易产生更高的钙排泄水平（图2.2）。这就提出了一个问题，为什么这些相同的个体也不像CaSR基因激活突变的携带者那样低钙血症：也许Arg990Gly多态性对甲状旁腺和肾细胞使用的信号系统有不同的影响，因此它可以在不同程度上抑制甲状旁腺细胞中的肾小管钙重吸收和PTH产生。这种多态性在钙尿症中的重要性在原发性甲状旁腺功能亢进症患者中也得到了证实，因为携带 990Gly 等位基因变异的患者尿钙排泄水平更高，并且形成结石的频率更高。28

  图 2.2  

该图示意性地显示了厚升肢的细胞，说明了钙敏感受体（CaSR）基因的作用，该基因通过磷脂酶A2（PLA2）活化抑制Na-K-Cl共转运和钠重吸收，并产生花生四烯酸（AA）和二十碳四烯酸。这种抑制作用降低了间质和腔之间的电势，这本身阻碍了钙和其他阳离子的被动细胞旁重吸收。此外，钙重吸收的激活对钙泵（PMCA）有直接影响，从而抑制钙的主动重吸收

位于第一内含子或未转录的5′区域的CaSR基因启动子区域的多态性最近与意大利人群中的肾结石有关。29它们不需要氨基酸变化，并且考虑到基

因启动子的接近，它们可能通过修改基因的转录和CaSR在肾小管细胞中的表达来生效。由于肾中的钙浓度较高，CaSR的不同细胞表达可能对钙盐的沉淀和草酸盐结石的形成至关重要。30

编码骨桥蛋白、尿激酶、白细胞介素受体-1、肠道瞬时受体电位阳离子通道（TRPV6）、E-钙粘蛋白和表皮生长因子的基因的多态性也与肾结石有关。14，31-36这些基因在肾结石中的生理病理作用尚不清楚，仍然没有工作来证实初步结果。另一方面，已经获得了基因TRPV6的功能结果，该基因编码在肠粘膜中表达的钙通道，根据该结果，激活突变将通过增加肠钙吸收与肾结石32相关（图2.2）。

关联研究当然比连锁分析更容易进行，但它们并非没有问题。前面提到的将个人归类为受影响的困难也适用于这种情况;由于遗传底物或环境因素的差异，它们在不同人群中的结果重复性差，可能导致无法识别的分层，这使得不同的种群不适合比较。37这也可以应用于相反的意义;也就是说，由于不知情的有利分层，为假阳性结果创造了条件。尽管如此，这些研究也可以揭示对表型影响有限的基因，例如高钙尿症与CaSR基因Arg990Gly多态性之间的关系。发现等位基因变异 990Gly 与高钙尿症相关，并解释了一项研究人群中钙尿症表型变异性的 4%24;反之亦然，CaSR基因的位点与法国-加拿大兄弟中的高钙尿症或肾结石没有联系。8Arg990Gly多态性对钙尿变异性的这种稀缺影响可能是连锁研究的负面结果的原因。

迄今为止进行的关联和连锁研究选择了基因和多态性进行提前调查。虽然基因的选择通常基于生理病理学知识，但多态性的选择很少受到功能知识的指导。20由于引入了全基因组扫描方法，现在可以避免这一重要弱点，现在可以以仍然可观但可持续的成本进行，但这需要能够测试和处理大量样本和大量数据的技术和生物信息软件产品。最后，无论采用何种研究策略，通过对细胞和动物模型的功能研究来证实遗传发现至关重要。这些潜在的发展和前面提到的经验导致近年来逐渐重新考虑关联研究。

四遗传病动物模型

基因敲除小鼠是基因编程为不表达给定基因的动物。敲除菌株表型中肾结石的发展表明沉默基因在预防肾结石发作方面很重要。已知五种基因敲除小鼠会患上肾结石。没有slc26a13基因的小鼠缺乏在肠腔中分泌草酸盐的载体。结果，这些动物在生物体内积累草酸盐，其肾脏排泄增加，导致尿液沉淀和结石形成。38Caveolin-1敲除小鼠不能在肾细胞中产生洞穴;也就是说，对细胞功能很重要的蛋白质（如钙泵、CaSR 和 VDR）聚集的质膜内陷。这些小鼠无法从肾小管腔吸收钙，因此变得高钙尿症，在小管中形成钙磷酸盐沉积。39第三种敲除小鼠品系缺乏调节钠、钙和尿酸重吸收的蛋白质Na/Hexchanger调节因子（NHERF-1）。钙和尿酸盐排泄随着状钙沉积物的形成而增加。40在双敲除小鼠品系中，对于骨桥蛋白和Tamm-Horsfall蛋白，在39%的动物中发现了乳头状间质沉积物，可能是因为它们的尿液无法抑制钙盐沉淀。这两种蛋白质似乎具有协同抗岩作用，因为仅敲除一种或另一种只会在10-15%的动物中诱导状沉积。41++

最后，用于肾钠/磷酸盐共转运蛋白（NPTa）的敲除小鼠是一个有趣的模型，其表型特征是继发于肾磷酸盐丢失的低磷血症，高肾维生素D合成，高钙尿症和肾结石形成。42该图与常染色体显性遗传性低磷血症性佝偻病伴高钙尿症 （HHRH） 患者出现的情况相似。因此，用于NPT2a的敲除小鼠被认为是HHRH患者肾损伤的模型。然而，在 HHRH 患者中未发现 NPT2a 基因突变，而在磷酸盐近端NPT2c携带者中发现了突变。43这意味着人类和小鼠的近端磷酸盐重吸收组织不同：前者可能使用NPT2c作为近端小管细胞中磷酸盐重吸收的主要载体（图2.3），后者使用NPT2a。两种载流子在功能上有所不同，因为NPT2a维持三个钠离子和一个磷酸盐的电共转运，而NPT2c产生电中性共转运，重吸收两个钠离子和一个磷酸盐。NPT2a或NPT2c缺乏似乎对骨骼的影响不同，因为小鼠的表型不包括在人类中观察到的佝偻病。可能是两种磷酸盐载体在骨细胞中的表达不同：特别是，NPT2a发生在破骨细胞中，NPT2a敲除小鼠似乎具有更少，活性较低的破骨细胞。

图 2.3  

人体中的NPT2转运蛋白/载体用于重吸收近端小管中的磷酸盐。具体来说，NPT2c亚型负责85%的磷酸盐重吸收，而15%由NPT1介导。磷酸盐、FGF23 和 PTH 摄入抑制管腔膜上 NPT2 的表达，因为它们的存在会导致 NPT2 在溶酶体中内化和裂解。这是它们减少磷酸盐重吸收的机制

从前面提到的动物品系中获得的经验表明，敲除小鼠是有用信息的来源，并且相对容易获得。它们可能为新的研究假设铺平道路，但它们并不代表研究的基石，因为在任何情况下，将研究结果从小鼠转移到人类都需要了解正在研究的蛋白质在人类生理学中所起的作用。Osteopontin和Tamm-Horsfall蛋白以其在人类中的抗岩活性而闻名，而slc26a13草酸盐载体和NHERF-1的作用尚未确定。对NPT2的研究表明，将鼠标获得的数据传输给人类并不总是可能的。

5未来的研究领域

从前面的考虑中不难看出，与肾结石有关的基因以及疾病是如何传播的还有待解释。在选择候选基因进行研究时，研究人员专注于与钙代谢特异性相关的基因，其中VDR，CaSR和sAC基因似乎有助于钙结石的形成，尽管贡献程度尚不清楚。这些基因可能与原发性高钙尿症和骨质疏松症的发作有关，因此这些疾病与肾结石的关联强调了高钙尿症作为致病因素的重要性，并解释了结石形成者骨质疏松症的高频率，无论钙尿水平如何。

然而，除了钙代谢之外，肾电解质代谢的其他方面仍有待探索，极有可能在结石形成背后的发病机制中也很重要。一个例子来自表明sAC基因的潜在结石形成作用的研究。因此，人们非常感兴趣地等待全基因组扫描;特别是为了有机会，他们将为我们提供新的假设和研究观点，以克服我们当前理解的局限性。

总的来说，这里列出的研究考虑了一个基因，而不同基因之间以及基因与环境之间的相互作用通常被认为是肾结石发展的基础。结石形成基因可以或多或少地以复杂的方式与环境相互作用，从而产生多种形式的相互作用。与目前的研究状态一样，最有趣的相互作用是表观遗传类型，其中环境影响可以以稳定的方式修改表型，在不改变基因型的情况下传播给后代。45他们通过各种机制修改基因表达来实现这一点。在人类中，其中最常见的是基因启动子区域的甲基化，这可能意味着在高甲基化或低甲基化的情况下，基因转录分别被抑制或重新排列。46在胎儿和围产期生活中，不同的环境条件被认为能够产生表观遗传变化，从而影响新生儿对慢性病的易感性。关于基因与环境之间相互作用的研究注定要在肾结石环境中逐渐扩大，这也要归功于表观遗传学分析，但此类研究尚未在流行病学水平或动物模型中进行。

6结论

总之，我们可以说，10年来对肾结石的遗传研究无法显着提高我们对导致钙肾结石的原因的理解。但是，这个结论对所有致力于这个困难的、阴险的研究领域的人来说都是不慷慨的，无论如何，对于所有复杂的疾病，也可以这样说。事实上，直到不久前，可用的遗传调查工具对单基因的孟德尔传播疾病产生了令人兴奋的结果，但对于更复杂的疾病却令人失望。然而，近年来，新的人类基因组扫描方法、更便宜的高通量基因调查工具以及能够管理从大量人口样本（就数量而言）收集的数据的生物信息学软件都已经出现。迄今为止进行的研究是初步调查，尽管有其局限性，但它们可以用来为确定未来的研究工作提供基础。获得的结果主要涉及肾结石钙代谢的变化，但他们也提出了标准并测试了问题的维度。根据这些研究，现代生物技术和生物信息学工具，只要得到充分利用，应该能够帮助我们进一步了解钙肾结石背后的遗传原因。然而，在这项工作中，重要的是要承认一个基本步骤涉及样品收集，以使其在表型上尽可能均匀。为了使用我们的现代工具获得显着的结果，我们仍然需要依靠临床患者评估的古老艺术以及我们获得有关其特征的精确和标准化信息的能力。

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