科研丨南京农大(IF:11.2): 奶牛肠道胆汁酸代谢微生物群及相关饮食诱导的功能影响(国人佳作)

编译：微科盟等流心，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

人们已经认识到与胆汁酸(BA)相关的微生物菌株和酶对单胃动物的重要性，但由于缺乏对奶牛中BA代谢的了解，限制了靶向调节微生物-宿主相互作用对动物生产和健康的功能应用。本研究对奶牛6个肠道区域的108个内容物样本进行了鸟枪法宏基因组测序。共发现372个高质量的MAGs参与了BA的解聚、氧化和脱羟基化途径。此外，代谢BA的微生物群主要分布在大肠，导致次级非结合型BA的积累。比较基因组学分析表明，携带胆汁盐水解酶(BSH)基因的微生物群具有降解宿主黏蛋白聚糖的能力，以此适应奶牛肠道的选择性环境。序列相似性网络分析将439个BSH同源物分为12个Cluster，不同的Cluster具有不同的进化、分类、信号肽和生态位。本研究的组学数据进一步显示，Cluster 1中BSH基因丰度的增加与Firmicutes bacterium CAG-110有关，与谷物引入后结肠胆酸浓度的变化一致，并与肠道炎症密切相关。本研究首次采用以基因组为中心的方法和全肠道靶向代谢组学来揭示奶牛肠道微生物代谢BA的机制及饲粮对微生物代谢的功能影响。这些结果为调控肠道微生物以改善宿主健康提供了见解。

论文ID

原名：Genome-centric investigation of bile acid metabolizing microbiota of dairy cows and associated diet-induced functional implications

译名：以基因组为中心研究奶牛胆汁酸代谢微生物群及相关饮食诱导的功能影响

期刊：The ISME Journal

IF：11.217

发表时间：2022.10

通讯作者：毛胜勇

通讯作者单位：南京农业大学动物科技学院

DOI号：10.1038/s41396-022-01333-5

实验设计

结果

1 参与奶牛肠道BA转化途径的MAGs分析

对12头牛的6个肠道区域，包括十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠，共计72份内容物样本进行了鸟枪法宏基因组测序，共获得超过1.6 Tb的数据，718个高质量的原核MAGs，这些MAGs的完整性均>80%，CheckM评估的污染率<10%。合并我们之前研究中的6头牛，36份肠道内容物样本测序获得的260个高质量MAGs(完整性>80%，污染率<10%)。本研究通过对18头牛全肠道内容物测序获得的978个高质量MAGs(表S3)进行分析，其中以Acutalibacteraceae(106)和Rikenellaceae(102，主要是Alistipes spp.；图1；表S4)科为主。

注释分析结果显示，共有372个MAGs(超过38%)参与BA转化途径，包括解聚、氧化和脱羟基化(图1；表S5)。其中，368个MAGs编码BSH，它将结合的胆盐水解为游离的BAs(图1)，这些MAGs分布在9个门中，包括Firmicutes(185)和Bacteroidetes(135；图1)，表明多种系统发育型能够在奶牛肠道中水解胆盐。这些携带BSH的MAGs主要属于Acutalibacteraceae(18.8%)、CAG-272(12.8%)、Muribaculaceae(10.3%)、Rikenellaceae(7.3%)和Lachnospiraceae(5.7%)，并且主要的属为Alistipes(26)和CAG-485(20；图1；表S5)。此外，我们鉴定出只有3个MAGs编码7α-HSDH(以NAD(P)+依赖性方式氧化游离BAs的羟基)，这些MAGs分别是Escherichia flexneri(MAG172和MAG373)和Yoonia sp.(MAG697；图S1A，B；表S5)。只有2个属于BOG-935(Alphaproteobacteria)的MAGs携带baiB，这有助于以依赖ATP的方式连接CoA(图S1C，D；表S5)。因此，只有少数栖息在奶牛肠道中的细菌能够进行次级BA修饰。

图1 奶牛肠道978个宏基因组(MAGs)的系统发育树。分支根据不同门着色。热图代表不同肠道区域的MAGs。三个条形图显示了MAGs的纲、科和属级隶属关系。再外层3个条带代表每个MAGs中7α-HSDH、BSH和baiB的数量。最外层柱状图代表基因组大小。    

2 奶牛肠道微生物中特有的BA代谢

将本研究获得的978个高质量的肠道MAGs与以往研究报告中人类(2935个MAGs)和猪(2564个MAGs)的MAGs进行比较，奶牛肠道中微生物的BA代谢具有特异性(表S6)。我们的分类和功能注释表明，人类和猪肠道MAGs包含BSH、7α-HSDH、7β-HSDH、3α-HSDH、3β-HSDH、baiA、baiB和baiF，它们参与BA转化途径，而奶牛的肠道MAGs缺乏7β-HSDH、3α-HSDH、3β-HSDH、baiA和baiF(图2A)。 关于BA解聚，BSH以不依赖宿主的方式广泛存在于肠道中，占人类肠道MAGs的43.1%，占猪肠道MAGs的51.0%，占奶牛肠道MAGs的37.6%(图2A)。在科水平上，奶牛(18.8%)和猪(14.3%)的肠道中携带BSH的MAGs主要以Acutalibacteraceae为主，而人类肠道(16.7%)以Lachnospiraceae为主(表S5和S6)。Alistipes(7.1%)是奶牛肠道中携带BSH的第一大属，但它在人类和猪肠道内所占比例较低(图2B)。总之，肠道微生物的BA转化途径是由不同宿主特有的微生物种群所驱动的。具有胆盐水解能力的Acutalibacteraceae和Alistipes的比例较高，可能是奶牛肠道微生物对相关环境条件的适应性特征。 在所有编码的HSDHs中，单胃动物肠道最广泛存在的是7α-HSDH，占人类MAGs的4.02%，占猪MAGs的1.48%(图2A)。在人和猪中，携带bai参与初级BA的多步7α-脱羟基化途径的MAGs占比<1%(图2A)。尽管如此，与单胃动物相比，奶牛肠道微生物仍较少参与次级BAs的修饰过程。

图2 奶牛肠道特异性菌群的胆汁酸代谢。A，奶牛、人类和猪肠道中胆汁酸代谢相关基因的比较。B，奶牛、人类和猪肠道中携带BSH的MAGs在属水平的分类。BSH，胆盐水解酶；HSBH，羟基类固醇脱氢酶；bai，胆汁酸诱导基因。C，奶牛小肠中胆汁酸的比例。D，奶牛大肠中胆汁酸的比例。    

3 奶牛肠道区域特异性BA代谢潜力

比较奶牛的种群分类和BA谱，系统地表征了奶牛6个肠道区域的BA代谢潜力。88.4%以上的BA代谢MAGs来自大肠(盲肠，104；结肠，103；直肠，122)，其次是十二指肠(21)、空肠(18)和回肠(4)。大多数来自十二指肠和空肠的BA代谢MAGs为Clostridia(分别占57.1%和38.9%)和Bacilli(分别占19.1%和16.7%)。来自回肠的BA代谢MAGs属于Actinomycetia(Bifidobacterium globosum，50%)、Methanobacteria(25%)和Clostridia(25%)(表S5)。在大肠中，Bacteroidia和Clostridia占BA代谢MAGs的85%以上(表S5)。总之，肠道中与BA代谢相关的不同分类群从近端到远端呈区域特异性分布，大肠微生物对奶牛体内BA代谢有显著贡献。使用UPLC-MS/MS进一步进行了靶向代谢组学研究，以量化6个肠道区域的BA谱。分析显示，获得了27种BA，并观察到这些BA在6个不同肠道区域的浓度和组成不同(图2C，D；表S7)。结合型BAs的浓度在十二指肠和空肠最高，其次是回肠，最后是大肠。这些BAs包括牛磺胆酸(TCA)、甘胆酸(GCA)、牛磺脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺石胆酸和甘氨石胆酸(表S7)。十二指肠和空肠的非结合型BAs主要为TCA和GCA。TCA分别占十二指肠和空肠BAs的47.9%和44.9%。然而，TCA在大肠中含量较低(每个区域为1.1%；图2C，D)。约98.8%的BAs在回肠被有效地重吸收到血液中(表S7)。相反，在大肠中，通过微生物转化途径的次级非结合型BAs浓度较高，如βDCA、LCA、12-KetoLCA、isoLCA和isoalloLCA(表S7)，其中DCA在大肠中所测BAs中所占比例最大，而在十二指肠和空肠中仅占0.67%和2.1%(图2C，D)。因此，结合型BAs在十二指肠和空肠中占比最大，在回肠中被有效重吸收，微生物衍生的次级非结合型BAs主要富集在大肠中。    

4 奶牛肠道内携带BSH的MAGs的功能特性

最初的“gateway reaction”是携带BSH的初级BAs解聚，它介导胆汁耐受以适应肠道选择性应激。因此，通过比较Actalibacteraceae科和Aliistipes属中编码BSH的代表性菌群与非编码BSH的代表性菌群，探讨奶牛肠道中携带BSH的MAGs的功能潜力。比较从GPs、KOs和CAZymes中获得的功能谱，Acutalibacteraceae中携带BSH的MAGs(BCGs)普遍存在涉及α-半乳糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶和α-L-iduronidase的GH27和GH39，有助于降解宿主来源的黏蛋白聚糖。厌氧硫酸酯酶成熟酶编码于Actalibacteraceae科的BCGs中，用于降解肠黏蛋白中的硫酸化O-聚糖，但不存在于不携带BSH的MAGs中(NCGs；Rumino-coccus_E sp900317315和RUG420 sp900317085；图3A)。BCGs中的另一种独特蛋白属于Actalibacteraceae科，但不存在于NCG中，即SpoIID(图3A)，一种芽孢形成所必需的裂解性转糖基酶。所有Alistipes BCGs都含有大量α-Lfucosidase(GH29)和唾液酸酶(GH33)，而大多数Alistipes NCGs缺乏降解宿主黏蛋白聚糖所需的CAZymes(图3B)。此外，在Alistipes的BCGs中观察到与4-氨基-2-甲基-5-二磷甲基嘧啶生物合成(GenProp1590)和硫胺素二磷酸生物合成的超级途径II(GenProp1266)相关的GPs普遍富集。相反，Alistipes的NCGs缺乏这些硫胺素生物合成途径(图3B)。这些结果表明，携带BSH的微生物在奶牛肠道中具有强大的功能优势，包括营养底物竞争力、对外部环境条件的抵抗力和代谢能力。

为了进一步探索携带BSH的微生物群对从近端到远端肠道不同生态位的适应特性，比较了它们在6个肠道区域的分类和功能特性。在分类种群中，隶属Erysipelotrichaceae的MAGs分布在小肠中(主要存在于十二指肠，其次是空肠)，而大肠内有大量的Bacteroidales和Oscillospirales的MAGs。对碳水化合物相关基因特性的分析表明，来自小肠的携带BSH的MAGs选择性地处理溶菌酶(GH25)来利用微生物衍生的肽聚糖，而来自大肠的MAGs(特别是Bacteroidales)加工溶菌酶GH23、GH73和CBM50来降解肽聚糖(表S8)。此外，后肠微生物群优先利用宿主来源的黏蛋白聚糖和木聚糖，包括在Clostridiales bacterium UBA1740 MAGs中富集α-N-乙酰半乳糖苷酶GH109，以及在UMGS1976中表达乙酰木聚糖酯酶CE3(表S8)。此外，富集在小肠中的MAGs，特别是Erysipelotrichaceae，具有较高的膜运输系统的代表性，包括寡肽转运(OppABC)、寡糖转运(msmX)、氨基酸转运(metNIQ)、核苷酸转运(nupABC)和磷酸转移酶转运系统(表S9和S10)。相比之下，用于进一步发酵的丙酮酸到乙酰CoA的途径通过korAB在大肠中富集(表S9)。因此，区域养分有效性是筛选具有特定功能微生物种群的重要指标。

图3 奶牛肠道中携带胆盐水解酶(BSH)基因的MAGs的功能优势。比较Acutalibacteraceae(A)和Alistipes(B)中携带BSH和不携带BSH的MAGs在基因组特性、KOs以及碳水化合物活性酶方面的功能差异。  

5 奶牛肠道中BSHs的分类及变异模式

多个系统发育差异菌株之间BSH序列的广泛差异促使我们使用EFIEST构建了一个具有439种BSH同源物的SSN，这些同源物主要来自奶牛肠道微生物群的368个携带BSH的MAGs。我们的对齐评分阈值设置使所有BSH同源物分为12个cluster(序列同源性>40%；图4A)。Cluster 1包含来自172个MAGs的182种BSH同源物，分别属于Clostridia(86.3%)、Methanobacteria(4.9%，种Methanobrevibacter sp900314635)、Methanomicrobia(3.3%，Methanocorpusculum spp.)、Actinomycetia(2.2%，Bifidobacterium globosum)和Bacilli(1.1%，图4B)。Cluster 2包含来自112个MAGs的117种BSH同源物，属于Bacteroidia(89.7%，主要是Alistipes)、Gammaproteobacteria(4.3%)、Elusimicrobia(3.4%)和Alphaproteobacteria(2.6%；图4B；表S11)。Cluster 3(35种BSH同源物)和Cluster 9(3种BSH同源物)的序列都编码Bacteroidia(图4B)。Clostridia分布在Cluster 4(30种BSH同源物，主要是Ruminococcus_E sp900316555)、Cluster 5(20种BSH同源物)、Cluster 8(5种BSH同源物)、Cluster 11(2种同源物)和Cluster 12(2种同源物，图4B)。Cluster 6的17种同源物隶属Bacteroidia(58.8%)和Spirochaetia(41.2%；图4B)。Cluster 7中有8种BSH同源物隶属Bacilli(Erysipelotrichaceae)和1种BSH同源物隶属Clostridia(图4B)。Cluster 10有3种BSH同源物，隶属Spirochaetia和Clostridia。 进一步预测了不同cluster间439种BSH蛋白质的信号肽，它们是控制蛋白分泌和易位的短N-末端氨基酸序列。大约33.3%(146)的BSH同源物含有信号肽，包括96个Sec信号肽(Sec/SPI)和50个脂蛋白信号肽(Sec/SPII；图4C；表S12)。值得关注的是，信号肽主要从Cluster 2和3中的BSH序列中预测，几乎全部属于Bacteroidota(图4C)。在所有信号肽中，Sec/SPI最常出现在Cluster 2的UBA3388 sp002358835和Cluster 3的Muribaculaceae中，而Cluster 2中的Alistipes spp.的40.0%的BSH序列包含Sec/SPII(图4C；表S12)。还观察到，Cluster 4、7和8中BSH同源物普遍存在于小肠，而Cluster 1到8的BSH同源物主要存在于大肠(图4D)。这些结果表明，不同的BSH同源物具有不同的序列，这可能导致奶牛肠道中非结合BAs的不同功能含义。

图4 奶牛肠道中439种胆盐水解酶(BSH)同源物的分类与变异。A，基于序列相似性网络的所有12个BSHs簇(>40%的序列同源性)。B，在纲水平上每个cluster的分类特征。C，不同簇间439个BSH蛋白信号肽的预测。Sec/SPI，Sec信号肽；Sec/SPII，脂蛋白信号肽。D，12头奶牛6个肠区(包括十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠)12种BSH cluster的丰度和分布热图。TPM1，TPM+0.0000001；DUO，十二指肠；JEJ，空肠；ILE，回肠；CEC，盲肠；COL，结肠；REC，直肠。    

6 精料干预后微生物群特征的改变

基于牧草(粗料组)和谷物饲料(精料组)干预奶牛而影响微生物BA代谢的功能意义被进一步探讨，这两种饲料是最常见的日粮方案。乳脂率降低是精料组干预的主要生产性能特征(t检验，p=0.019)；然而，乳蛋白和乳糖的比率在两组之间没有显著变化(图S2)。日粮干预引起的显著变化也反映在发酵参数上，比如瘤胃内pH降低，丙酸、丁酸和戊酸浓度升高，其次在结肠中丙酸和戊酸浓度升高(t检验，p<0.05；图S3)。 结肠微生物群介导的BA转化对于宿主健康或疾病具有重要性。进一步分析两组奶牛结肠微生物群的特征，发现两组之间具有显著差异(ANOSIM，p=0.002；图S4A)。与粗料组相比，精料组有206个MAGs具有显著变化，包括43个MAGs丰度升高，163个MAGs丰度降低(Wilcoxon秩和检验，FDR<0.05；图5A)。丰度升高的MAGs主要包含Methanobrevibacter sp900314635、Phyllobacterium sp900539805、Bifidobacterium globosum和产丙酸菌Succiniclasticum sp900315805。Methanobrevibacter sp900314635和产丙酸菌Succiniclasticum sp900315805丰度增加了1.7倍以上。Phyllobacterium sp900539805和Bifidobacterium globosum的丰度增加了10倍以上。相比之下，丰度降低的MAGs包含Alistipes spp.和UMGS1976 spp.(Acutalibacteraceae；下降超过1.5倍)。进一步比较CAZyme谱显示，丰度升高的MAGs被预测通过加工溶菌酶(GH25)来破坏细菌细胞壁。

与粗料组相比，精料组对肠道BA代谢微生物群具有显著影响(ANOSIM，p=0.002；图S4B)。两组在结肠中的微生物群丰度也不同(Wilcoxon秩和检验，FDR<0.05，FC>1.5；图5A)。精料组中具有代谢BA并且丰度升高的MAGs主要包括Methanobrevibacter sp900314635、Bifidobacterium globosum、Firmicutes bacterium CAG-110和Eubacterium_H sp900318405。其中，Bifidobacterium globosum(MAG178和MAG176)和Firmicutes bacterium CAG-110(MAG324)的α-淀粉酶含量较高(GH13和CBM48；图5A)。此外，精料组中丰度降低的MAGs主要为UMGS1976(Acutalibacteraceae)、Bacteroidales bacterium UBA3388和Alistipes。这些MAGs主要编码与纤维素和半纤维素降解相关的酶(GH74、CE3、CE4、CBM35和GH39)，尤其是UMGS1976。此外，丰度降低的MAGs中另一个特征是富集了降解宿主黏蛋白聚糖的酶，包括GH109、GH20、GH29和GH78(图5A)。因此，这些结果表明，在饲料干预实验中，BA代谢MAGs的变化随着微生物基质的变化而改变。

图5 饲粮干预后奶牛结肠微生物组成和胆汁酸谱的变化。A，宏基因组组装基因组(MAGs)的丰度发生改变，包括BA代谢MAGs及其相关的CAZyme谱。B，PLS-DA 2D评分图，带有粗料组(F)和精料组(G)日粮之间的主成分箱线图。C，F组和G组奶牛结肠中28种相关的BA代谢物的火山图。蓝点代表BAs升高(FDR<0.05)，灰点代表BAs降低(FDR<0.05)。CA，胆酸；NorDCA，23-去甲脱氧胆酸；3-DHCA，3-脱氢胆酸；12-DHCA，12-脱氢胆酸；DCA，脱氧胆酸。D，F组和G组所有显著差异BAs的小提琴图。    

7 通过饲料干预重建结肠中微生物BA谱和宿主炎症反应

使用偏最小二乘判别分析比较粗料组和精料组奶牛的BA谱，发现两组的第一个PLS成分存在显著差异(p=0.004；图5B)。两组之间四种BAs的浓度存在显著差异(图5C)。精料组导致CA显著升高(图5D；Wilcoxon秩和检验，p=0.026)，表明初级非结合BAs的积累。同时，3-脱氢胆酸(3-DHCA；Wilcoxon秩和检验，p=0.015)和12-DHCA(t检验，p=0.021)也显著升高，但23-nordeoxycholic acid(NorDCA；t检验，p=0.009)降低(图5D)。考虑到初级非结合BAs的积累，我们也测定了谷物引入后结肠中BSH同源物的丰度变化，发现46种BSHs(5种BSHs升高，41种BSHs降低；Wilcoxon秩和检验，FDR<0.05；图S5)丰度具有显著差异。所有丰度升高的BSHs来自Cluster 1，缺乏信号肽，并且分布在Oscillospirales(表S13)，包括MAG560、MAG324、MAG281、MAG847和MAG538。其中MAG560和MAG324属于Firmicutes bacterium CAG-110，其丰度在精料组显著升高(图5A)。相比之下，丰度降低的BSHs来自Cluster 2(17种BSH同源物)、Cluster 4(8种BSH同源物)、Cluster 5(17种BSH同源物)和Cluster 7(3种BSH同源物)，其中约40%含有信号肽(表S13)。 进一步对两个分组奶牛的结肠黏膜样本进行组织学分析和转录组测序。结肠的组织学分析表明，精粮组黏膜淋巴细胞增加，导致上皮内粘液腺的不规则排列(图A)，粘膜层厚度降低(t检验，p<0.001；图6B)。测序显示共获得了18579个基因，平均表达>0.5 TPM。精料组中，在可用编码基因中，观察到723个DEGs，包括488个上调基因和235个下调基因(edgeR，Benjamini-Hochberg校正FDR<0.05和log2FC>1)。基于生物学过程进一步进行GO富集分析，发现精料组中与结肠黏膜炎症反应相关的急性期蛋白显著升高(图6C)。这些蛋白包括结合珠蛋白前体(HP)、血清淀粉样蛋白A(SAA2和SAA4)、脂多糖结合蛋白前体(LBP)、凝血酶原异构体X1(F2)、α-2-抗纤溶酶前体(SerpinF2)、α-2-HS-糖蛋白前体(AHSG)和α-胰蛋白酶抑制剂重链H4异构体X1(ITIH4)。KEGG通路分析显示，大多数DEGs富含补体和凝血级联(图6D，E)，导致宿主炎症反应。其中，甘露糖结合凝集素(MBL)前体(MBL1和MBL2)在精料组奶牛中表现上调，以激活凝集素途径(图6E)。C4b结合蛋白β链异构体X1(C4BPB)的表达下调通过减弱抑制作用促进C3转化酶的形成(图6E)。补体受体2型前体(CR2)的上调表达激活了B细胞受体信号途径(图6E)。此外，精料组提高了补体成分C8链前体(C8A和C8B)的表达，用于促进膜攻击复合体(MAC)的形成，最终导致细胞裂解(图6E)。通过qRT-PCR进一步验证了靶基因的mRNA表达，结果表达趋势保持一致(图S6)。总体而言，精料喂养导致了结肠黏膜炎症反应。

图6 精料干预后结肠粘膜宿主炎症反应的重建。结肠的组织学(A)和粘膜厚度(B)。C，基于差异表达基因(DEGs)的基因本体(GO)分析。上调的GO terms为红色；未改变的GO terms为绿色；下调的GO terms为蓝色。D，KEGG通路富集分析。bta04610，补体和凝血级联反应；bta00140，类固醇激素生物合成；bta03320，PPAR信号通路；bta04975，脂肪消化和吸收；bta04979，胆固醇代谢；bta04976，胆汁分泌；bta00590，花生四烯酸代谢；bta00591，亚油酸代谢。E，与补体系统相关的DEGs。MAC，膜攻击复合体。显著不同的编码相关通路的酶的基因显示为红色(精料组表现上调)和蓝色(精料组表现下调)。z score=(UP-DOWN)/COUNT^(1/2)，其中，UP、DOWN和COUNT分别表示GO或KEGG中上调、下调、总DEGs的数量。  

讨论

从18头奶牛108份肠道内容物样品中，测定了6个肠道区域内微生物的BA转化途径。我们以基因组学为中心的方法研究显示，超过38%的微生物群参与了奶牛肠道内BA的解聚、氧化和脱羟基化途径。进一步整合靶向BA池显示，BA代谢微生物群主要分布在大肠，是导致奶牛体内次级非结合BAs积累的主要生态位。这些微生物标记的未结合基团在肠道免疫和炎症中起着不可或缺的作用。相反，奶牛的十二指肠和空肠中富含来自肝脏代谢的初级结合型BAs，这类BAs在奶牛体内主要与牛磺酸结合，这种结合方式更接近鼠类而不是人类。在十二指肠和空肠中表达的宿主来源的结合型BAs，促进了食物中脂肪和维生素的吸收。据我们所知，本研究首次采用以基因组为中心的方法和全肠道靶向代谢组学来研究反刍动物肠道微生物代谢BA。我们的结果将有助于未来关于操纵BA池以改善反刍动物的生产和健康的研究。 胆汁耐受性是微生物群的一个重要特性，因为它决定了菌株在肠道中的生存能力。从宿主特异性的角度来看，我们的研究表明，属于Acutalibacteraceae和Alistipes的微生物群中，奶牛的胆盐水解发生率比人或猪高。值得关注的是，这些微生物群通过胆汁耐受、降解宿主黏蛋白聚糖、孢子形成和硫胺素生物合成等多种能力来应对肠道压力。比如，携带BSH的Alistipes spp.参与硫胺素的生物合成。硫胺素是能量、氨基酸和核苷酸代谢的重要辅因子，主要由反刍动物的后肠微生物参与合成。先前的一项研究显示，Alistipes spp.相对丰度较低，是人类肠道中的新物种，对炎症、癌症和心理健康有影响。

然而，这些细菌占奶牛大肠中MAGs的8.7%(表S1)。因此，具有胆汁耐受性的Alistipes spp.在后肠生态位中发挥了重要作用。此外，携带BSH的微生物群对黏膜健康具有新的营养策略。微生物群降解肠道黏蛋白的过程是复杂的，首先将O-聚糖(唾液酸、盐藻糖和糖硫酸盐)上的末端残基作为第一靶点，去除释放的末端糖，并在去除外围残基后进一步水解O-聚糖链的核心结构。在奶牛肠道中发现的携带BSH的微生物群富含岩藻糖苷酶、唾液酸酶和硫酸酯酶，这些酶可以去除修饰，从而释放末端糖并暴露O-糖链供营养共生的微生物使用。这种营养共生或资源共享的合作模式突出了具有胆汁耐受性的特定微生物菌群形成的复杂食物链，以获取丰富的宿主来源黏蛋白聚糖，并作为奶牛肠道中稳定的微生物网络在肠道环境中生存。 从奶牛肠道的近端到远端，携带BSH微生物群的功能特性存在区域差异。在大肠中，丰富的Bacteroidales和Oscillospirales对发酵过程有很大的作用。相比之下，Erysipelotrichaceae的大多数成员表现出有氧呼吸作用，主要分布在小肠中。此外，来自小肠的携带BSH的MAGs负责直接吸收简单营养物质，而后肠富集的MAGs则倾向于利用宿主黏蛋白聚糖。宿主分泌的黏蛋白聚糖是肠道微生物重要的底物来源，特别是远端肠道中的微生物群。因此，具有胆汁耐受性的微生物群具有区域性，以适应不同的生态位，如不同的氧气水平、营养物质的生物利用度和宿主粘液组成。 本研究进一步强调了胆盐水解机制的多样性和差异性。SSN将奶牛肠道微生物群的439个BSH同源物分为12个cluster。与系统发育分析中的序列比对相比，SSN可以揭示不同蛋白质家族之间的序列-结构-功能关联和进化关系。这样的分类角度揭示了不同的聚类由不同的属驱动，比如，cluster 2中的Alistipes、cluster 4中的Ruminococcus和cluster 6中的Treponema(表S11)，这表明12个cluster可能是从不同的水解酶前体进化而来的。此外，该分类系统区分了含有和不含有信号肽的BSH同源物。Cluster 2和3中大多数酶含有N-末端信号肽，而其他cluster中的酶中缺乏。虽然不清楚信号肽的存在与否和胆盐水解活性之间的关系，但是信号肽可能以不同的方式驱动水解酶。根据信号肽的存在与否，推测隶属于拟杆菌纲的cluster 2和3中的BSH酶大多是分泌型蛋白，而梭菌纲则不是。此外，不同的BSH簇反映了奶牛肠道中不同的生态位。比如，小肠中cluster 4、7和8的表现强调了这些BSH同源物和小肠健康之间的密切关联。此外，cluster 1到cluster 8的BSH同源物有助于后肠健康。总之，我们发现基于大规模SSN的方法对BSHs进行分类，为奶牛肠道中BSH同源物的进化、功能和生态学研究提供了新的角度。 进一步评估奶牛体内BA代谢和肠道健康之间的复杂关系。单胃动物的研究表明，微生物衍生的BAs作为重要的信号分子调节肠道微生物与宿主之间的相互作用，包括宿主的代谢和炎症反应。然而，在反刍动物中，BAs作为微生物和宿主健康之间的纽带的研究很少。我们的靶向代谢组学分析表明，饲喂两种不同的常见日粮，奶牛中的BA谱存在一些差异，其中最显著的差异是CA，一种主要的非结合型BA，在谷物饲养的奶牛中显著升高。此外，精粮组重塑了代谢BA的MAGs组成，通过降低植物生物量水解率和降解宿主黏蛋白聚糖而有利于淀粉的降解。宿主降解葡萄糖的微生物群减少表明，结肠粘液中可被微生物利用的多糖减少，这主要与精料饲养导致肠黏膜厚度降低有关。BA代谢MAGs丰度的升高让我们注意到Firmicutes bacterium CAG-110影响了cluster 1中BSHs的丰度变化，这与CA浓度的变化一致。我们之前的研究中显示，反刍动物大肠中Firmicutes bacterium CAG-110对精料组奶牛中结肠初级非结合型BAs的积累起到了重要作用。以往的研究表明，初级非结合型BAs和BSH的积累是结肠炎的特征，主要原因是CA导致条件致病菌富集。本研究进一步发现，精料饲养促进参与结肠黏膜凝集素途径的MBL的形成而导致炎症反应的发生。凝集素途径是由MBL或ficolins与病原体表面含有甘露糖的糖蛋白或碳水化合物结合而启动的。因此，我们的结果为研究代谢BA的MAGs与奶牛肠道健康的关系提供了重要线索。    

结论

综上所述，本研究对108个奶牛肠道内容物样本的BA转化途径进行了以基因组为中心的分析，确定了372个高质量MAGs，它们参与了BA的解聚、氧化和脱羟基化途径。与人和猪肠道微生物群相比，奶牛肠道微生物群中参与BA转化的微生物比例和多样性较低，主要表现为宿主源性结合型BAs在十二指肠和空肠中较高，而非结合型BAs在大肠中的丰度较高。比较基因组学分析表明，携带BSH的微生物群通过降解宿主黏蛋白、孢子形成和硫胺素生物合成的能力适应肠道压力。基于SSN将奶牛肠道微生物组的439个BSH同源物分类为12个簇，揭示了不同簇在进化、分类、信号肽和生态位上的差异。进一步整合微生物基因组特征、靶向BA谱和宿主转录组表明，Firmicutes bacterium CAG-110菌株处理了cluster 1中BSHs的丰度增加，与结肠CA浓度的变化一致。因此，本研究为更好地了解奶牛肠道中的微生物BA转化途径奠定了基础，为调控肠道微生物群以改善宿主健康提供了思路。