基于新弹头的KRAS(ON)-PROTAC

关于RAS

RAS (KRAS，NRAS 和 HRAS)是癌症中最常见的突变基因家族，因此，大量的研究团队尝试寻求一种有效的 RAS 抑制剂超过了三十年。甚至在十年前，针对RAS 抑制剂的研发毫无突破性进展，以至于 RAS 被称为“undruggable”。

图1. 人类癌症中 RAS 突变的频率和分布（左）KRAS、NRAS和HRAS突变在不同癌症类型中的占比（右）

现在，随着针对非小细胞肺癌中最常见的KRAS G12C突变型共价抑制剂的成功，以及针对G12D、G12S以及G12V等突变抑制剂的涌现，还有靶向激活状态的RAS(ON)抑制剂与针对RAS信号通路上SHP2、SOS1靶点药物纷纷进入临床，曾经的 “不可成药” 靶点 KRAS 正在逆袭成为热门靶点。

图2. RAS信号通路及癌症中靶向该通路的治疗方法

近年来，随着靶向蛋白降解（TPD）技术的发展，针对KRAS设计PROTAC的研发也陆续被报道（KRAS G12C/G12D-PROTAC）。PROTAC先驱Crews教授团队报道了首个KRAS G12C降解剂LC-2。其公司Arvinas也在开展KRAS-PROTAC相关管线研发。Dana-Farber癌症研究所也有KRAS G12C-PROTAC研究报道。对于KRAS G12D-PROTAC，百济神州与晶锐医药等公司有相关披露。

今天来说点不太一样的，基于新RAS(ON)弹头的KRAS(ON)-PROTAC，研发公司是BioTheryX。

BioTheryX 公司简介

BioTheryX成立于2007年。公司致力于通过蛋白质调节剂（包括多酶抑制剂以及蛋白质降解剂）来修复蛋白质稳态，以开发出能够改善患者生活质量的创新疗法。公司专有PHMs™（蛋白稳态调节剂）技术和基于PHMs™的PROTACs技术开发其它候选药物，加速临床前管线的发展。公司进展最快的项目BTX-A51是一种小分子口服多激酶抑制剂，这类共靶向CK1-α（特异性白血病干细胞靶点）和转录激酶CDK7/9的小分子在患有急性髓系白血病（AML）的实验小鼠中治愈率达到50%，可能会成为AML领域几十年来的一项重大突破。由于抑制CK1-α 可以激活肿瘤抑制因子p53，因此，BTX-A51作为一种p53蛋白调节剂更受到关注。目前，一项调查BTX-A51晚期实体瘤和非霍奇金淋巴瘤受试者中的安全性、毒性和药代动力学 （NCT04872166）与治疗复发/难治性急性髓系白血病和高危骨髓增生异常综合征（NCT04243785）的I期临床试验正在进行中。

公司另一款主打产品管线BTX-1188是一种设计合理的GSPT1和IKZF1/3双靶向分子胶降解剂，正被开发用于治疗血液系统恶性肿瘤和实体瘤。公司认为，降解 GSPT1（一种有前途的肿瘤学靶点）和 IKZF1/3（临床验证的免疫调节靶点）的组合相对于仅 GSPT1 的降解更具有优势。公司目前正在招募患者参加 BTX-1188 的 1/2 期临床试验，预计将于 2023 年中期获得初步结果。

除此之外，公司也在积极布局多条PROTAC管线，尤其是KRAS-PROTAC，其中一款KRAS-PROTAC产品BTX-2541已进入临床前阶段（笔者猜测为pan-RAS），而另一个KRAS-PROTAC项目BTX-1405目前已终止（笔者猜测为KRAS G12C）。

图3. 智慧芽数据库收录Biotheryx的pipeline，KRAS-PROTAC赫然在列

下面将对各公司的KRAS-PROTAC专利进行简要分析。

弹头的由来

德克萨斯大学健康科学中心的Alemayehu A. Gorfe教授在Plos One上发表了一篇“Novel Allosteric Sites on Ras for Lead Generation”的文章，报告了其通过一系列基于分子动力学模拟等计算方法，发现了KRAS上的四个变构配体结合位点。其中，口袋p1的特征最好，且由于在PDB数据库中存在P1位点结合配体-KRAS复合物的多种晶体结构，因此p1位点被认为是一个合适的靶点。该口袋位于功能关键的SWITCH I（25−40位残基）和II（60−75位残基）并包含5−7, 37−39, 50−56、67和70−75位残基。

随后，该实验室将MD模拟、高通量虚拟筛选与一系列生物物理和细胞分析技术相结合，最终发现和表征了一类新型抑制剂，代表性化合物Compound 11以亚微摩尔亲和力结合到p1口袋，其主要通过直接抑制KRAS与效应蛋白的相互作用来解除信号传导。

图4. 弹头的由来

Compound 11与分离的催化结构域（残基1−166）GTP-KRAS WT有KD=∼0.3μM的亲和力，同时对于GTP结合状态下的致癌突变体KRAS G12D、G12C和Q61H，具有非常相似的亲和力（KD=∼0.4− 0.7μM）。而对于在GDP结合状态下的KRAS WT和KRAS G12D、GDP/GTP结合状态下的HRAS WT和NRAS WT，检测到弱结合信号或没有结合。

随后研究发现，Compound 11还能够破坏KRAS与Raf间的相互作用（PPI），还能抑制突变KRAS的下游信号通路。细胞增殖试验表明， KRAS突变的癌细胞对Compound11更敏感。

图5. Compound 11选择性抑制KRAS（ON）

BioTheryX 公司专利分析

第一篇专利是WO2022087335A1，下图是专利权利要求书中马库什式的递进关系，可见该类KRAS-PROTAC的Warhead来自于7-(哌嗪-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶类Compound 11（上文所述），PROTAC的Linker连在了嘧啶连的苯环上，也有部分Linker连在了吡唑环连的苯环上。E3连接酶配体方面，主要选择了CRBN、IAP、MDM2以及VHL（分别对应专利中A,B,C,D四个系列化合物）。

图6. 专利权利要求书中马库什式的递进关系

图7中的Table 1里列举了专利中实施例对KRAS细胞株的细胞杀伤活性，包含野生型（WT）与G12C/V/D突变型以及G13D突变型，其中活性较好的化合物由红线标出，T1是弹头化合物。专利中还做了实施例对KRAS降解活性评价，但未给出数据（用的H358 KRAS G12C突变细胞系）。

图7. 专利中各实施例活性数据

代表性化合物如图8所示，可见活性较好的PROTAC主要是用的CRBN型E3酶，以及少许的IAP。结构上，Biotheryx对CRBN配体进行了一定的改动。同时，经过优化后的KRAS(ON)-PROTAC具有比KRAS(ON)抑制剂更好的KRAS突变及野生型肿瘤细胞杀伤活性。

图8. 代表性化合物结构式

另一篇专利是WO2022212611A1。这篇专利与上篇相似，Warhead保留不变，只是把E3配体换成了金刚烷极其类似物。部分化合物细胞杀伤活性与降解活性（HEK293细胞评价）如图9所示：

图9. 代表性化合物结构与活性数据

相似专利—杭州中美华东制药CN114621231这篇专利中跟BioTheryX的KRAS-PROTAC一样，用了同样的弹头compound 11，但不同于Biotheryx的从苯环上连Linker，中美华东制药选择了从哌嗪环上引入Linker（笔者认为，基于对弹头SAR分析，哌嗪环上改动会失去RAS/Raf的PPI抑制活性，结合docking哌嗪环可能并不是一个好的Linker连接位点）。

图10. Compound 11的Docking

代表性化合物活性图11所示，活性一般：

图11. 代表性化合物结构与活性数据

总结

综上所述，BioTheryX公司发现了一类活性较为出色的KRAS(ON)-PROTAC分子，对于KRAS突变型细胞系具有很好的细胞杀伤作用。有关这类化合物的具体效果，还有待今后该公司披露更多的研究数据。

参考文献：

1.  Nat Rev Drug Discov 19, 533–552 (2020).

2. Nat Rev Clin Oncol 19, 637–655 (2022).