隐球菌荚膜多糖抗原检测试剂FungiXpert（胶体金法）对于快速诊断隐球菌感染的临床应用价值研究

作者：刘雅 1 ，康梅 1 ，吴思颖 1 ，吴丽娟 2 ，何兰 3 ，肖玉玲 1 ，张为利 1 ，廖全凤 1 ，邓劲 1 ，陈志兴 1 ，马莹 1

单位：1四川大学华西医院检验科;2广西壮族自治区贵港市人民医院检验科；3成都市第六人民医院检验科

注：该文章翻译自作者自己发表的《Evaluation of a Cryptococcus capsular polysaccharide detection FungiXpert LFA (lateral flow assay) for the rapid diagnosis of Cryptococcosis》（2002年4月发表于《Medical Mycology》）

前言：

隐球菌是一种机会性病原真菌，也是真菌性脑膜炎的主要病因。隐球菌抗原（CrAg）LFA检测具有高敏感度和特异性，检测成本低，已被广泛应用于床旁检测（POCT）手段。此外，CrAg滴度与死亡率密切相关，可预测患者死亡风险。另一方面，CrAg 低滴度对于HIV阴性患者隐球菌病的早期诊断至关重要，当低血清滴度呈阳性时，建议常规进行腰椎穿刺取CSF检测。

隐球菌荚膜多糖检测K-set LFA试剂是一种在中国生产的商业检测产品。本研究的目的是评估FungiXpert LFA在检测血清和CSF样本中的诊断性能，并与美国食品和药物管理局（US-FDA）批准的IMMYCrAg LFA（Immuno-Mycologics, Norman, OK, USA）进行比较，分析与其他病原真菌和细菌的交叉反应。在本研究中，我们对真菌、细菌病原体与隐球菌抗原检测的交叉反应进行分析。评估FungiXpert LFA作为POCT手段诊断隐球菌病的性能。

方法

1.样本收集和临床信息

回顾性收集了199例样本（80例CSF和119例血清/血浆），样本均来自四川大学华西医院于2018.10.26至2020.11.27收治的158名接受隐球菌抗原筛查的患者，。所有样本储存条件为-20°C的冰箱中，并统计158名患者的性别和年龄。同时，回顾性分析CrAg阳性患者的实验室检查数据及临床诊断。

2.真菌和细菌菌株及样本制备

培养19个种的28株真菌及1株细菌菌株，用于评价两种试剂的交叉反应。以上菌株包括临床分离菌株、ATCC标准菌株、美国病理学家协会能力验证（CAP-PT）菌株：临床分离菌株包括新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）、胶红酵母（Rhodotorula mucilaginos）、白地霉（Geotrichum candidum）、皮炎外瓶霉（Exophiala dermatitidis）、阿萨西毛孢子菌（Trichosporon asahii）、黑酵母（Aureobasidium pullulans）、申克氏孢子丝菌（Sporothrix schenckii）复合体、顶孢霉菌（Acremonium）、互隔交链孢霉（Alternaria alternat）、断发癣菌（Trichophyton tonsurans）、须发癣菌（Trichophyton mentagrophytes）复合体、总状毛霉（Mucor racemosus），尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、腐皮镰刀菌（Fusarium solani）、生痰二氧化碳嗜纤维菌（Capnocytophaga sputigena）；ATCC标准菌株包括白念珠菌（Candida albicans）ATCC90028、近平滑念珠菌（Candida parapsilosis）ATCC22019、克柔念珠菌（Candida krusei）ATCC6258；CAP-PT菌株包括热带念珠菌（Candida tropicalis）CAP2013 F-1、烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）2015CAP F-04。临床分离菌株经MALDI-TOF MS（(Bruker Dalton-ics, Inc., Billerica, MA, USA）鉴定，通过Biotyper DB5989和丝状真菌数据库2.0进行检索，比对内部转录间隔区ITS1和ITS4序列；子囊菌和担子菌使用SDA培养基、35℃环境下培养；其他真菌使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基于28℃环境培养；细菌使用血平板培养基、35℃培养。培养出菌落后，菌株传代一次，再培养24h后进行检测。所有菌株均溶于0.9%的无菌生理盐水制成0.5McF标准真菌/细菌悬浮液制备，可得到每毫升1×105~5×106个细胞的酵母原液悬浮液。

3.检测试剂

隐球菌荚膜多糖检测试剂盒K-set LFA

IMMY CrAg LFA（ImmunoMycologics, Norman, OK, USA）

4.定性试验

IMMY CrAg LFA试验步骤如下：将40μL样本稀释液添加至微量离心管中，再加入40μL样本混合均匀，将CrAg检测条的白色端浸入样品中，在10min后记录结果。FungiXpert LFA试验步骤相似：将50μL样本处理液添加至微量离心管中，再加入50μL样本混合均匀，吸取50μL样本混合液滴加至检测卡的加样孔中，等待10min记录结果。

5.半定量滴度检测

IMMYCrAg LFA的操作步骤如下：将10个微离心管放在管架上，并将其标号为1-10(1:5到1:2560)，初始稀释液滴度为1:5；在#1管中加入160μL样本稀释液，在#2-10管中分别加入80μL滴定稀释液；将40μL样本加入#1管中，混合均匀；从#1中取80μL的试样转移至#2号管，混合均匀，重复上述稀释步骤直至#10管；丢弃#10号80μL;和#1号管40μL，使每管最终体积为80μL；将CrAg测试条的白色端浸入#1-10管中进行检测，在10 min后记录结果。FungiXpert LFA试剂的操作步骤类似：稀释操作同IMMYCrAg LFA相同；将每管50μL混合样品分别滴加到检测卡的样品孔中进行试验，10min后记录结果。

6.交叉反应试验

0.5McF标准真菌/细菌悬浮液样本可直接用于试验，无需稀释，操作步骤与定性及半定量试验一致。为准确计算滴度，用0.9%无菌生理盐水按10倍比例稀释，依次由1:10至1:10000；取10μL真菌/细菌悬液稀释液接种于SDA/血液琼脂平板（BAP）上进行菌落计数。

7.数据分析

比较了两种检测试剂定性结果的一致性，以IMMYCrAg LFA为参考标准，计算隐球菌荚膜多糖检测FungiXpert LFA的敏感性和特异性，与参考方法不一致的结果被定义为假阳性或假阴性。同时，通过回顾患者的病例，对定性结果不一致的样本进行分析。

数据分析使用社会科学统计22.0软件（SPSS Inc.,Chicago, IL, USA），评估比例、总体百分比一致性和kappa系数的置信区间（CI）。将两种试剂盒的半定量结果转换为对数关系后进行组内相关系数（ICC）分析。

试验结果

1.FungiXpert LFA定性试验性能优异

在199例IMMYCrAg LFA试验样本中，113例CrAg阳性（49例CSF和64例血清/血浆）。158名参与者的临床信息显示，其中55名女性（34.8%）和103名男性（65.2%）。在76例CrAg阳性患者中，69例（90.8%）患者被诊断为隐球菌感染；其中53例（69.7%）患者被确诊为隐球菌性脑膜炎，33名患者的脑脊液中分离出新型隐球菌/格特隐球菌复合体，另外20名患者通过墨汁染色、隐球菌抗原和临床症状被临床诊断为隐球菌性脑膜炎。此外，14例（18.4%）患者被诊断为肺隐球菌病，1例（1.3%）患者被诊断为播散性隐球菌感染，1例（1.3%）患者被诊断为隐球菌骨内感染，1名（1.3%）患者被诊断为可能的隐球菌感染，6名（7.9%）患者诊断为非隐球菌感染和未确定的隐球菌传染（图1）。与IMMY CrAg LFA相比，在定性试验中，FungiXpert LFA显示出敏感性为99.1%（95%CI，0.94，0.99）和特异性为98.9%（95%CI，0.93，0.1999），一致性为98.9%（kappa=0.98）（表1）。113例IMMY CrAg LFA阳性样品（滴度为1:2）中，1例样本FungiXpert LFA检测显示阴性结果，根据临床记录，该样本于2020年11月9日送检，为脑脊液，且患者经治疗后阳性滴度降低，此样本检测为假阴性结果。在86例IMMY CrAg LFA阴性样品中，有1例FungiXpert LFA试检测呈阳性（滴度为1:2），根据临床记录，患者通过病理活检被临床诊断为右乳腺浸润癌，此样本为假阳性（表1）。

图1. 本研究中应用于CrAg LFA检测的血清和/或脑脊液样本临床概述

表1. FungiXpert LFA（K-set）和IMMY CrAg LFA的试验结果（n=199）

注：LFA，侧向层析；CrAg LFA：隐球菌抗原侧向层析；CI：置信区间

2.半定量实验显示，FungiXpert LFA和IMMY CrAg LFA结果一致

对96例阳性标本（46例CSF和50列血清/血浆）进行CrAg滴度检测，最小滴度为1:2，最大滴度>1:2560，根据说明书，未进一步稀释>1:2560的稀释液。在CrAg半定量结果中，39例（40.6%）FungiXpert LFA测试滴度高于IMMY CrAg LFA；其中，29例（30.2%）FungiXpert LFA结果比IMMY CrAg LFA结果高一个滴度，11例（10%）比IMMY Grag LFA高两个滴度。通过两种试剂CrAg半定量结果的ICC为0.976（<0.4，弱相关性，>0.75，强相关性）（表2）。

表2. 两种试剂CrAg滴度半定量结果的组内相关系数

a无论是否存在交互作用，计算方式相同

b C类内相关系数使用一致性定义，从分母方差中排除度量间方差

c假设不存在交互作用，则计算此估计，因为否则无法估计

3.交叉反应试验结果显示，阿萨西毛孢子菌与两种试剂均显示存在交叉反应

FungiXpert LFA和IMMY CrAg LFA试验滴度分别为1:320（3.1×102CFU/ml）和1:160（6.3×102 CFU/ml）时均可观察到与阿萨西毛孢子菌（Trichosporon asahii）的交叉反应（图2）。此外，单一物种内的菌株变异不会影响本研究的结果，本研究中的其他真菌和细菌菌株未显示交叉反应（表3）。

图2.两种与阿萨西毛孢子菌的交叉反应试验（A. FungiXpert LFA. B. IMMY CrAg LFA）

表3. 真菌和细菌菌株的CrAg LFA结果 

讨论

在血清和脑脊液样本的研究中，IMMY隐球菌荚膜多糖抗原胶体金免疫层析法（LFA）的敏感性优于LA试验和酶免疫分析法（EIA）；LFA的优点还包括成本较低和易于使用。FungiXpert LFA 表现出优异的性能，在定性测试中具有99.1%的敏感度和98.9%的特异性。值得注意的是，所有假阳性和假阴性都是在低滴度样品1:2发现的，可能是因为低抗原浓度导致的。因此，在临界值附近的样本会有预期误差。其中一个病例IMMY CrAg LFA 阳性样本在 FungiXpert LFA 试剂测试中呈阴性。根据病历，我们推测这种不一致与两种检测方法对隐球菌抗原的检测敏感性有关。因为抗原清除的动力学很慢，我们推测 IMMY CrAg LFA 在检测较低浓度的抗原时表现出更高的灵敏度。

另一个不一致的结果是IMMY CrAg LFA 阴性样品在FungiXpert LFA上呈阳性，滴度为1:2。我们推测假阳性结果是由患者肿瘤中的非特异性抗体引起的。根据 Dubbels等人的研究报道，所有阳性结果中有 34%（13/38例）被认为是假阳性，半定量滴度在1:2和1:5之间。该研究还提到，假阳性病例最终被诊断为肿瘤相关疾病。因此，我们建议在首次对K-set试剂滴度为1:2阳性的患者进行隐球菌感染诊断之前对其临床表现进行综合判定。

我们观察到 FungiXpert LFA 和 IMMY CrAg LFA 在终点滴度上的差异。两种检测方法半定量CrAg滴度测试的ICC为0.976，表明两种试剂盒的半定量结果非常吻合。同时，在96名阳性患者中，有39名 FungiXpert LFA 的滴度高于IMMY CrAg LFA 的滴度。考虑到终点滴度与不同的检测方法有关，临床医生和实验室应注意，应使用相同的半定量 CrAg 检测方法对诊断时中枢神经系统疾病的概率进行风险分层或监测患者治疗的有效性。

目前，已经开发了一些快速半定量 LFA检测方法，至少有4种CE认证的用于体外诊断 (CE-IVD) 的CrAg LFA试剂，但并非所有都能检测到新型隐球菌和哥特隐球菌复合体的7个成员。然而，所有 7 种致病性隐球菌都被 IMMY和FungiXpert LFA检测到。

我们的研究也存在一些局限性。首先，用于比较的样品数量很少，尤其是滴度低于1:10的样品。其次，这是一项使用保存菌株的病理悬浮液而非临床标本的基础研究。最后，在我们的研究中，只有新型隐球菌用于交叉反应实验。

总之FungiXpert LFA是一种快速筛查方法，可以为诊断隐球菌病和监测患者治疗效果提供有效实用的方法。

-End-

题图 | veer.com

排版 | 张宁

审校 | 方研

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