​染色质修饰突变在膀胱癌表观遗传调控中的影响

染色质修饰突变在膀胱癌表观遗传调控中的影响

抽象染色质失调是癌症发病机制中的一个新兴主题，膀胱癌在许多其他癌症类型中脱颖而出，参与表观遗传调控的基因频繁突变。染色质水平调控的缺陷可以在多个水平上表现出来，例如DNA甲基化，组蛋白甲基化模式和非编码RNA的变化。膀胱癌中突变的染色质修饰剂，如KDM6A，KMT2D，KMT2C，ARID1A，EP300，已经在膀胱细胞系模型中进行了研究。此外，还有一些研究绘制了膀胱癌和组蛋白修饰谱的活跃调控环境。总的来说，现有文献强调了彻底了解膀胱癌表观遗传失调的重要性。膀胱癌的表观遗传特征可以通过表观遗传药物或其他基因组编辑工具靶向，最终为这种癌症带来特定的治疗选择。本章概述了膀胱癌的表观遗传修饰，以及表观药物治疗膀胱癌的潜力。

关键字：

膀胱癌中的染色质修饰剂，膀胱癌的表观药物，膀胱癌中的表观遗传学，膀胱癌中的组蛋白甲基化，膀胱癌中的突变

介绍

癌症是一种具有许多特征的复杂疾病（1）。在过去十年中，人们付出了巨大的努力来表征基因组景观并鉴定不同癌症类型的分子亚群（2-4）。所有这些分子研究都清楚地表明，表观遗传失调是与肿瘤发生有关的一个共同主题。很明显，适当的表观遗传调控对于正常的细胞稳态至关重要，任何偏离这种严格调节的平衡都会破坏细胞状态并可能导致肿瘤形成（5，6）。在所有其他癌症中，膀胱癌具有极高的染色质修饰突变率（7），因此被认为是表观遗传失调机制起重要作用的疾病。膀胱癌主要起源于尿路上皮，每年导致超过20万人死亡（8）。其主要分类基于组织病理学，分为非肌肉浸润性膀胱癌（NMIBC）和肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）。最近的研究表征了MIBC和NMIBC的突变景观，并进一步确定了共识分子亚群，为膀胱癌的发病机制提供了基本见解（9-12）。然而，仍需要进一步的研究来详细表征膀胱癌的表观遗传失调，并将这些信息用于膀胱癌的特定诊断和治疗。本章主要关注膀胱癌中频繁突变的染色质修饰因子、被破坏的主要调控机制以及表观遗传学疗法在膀胱癌中的潜在应用。

表观遗传调控与癌症

为了理解和解释癌症的起源和特征，多年来提出了几种理论。Hanahan和Weinberg提出的“癌症的标志”在一个逻辑框架中概念化和组织了这些原则（1）。所有特征和特征都定义了正常细胞从正常状态逐渐转变为肿瘤状态的方式获得的功能特性 （6，13）。标志的获得取决于基因组的改变、表观遗传重编程和微环境重塑。除了遗传改变外，表观遗传修饰还有助于癌症中的基因表达失调。表观遗传机制中的畸变，例如DNA甲基化，组蛋白修饰，非编码RNA（miRNA，lncRNA）中的失调，在肿瘤发生中起着重要作用，导致癌症的不同特征（14，15）。这些表观遗传失调可能导致基因表达的不适当激活或抑制。

DNA甲基化发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶残基处。虽然CpG二核苷酸在整个基因组中传播，但CpG岛（CGI）位于5'调控区域，例如基因启动子。启动子DNA甲基化与转录抑制有关（16，17）。在人类细胞中，3种不同的DNA甲基转移酶（DNMT1，DNMT3A和DMT3B）催化甲基向胞嘧啶残基的转移（18）。维持DNA甲基化的畸变对肿瘤发生至关重要。全局低甲基化和启动子高甲基化是癌症表观基因组的特征，分别有助于原癌基因的过表达和肿瘤抑制基因的沉默（19，20）。致癌信号通路还指导全球甲基转移酶的活性，这有助于从正常到癌症特异性甲基化谱的转变（15）。DNA甲基化的改变被称为膀胱癌发展的早期事件，被认为是癌症的标志（21）。

在真核细胞核中，DNA包裹在组蛋白八聚体周围，形成核小体结构。核心组蛋白（H2A、H2B、H3 和 H4）的 N 末端尾部主要针对翻译后修饰 （PTM），例如甲基化、乙酰化和磷酸化 （16）。组蛋白尾部的修饰会影响染色质结构，这对基因调控至关重要（22）。染色质结构是高度动态的，由染色质重塑复合物和组蛋白修饰酶协调。由组蛋白修饰酶和染色质重塑复合物活性缺陷引起的组蛋白修饰畸变可能导致肿瘤转化（23）。在许多癌症类型中经常检测到组蛋白基因或染色质修饰蛋白的突变，导致基因表达程序和基因组完整性受损（24）（图1）。

图1

癌症中表观遗传失调的景观。在肿瘤发生过程中，诱导启动子区域的DNA甲基化，而全基因组DNA甲基化被下调。癌细胞表现出破坏的组蛋白尾部修饰和染色质（更多...）

染色质调节剂在膀胱癌中经常发生突变

为了加深我们对癌症分子景观的理解，大规模的全基因组研究，特别是TCGA项目，收集了基因表达，转录本剪接变异，蛋白质表达，DNA拷贝数改变，体细胞突变，DNA甲基化和基因融合的数据，以及许多癌症类型的临床病理学数据，包括膀胱癌（11，25).综合组学研究表明，膀胱癌每兆碱基有五个或更多突变，与其他癌症类型相比，膀胱癌具有更高的突变负担（10，11，25，26）。膀胱癌中最常见的突变发生在组蛋白修饰和染色质重塑基因中起作用的基因中。其中包括ARID1A（25%），KDM6A（24%），KMT2D（27%），EP300（15%）（27）。在全球范围内，几乎80%的膀胱癌患者具有参与表观遗传调控的基因突变，这表明这种癌症的高度表观遗传失调（28）。同样重要的是要注意，膀胱癌中突变的染色质修饰剂主要在活性染色质组织和基因表达激活中起作用。在这种情况下，可以推测膀胱癌中的染色质修饰因子突变导致封闭的染色质结构，可能禁止尿路上皮分化所需基因的表达，同时导致支持增殖和肿瘤发生的基因表达程序（图2）。

图2

染色质修饰突变有助于膀胱细胞的肿瘤转化。染色质修饰基因的突变引导从活跃染色质组织转变为抑制状态。DNMT，DNA甲基转移酶;HAT，组蛋白乙酰转移酶;（更多...

膀胱癌的表观遗传景观

如前所述，表观遗传景观中的畸变是癌症的标志之一，DNA甲基化异常，染色质修饰因子突变以及染色质修饰剂和非编码RNA的基因表达改变导致细胞特征发生变化并促进不利的预后。表观遗传景观与膀胱癌基因表达之间的关联已在几项研究中得到解决（10，11，29）。一项研究定义了来自TCGA的23种癌症类型（包括膀胱癌）的全基因组染色质可及性和癌症特异性DNA调控元件，并确定了基因表达与染色质可及性之间的显着相关性，整合了转录组学数据和ATAC-seq（使用测序的转座酶可及染色质的测定）。此外，这项研究证明了基于ATAC-seq的聚类与先前建立的基于mRNA，miRNA，DNA甲基化或拷贝数变异（CNV）谱的分类之间的显着相似性。在这项研究中，还发现在膀胱癌的一个调节区域中观察到的体细胞突变增加了染色质的可及性并改变了突变膀胱癌中的基因表达（29）。

为了进一步扩展对膀胱癌表观基因组景观的了解，van der Vos等人（10）对MIBC的全基因组组蛋白甲基化分析进行了研究（10）。H3K27me3（一种抑制性组蛋白标记）和 H3K4me1 和 H3K4me3（基因激活组蛋白标记）ChIP-seq 和 RNA-seq 数据的综合分析表明，不同的增强子区域在 MIBC 管腔和基底亚型的表征中起着关键作用。

非编码RNA，如microRNA（miRNA），长非编码RNA（lncRNA），环状RNA（circRNA），piwi相互作用RNA（piRNA），小核RNA（snRNA）和小核仁RNA（snoRNA），不会翻译成蛋白质，但它们在每个细胞过程中仍然具有重要的功能。NcRNA还有助于促进膀胱癌发展和进展的表观遗传改变（30）。

DNA高甲基化的预后生物标志物潜力已在膀胱癌中得到广泛研究（31，32）。然而，需要进一步研究以获得更敏感和特异性的生物标志物。已经确定富含CpG的转座子，如LINE1，在膀胱癌类型中被低甲基化。这导致逆转录转位诱导基因组不稳定（33）。最近的一项研究调查了膀胱癌患者的全球组蛋白乙酰化水平及其预后价值，并报告与正常尿路上皮对照组相比，NMIBC和MIBC患者的H3乙酰化水平降低（34）。

组蛋白脱乙酰酶（HDACs）根据其与酵母HDACs的相似性分为不同的类别（35）。另一项研究报告，尿路上皮癌的 HDAC-1、HDAC-2 和 HDAC-3 表达水平升高。值得注意的是，HDAC-1和HDAC-2水平升高与高级别肿瘤有关。此外，与低级别肿瘤相比，具有高HDAC-1表达的高级别肿瘤与较差的预后相关（36）。这一发现支持HDAC的治疗靶点潜力。另一项研究确定了Hi-C的染色质相互作用，将其与腔内和基底型膀胱癌中的转录组和增强子谱相结合。尽管该研究以亚型特异性的方式暗示了表观基因组景观与3D基因组结构之间的关联，但还需要进一步的研究来全面揭示分子基础和所涉及的因素（37）。

膀胱癌染色质修饰突变的功能结局

鉴于膀胱癌染色质修饰剂突变的发生率很高，已经有许多研究调查了不同模型系统中突变的功能影响（表1）（38-46）。Polycomb抑制复合物2（PRC2）依赖性表观遗传调控对于膀胱尿路上皮细胞分化和增殖至关重要（47）。SWI/SNF 复合物作为 PRC2 复合物的拮抗剂，促进被 PRC2 沉默的基因的表达 （48）。ARID1A属于SWI/SNF复合蛋白（49），在原发性人膀胱癌中经常发生突变（25）。ARID1A在调节细胞周期进程和维持基因组稳定性的肿瘤抑制机制中起作用（38）。

与膀胱癌染色质修饰突变相关的关键功能结局。

ARID1A 蛋白丢失主要见于膀胱肿瘤的高级别和高度分期，表明与预后较差有关 （39，50）。ARID1A的潜在功能已在ARID1A敲除小鼠的尿路上皮细胞中进行了研究。已经表明，ARID1A的功能丧失突变上调尿路上皮细胞增殖，强调了ARID1A在膀胱癌发展中的肿瘤抑制作用（39）。此外，研究结果涉及膀胱中ARID1A和PRC2复合物之间的拮抗关系（51）。然而，ARID1A的功能可能取决于环境，因为不同的研究解决了ARID1A在不同细胞过程和癌症类型的对立作用（52）。

KDM6A（UTX），赖氨酸组蛋白去甲基化酶，与染色质修饰酶如KMT2C（MLL3）和KMT2D（MLL4）发生物理相互作用（53）。KDM6A蛋白含有四三肽重复（TPR）结构域和Jumonji C（JmjC）结构域。JmjC结构域催化从H3K27me2和H3K27me3中去除甲基（53，54）。TPR结构域与MLL3和MLL4复合物的组分进行相互作用（55）。KDM6A的功能一直是许多研究的主题。这些研究报告了KDM6A调节基因表达和细胞过程。作为COMPASS复合物的组成部分，KDM6A参与基因激活的调节（56-58）。功能丧失和失活突变经常发生在几种肿瘤中，包括膀胱肿瘤（59-62）。KDM6A表达降低和KDM6A突变与膀胱癌预后不良相关（40）。此外，KDM6A在免疫反应中的潜在作用已通过TIMER和CIBERSORT算法显示。基因集富集分析表明，参与免疫的信号通路在KDM6A突变患者中受到抑制。这些发现暗示了KDM6A突变与抗肿瘤免疫之间的关系（40）。在另一项研究中，Kobatake等人表明，KDM6A表达的降低与促炎途径的激活有关（41）。在两种不同的KDM6A敲除膀胱细胞系中观察到增殖增加（42）。值得注意的是，KDM6A在保护膀胱癌细胞系的管腔基因表达程序方面发挥作用（43）。

研究重点是KMT2C（MLL3，组蛋白赖氨酸甲基转移酶2C）在正常细胞中的功能，确定了其在调节增强子活性中的作用，重点是H3K4me1标记的谱（63，64）。独立于其H3K4me活性，KMT2C在转录调控中的作用已在最近的报告中得到证实（65，66）。KMT2C的肿瘤抑制作用已被报道用于尿路上皮癌。2种不同膀胱癌细胞系中的KMT2C沉默已被证明直接或间接影响参与细胞周期控制，DNA修复，DNA复制和凋亡的基因的表达（44）。为了研究其进一步的影响，已经通过ChIP-seq绘制了KMT2C的全基因组结合谱（44）。为了评估KMT2C对膀胱癌表观遗传景观的影响，Rampias等人（44）还研究了KMT2C沉默后H3K4me3，H3K27ac和H3K9ac组蛋白修饰的变化。敲低KMT2C影响膀胱癌细胞系中的增强子活性。在H3K4me1沉积中发挥的重要作用的同时，KMT2C与活性增强子标记H3K27ac的共定位指出了增强子活性的增加（44）。此外，KMT2C丢失会影响对细胞粘附，细胞外组织和上皮分化至关重要的基因的表达（44）。

KMT2D（也称为MLL4）是组蛋白甲基转移酶之一，可能在膀胱癌的肿瘤发生和进展中起关键作用（63）。KMT2D调节H3K4甲基化的活性（67）。KMT2D在膀胱癌中的突变率很高。低水平的KMT2D与淋巴结转移有关（68）。与正常膀胱细胞系相比，4 种膀胱癌细胞系（T24、J82、UM-UC-3 和 HTB-9）中的 KMT2D mRNA 和蛋白表达降低。KMT2D的沉默诱导T24和HTB-9细胞系的侵袭，而其过表达抑制。已经证明KMT2D调节膀胱细胞系中H3K4me1的水平（68）。有趣的是，虽然Sun等人（68）显示较高的KMT2D表达与较高的存活率之间存在关联，但Ding等人（45）暗示KMT2D突变与膀胱肿瘤的更好预后有关。基因集富集分析表明，KMT2D突变也与细胞周期和DNA复制过程显着相关（45）。

CREB结合蛋白（CREBBP或CBP）和E1A结合蛋白（EP300或P300）是转录共激活剂，还具有泛素连接酶活性和组蛋白乙酰转移酶活性（69）。CBP和EP300在多种人类肿瘤中经常发生突变（70）。这些导致乙酰化失调和肿瘤转化的失活改变已在肿瘤模型和膀胱癌系中进行了研究 （71，72）。Duex等人（71）定义这些突变主要富集在EP300和CBP的组蛋白乙酰转移酶结构域，这意味着结构域活性对肿瘤发生的潜在意义。他们还假设组蛋白乙酰转移酶活性的损害更有可能与侵袭性的MIBC病例有关（71）。还发现EP300中的突变促进了参与膀胱癌抗肿瘤反应的信号通路（46）。

操纵染色质修饰因子突变治疗膀胱癌

需要诊断和治疗膀胱癌的新策略和选择来增加药理学结果。表观遗传学在诊断标志物和治疗靶点中的应用是一个快速发展和有前途的领域。表观遗传变化的可逆性作为膀胱癌的治疗靶点具有巨大的潜力。表观药物的改善对于表观遗传失调起关键作用的癌症或疾病具有很大的优势（图3）（73）。

图3

癌症治疗的表观遗传疗法选择。外延药物可以单独使用，也可以与其他治疗方法联合使用。表观基因组编辑技术也是癌症治疗的新兴替代方案。DNMTi，DNA甲基转移酶抑制剂;EZH2i，（更多...）

抑制DNMT酶，可以逆转基因沉默，进而恢复肿瘤抑制基因的表达。已经发现DNMT抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷（DAC）诱导细胞周期停滞，并增加膀胱肿瘤对化疗的敏感性（74）。5-氮杂-2′-脱氧胞苷和5-氮杂胞苷被FDA批准用于治疗骨髓增生异常综合征和骨髓系白血病。正在进行用于膀胱癌治疗的临床试验（75）。

几种HDAC抑制剂在泌尿系统癌症中显示出希望（76）。已经证明，用HDAC抑制剂伏立诺他，罗米地辛和曲古抑素A治疗膀胱癌细胞时抑制细胞生长和增殖（77，78）。进一步的分析表明，蛋白质表达的变化主要与细胞凋亡，细胞周期调节以及响应这些HDAC抑制剂治疗的DNA损伤修复机制有关（78）。HDAC抑制剂Romidepsin已被FDA批准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL），而Belinostat和Panobinostat被批准用于治疗T细胞淋巴瘤（79）。与其他化疗药物联合使用，HDAC抑制剂协同影响恶性细胞的细胞周期停滞，凋亡和分化（30，80）。已经表明，DNMT抑制剂和HDAC抑制剂的组合对癌细胞也有协同作用（76）。

在膀胱癌中已检测到G9a，H3K9甲基转移酶的表达水平升高。抑制膀胱癌中G9a抑制膀胱癌细胞中诱导自噬细胞死亡的增殖（81）。用小分子UNC064，G9a抑制剂治疗膀胱癌细胞系会降低细胞活力，同时诱导细胞凋亡（82）。

组蛋白甲基转移酶EZH2作为PRC2复合物的催化亚基，调节H3K27（H3K27me3）的三甲基化（83）。这种组蛋白标记对于抑制基因表达至关重要。越来越多的证据表明，EZH2决定了不同类型肿瘤的发展和进展。EZH2表达失调与细胞增殖，侵袭和转移增加有关（84）。值得注意的是，据报道，EZH2也与化疗耐药性有关（85）。EZH2的上调表达在膀胱癌中起致癌作用。由于它影响基因表达并调节几种细胞机制，因此EZH2作为治疗靶标具有很大的潜力（86）。目前，EZH2抑制剂Tazemetostat正在正在进行的临床试验中研究，用于治疗尿路上皮癌，以及淋巴瘤和其他实体瘤（87-89）。

表2总结了目前正在临床试验中的表观遗传修饰因子的治疗靶向（https://www.clinicaltrials.gov/）。在一篇综述中，Ozgun等人（28）评估了EZH2抑制剂或HDAC抑制剂与类视黄醇在膀胱癌中的联合用药。他们指出了视黄酸及其衍生物的潜在治疗选择，并强调了研究类视黄醇与表观药物组合使用的临床试验（28）。

表2

膀胱癌的潜在外延药物。

able 2Potential epidrugs for bladder cancer

Epidrug

Biological effect

Clinical trial

Combinatory therapies

另一种类型的表观遗传疗法是基于miRNA操作。策略基本上侧重于调节癌细胞中miRNA的表达和活性（75，90）。这种操作是通过模拟特异性miRNA（91）或给予表观药物（如EZH抑制剂（92，93））来管理的。

CRISPR/Cas9系统已成为基因组靶向中广泛使用的技术。由于技术改进，可以使用CRISPR平台实现靶向表观基因组编辑（94）。dCas与染色质修饰结构域的融合代表了染色质编辑的强大工具（95）。表观基因组编辑是通过CRISPR激活和抑制系统（CRISPRa / CRISPRi）在人类细胞中实现的。这些方法可用于体内和离体的表观遗传重编程，疾病建模，治疗靶向和细胞疗法（94）。最近的临床研究已经在人类造血祖细胞和干细胞中进行基于CRISPR的表观基因组编辑，用于治疗免疫疾病（96）。然而，需要做出更多努力来建立常规临床使用。

结论

染色质修饰基因的突变在膀胱癌中非常常见（11）。有大量研究强调，表观遗传失调对于了解膀胱癌发病机制、表型表征、疾病结局的确定以及指导治疗方案至关重要。膀胱癌表观遗传学的临床应用仍处于发展阶段。扩展我们对尿路上皮恶性肿瘤表观遗传学的有限知识将有助于改善诊断和开发更精确的靶向治疗。靶向表观遗传机制的药物、用于诊断的表观遗传生物标志物以及定制癌细胞的表观基因组状态是个性化医疗的新兴领域。然而，表观药物和表观基因组编辑在临床上的实施仍然需要克服许多挑战。

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