CRISPR/Cas系统在非核酸靶标检测中的应用

成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)是原核生物中重要的适应性免疫系统[1]。CRISPR/Cas系统因其对靶基因的高度识别而在基因编辑方面产生了革命性的影响[2]。因此，Emmanuelle Marie Charpentier和Jennifer Anne Doudna因其在使用CRISPR/Cas系统进行基因编辑方面的贡献而被授予2020年诺贝尔化学奖。 除了基因编辑，许多研究表明，CRISPR/Cas系统由于其DNase/ RNase特性，可以加以开发并将其应用于检测领域。具体来说，信号核酸可以被guide RNA和Cas蛋白准确识别和靶向，在识别ssDNA或dsDNA或ssRNA靶标后，Cas12a/Cas13a/Cas14a蛋白对DNA或RNA序列表现出无差别的“trans-cleavage activity”[3]（如表1所示），这些均为生物传感的应用提供了理论基础。为此，基于CRISPR/Cas的诊断(CRISPR- Dx)于2016年首次建立[4]。在过去的六年里，许多基于CRISPR/Cas系统的核酸检测平台也被成功开发，包括DETECTR[5]，SHERLOCK[6]，HOLMES[7]，CONAN[8]，CCB-Detection[9]和Cdetection[10]。因此，CRISPR-Dx已成为与农业和食品安全、人类健康和环境监测相关的重要核酸诊断技术。

除了核酸靶标，各种非核酸靶标也是环境污染、人类疾病和预后以及食品污染的生物标志物。传统的非核酸靶标检测方法包括高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、质谱法(MS)、磁共振成像(MRI)、酶联免疫吸附测定(ELISA)等。然而，这些传统方法耗时长，成本高，需要昂贵的仪器和专业的操作人员。相比之下，CRISPR/Cas生物传感系统提供了无需专业设备的廉价、快速、准确和即时检测的便利性。因此，推进CRISPR-Dx在非核酸靶点的应用具有重要意义。

开发针对非核酸靶点的可激活CRISPR/Cas传感器的主要挑战在于找到一种方法，将识别非核酸靶标信号转导为Cas蛋白的trans切割活性信号，而Cas蛋白的trans切割活性通常是通过crRNA与靶标DNA的特异性结合（以下称为“activator”）来激活。为了充分发挥CRISPR技术在诊断应用方面的潜力，研究人员设计了许多基于靶向响应功能的DNA ，如结构转换适配子或DNAzyme等，将其激活CRISPR/Cas传感器产生的trans切割活性信号作为非核酸靶标信号。

功能性DNA/RNA已被研究证明可以选择性地结合多种非核酸靶标，包括有机小分子、金属离子、蛋白质、病毒，甚至细胞。在此，我们系统地将不同类型的非核酸检测靶标划分为六种类型。今天将为大家分享CRISPR/Cas系统在离子类靶标检测领域的应用，带大家一起了解基于CRISPR/Cas系统的检测特点和原理。

如何用CRISPR-Cas系统检测离子类靶标？

一些金属离子不仅是环境污染物，而且对人体健康也有重要影响，如肾脏损害、不孕不育和高血压等[11]，因而金属离子的准确检测至关重要。由此，一些基于CRISPR/Cas12a-DNAzyme的生物传感器也被开发出来。

1．铅离子

Pb2+的广泛污染对人类健康，尤其是儿童健康造成了巨大威胁，因此，准确的现场检测和定量环境中的Pb2+是扭转其负面影响的重要一步。 对于Pb2+依赖的DNAzyme，它与DNA activator一起催化核酸底物，在Pb2+存在的情况下释放DNA activator，随后CRISPR/Cas12a系统被激活。根据CRISPR/Cas12a反式剪切ssDNA的特点，将两端分别带有荧光团和淬灭剂修饰的ssDNA荧光报告基因进行剪切，产生荧光信号。荧光信号强度与Pb2+浓度成正比（LOD = 0.053 nM）。相反，在没有Pb2+的情况下，DNAzyme没有活性，则不产生荧光信号[12]。 

图1 DNAzyme调控的CRISPR/Cas12a铅离子检测传感器的设计

2．钠离子

钠（Na+）是生物学中最重要的金属离子之一，参与许多生物过程。Na+的检测可与疾病诊断结合使用，例如，Na+浓度可用于评估病理生理条件下的低钠血症（Na+ level＜135 mM）和高钠血症（Na+ level＞145 mM）。

同样的，将依赖Na+的DNAzyme与CRISPR/Cas12a联合，可用于Na+检测(图2)。在该体系中，通过上转换发光纳米粒子(UCNP)来降低背景信号的干扰。优化后的生物传感器对Na+（LOD = 4.3 nM）显示出卓越的灵敏度和良好的特异性[13]。

图2 DNAzyme调控的CRISPR/Cas12a钠离子检测传感器的设计

3．氟离子 

作为生物体的基本元素，氟化物在牙齿健康中发挥着重要作用，并具有治疗骨质疏松症的潜力；另一方面，氟化物容易在排泄缓慢的生物体中积聚，从而可能导致过量氟化物摄入，从而诱发病理状态，包括氟化物症、尿石症、骨质疏松症、神经和代谢功能障碍、胃和肾问题，以及某些类型的癌症。由于氟化物的广泛使用，氟化物在环境和饮用水中的污染则受到人们的关注。 虽然基于CRISPR/Cas的生物传感器在阳离子的检测方面取得了进展，但对阴离子的检测相对有限。为了解决这个难点，研究人员在检测体系中引入了氟离子（F-）响应型核糖开关。如图3，在该工作中，DNA模板由启动子、间隔序列、F-核糖开关和Cas13a靶向序列组成。F-应答的核糖开关直接触发转录过程，产生完整的RNA产物。完整的RNA可以激活检测系统，产生荧光信号。相反，则转录过程被终止，没有荧光信号产生。值得注意的是，该方法大大提高了F-的检测范围，并显示出较低的检测限（LOD = 1.7 μM）。该策略的设计进一步开发了CRISPR/Cas系统在阴离子检测领域的应用价值。[14]

 图3 氟化物核糖开关调节转录与Cas13a (FRITCas13a)串联传感器检测水溶液中氟的检测策略

通过将功能性DNA/RNA与CRISPR/Cas系统联合，可以在POC设备所需的条件下（如环境温度和简单快速的检测流程），进行金属离子的定性与定量检测。我们期望这种多功能和高效的生物传感器构建策略能够极大地推进基于CRISPR/Cas的生物检测平台在非核酸靶标诊断中的应用。

参考文献：

[1]. Makarova, K.S., Wolf, Y.I., Alkhnbashi, O.S., Costa, F., Shah, S.A., et al.,2015. Nat. Rev. Microbiol. 13, 722-736.

[2]. Malinin, N.L., Lee, G., Lazzarotto, C.R., Li, Y., Zheng, Z., et al. 2021. Nat. Protoc. 16, 5592-5615.

[3]. Feng, W., Newbigging, A.M., Tao, J., Cao, Y., Peng, H., et al. 2021. Chem. Sci. 12, 4683-4698.

[4]. Pardee, K., Green, A.A., Takahashi, M.K., Braff, D., Lambert, G., et al. 2016. Cell 165, 1255-1266.

[5]. Chen, J.S., Ma, E., Harrington, L.B., Da Costa, M., Tian, X., et al. 2018. Science. 360, 436-439.; Harrington, L.B., Burstein, D., Chen, J.S., Paez-Espino, D., Ma, E., et al., 2018. Science. 362, 839-842.

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[7]. Li, S.Y., Cheng, Q.X., Wang, J.M., Li, X.Y., Zhang, Z.L., et al. 2018. Cell Discov. 4, 20.

[8]. Sheng, A., Wang, P., Yang, J., Tang, L., Chen, F., et al. 2021. Anal. Chem. 93, 4676-4681.

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[10]. Teng, F., Guo, L., Cui, T., Wang, X.G., Xu, K., et al. 2019. Genome Biol. 20, 132.

[11]. Mehta, P.K., Jeon, J., Ryu, K., Park, S.H., Lee, K.H., 2022. J. Hazard Mater. 427, 128161.

[12]. Li, J., Yang, S., Zuo, C., Dai, L., Guo, Y., et al. 2020. ACS Sens. 5, 970-977.

[13]. Xiong, Y., Zhang, J., Yang, Z., Mou, Q., Ma, Y., et al., 2020. J. Am. Chem. Soc. 142, 207-213.

[14]. Ma, Y., Mou, Q., Yan, P., Yang, Z., Xiong, Y., et al. 2021. Chem. Sci. 12, 11740-11747.