科研丨浙工大: 机器学习预测抗生素特性对水生环境中细菌群落组成和功能的影响(国人佳作)

编译：微科盟Moon，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

在过去的几十年里，科学家从微生物代谢物中分离或人工合成数百种抗生素，用于保护人类、动物和农作物免受微生物感染。抗生素的长期使用会影响微生物群落组成，并对微生物群落的功能造成损害。然而，到目前为止，不同抗生素特性对水生微生物群落的影响还没有得到很好的研究。本研究结合元数据分析和机器学习，对9类50种主要抗生素在浓度为10 ug/L时对水生细菌群落的环境风险进行了表征。元数据分析表明，只有在使用氨基糖苷类和β-内酰胺类抗生素处理后，细菌群落的α-多样性增加，而几乎所有测试的抗生素都改变了细菌群落结构。抗生素处理也干扰了细菌群落的功能，尤其是代谢通路，包括氨基酸、辅因子、维生素、外源物质和碳水化合物代谢。通过机器学习筛选抗生素影响水生细菌群落组成的关键特征(原子立体中心数、抗生素中氢原子数和脂肪水系数)。影响细菌群落功能的抗生素的关键特征是氢原子数、分子量和复杂性。综上所述，本研究通过建立机器学习模型和进行元数据分析，从宏观上确定了抗生素特性及其对水生微生物群落的不利影响之间的关系。此外，该研究还为抗生素的合理设计提供了指导。  

图文摘要    

论文ID

原名：Machine learning predicts the impact of antibiotic properties on the composition and functioning of bacterial community in aquatic habitats

译名：机器学习预测抗生素特性对水生环境中细菌群落组成和功能的影响

期刊：Science of The Total Environment

IF：10.753

发表时间：2022.3

通讯作者：钱海丰

通讯作者单位：浙江工业大学环境学院

DOI号：10.1016/j.scitotenv.2022.154412

实验设计

结果与讨论

1 抗生素处理后水生细菌群落的多样性和组成

我们分析了来自两个高强度人类活动地点的微生物群落结构。暴露7天后，水体中无法检测到抗生素残留。以往研究表明，与对照组相比，水体暴露介质的物理化学性质在抗生素处理后仅有轻微变化。因此，我们忽略了水体理化性质的变化，直接探讨抗生素处理后微生态环境中细菌群落组成的变化。在有贴沙河(the Tiesha River)河水的微生态系统中，与对照组相比，5种抗生素(硝基咪唑类、喹诺酮类、林可霉素、氯霉素和氨基糖苷类)处理明显增加了细菌群落的丰富度(附图2a)，而β-内酰胺类、硝基咪唑、四环素和氨基糖苷类处理后细菌群落的Shannon指数明显增加(附图2b)。在有西湖湖水的微生态系统中，与对照组相比，β-内酰胺类、硝基咪唑类、四环素类和氨基糖苷类处理后细菌群落的丰富度显著增加(附图2d)，而7种抗生素(硝基咪唑类、β-内酰胺类、四环素类、喹诺酮类、大环内酯类、林可霉素和氨基糖苷类)处理明显增加了细菌群落的Shannon指数(附图2e)。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)表明，抗生素处理后，西湖和贴沙河的细菌群落组成发生了显著变化(附图2c和f；附表1)。总的来说，抗生素对西湖水建立的微生态系统的丰富度和Shannon指数的影响比对贴沙河水的影响更为显著(图1a)。在细菌门水平上，大环内酯类药物处理后，西湖中的Patescibacteria丰度略有增加(附图3a)，但在贴沙河中则有所下降(图S3c)。在属水平上，大环内酯类、四环素类和磺胺类抗生素处理后，西湖和贴沙河水中的Elstera明显减少(图1b)。我们的研究结果表明，经过抗生素处理后，两种水样的细菌群落多样性随群落组成的变化而增加。 为了阐明抗生素对水生微生物群落的影响，我们将河流和湖泊的数据结合，以排除环境因素的潜在影响。河流和湖泊的数据合并后分析表明，氨基糖苷类和β-内酰胺类抗生素处理后，微生态系统中细菌群落的Shannon指数和丰富度明显增加(图2a和b，p < 0.05)，但不受其他测试抗生素的明显影响。我们绘制维恩图确定了抗生素共享细菌，其中247个细菌属在对照组和抗生素处理组中都存在。然而，不同类型抗生素处理的细菌群落数量超过了对照组中的细菌群落数量(附图4)。多样性的增加可归因于这两种抗生素对特定水生微生物生长的刺激作用，并富集了一些耐药细菌，因为四环素在10 μg/L时增加了水生细菌群落生物膜中四环素耐药细菌的相对丰度。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)结果表明，抗生素处理后细菌群落的组成发生了明显变化(图2c，R2 = 0.06615，P < 0.001)。在科水平上，所有样本中丰富的细菌主要有：丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)和Methylophilaceae(图2d)。在β-内酰胺类(p < 0.05)、硝基咪唑类(p < 0.05)、四环素类(p < 0. 05)，以及磺胺类(p < 0.05)、林可霉素(p < 0.001)和氯霉素(p < 0.05)处理后，一些细菌科(如Azospirillaceae)的数量高于对照组，而在喹诺酮类药物处理后伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaceae)的相对丰度低于对照组(p < 0.05；图2d)。 水生微生物群落的组成取决于环境因素，包括生物和非生物因素。总体而言，抗生素处理极大地影响了细菌群落的组成。可能的原因是，在水生系统中添加抗生素对微生物群落施加了选择压力，具有耐药性的微生物能够生存下来，并通过物种间的相互作用进一步影响其他微生物。同时，不同种类的抗生素表现出菌株特异性的活性，抑制或不可逆地杀死微生物群落的特定成员，从而影响到群落的组成。 样品中抗生素抗性基因(ARGs)的丰度可以改变并解释抗生素对水生微生物群的影响。Zhang等人通过从不同生境(560个地点，4572个样本，包括水生生境)的公共宏基因组数据检测到2561个ARGs，这些ARGs共同赋予了对24类抗生素的耐药性，并证明在高强度的人类活动区域(如本研究中的两个采样点),ARGs的丰度很高。ARGs在抗生素处理后会积累耐药微生物，并抑制抗生素敏感菌的生长，从而改变微生物群落的结构。抗生素对微生物群落的影响机制应该在未来的ARGs研究中被解开，并解释使用抗生素后ARGs的传播。

图1 抗生素对西湖和贴沙河中微生物群落的多样性和分类的影响。(a) 丰富度和Shannon指数的增长率和(b)微生物群落细菌属(top 20)的变化(“other”指除前20个细菌属外的其余所有属)。*表示单因素方差分析的统计学显著差异(* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001)。

图2 抗生素对微生物群落的多样性和分类的影响。抗生素处理组和对照组中10个丰度最高的细菌科的(a) Shannon指数、(b)丰富度指数、(c)主坐标分析(PCoA)得分、(d)分类比较。*表示单因素方差分析中P<0.05的统计学显著差异。

2 抗生素处理改变细菌群落的功能

为了了解抗生素处理后水生细菌群落的功能谱，我们使用PICRUSt2软件预测16S rRNA序列的功能，然后从KEGG数据库对这些功能通路进行注释。在贴沙河和西湖中共检测到137条功能通路。在抗生素处理组和对照组之间，大多数功能通路是共存的(附图5)。然而，用不同种抗生素处理后，细菌的功能通路发生了明显的变化。例如，氨基糖苷类抗生素处理后，贴沙河有80种功能发生上调，57种功能发生了下调，而西湖微生物群落有75种功能发生上调，62种功能发生下调。我们的结果表明，贴沙河和西湖在抗生素处理微生物的功能上也存在差异(附图6)。在抗生素处理过程中，共有15类38条功能通路发生了变化，我们选择这些通路进一步分析(附表3，图3)。抗生素处理后，辅因子和维生素的代谢通路发生上调。这可能影响血红素的生物合成和NAD的生物合成，前者可能有利于光合色素的合成并提高光合效率，后者可以在环境胁迫下维持细胞功能。因此，辅因子和维生素代谢的上调可能是细菌应对抗生素压力的一个有效策略。外源物质的生物降解和代谢、碳水化合物代谢和氨基酸代谢(如甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸、组氨酸和酪氨酸的代谢)在抗生素处理后发生下调。这些代谢途径在复杂有机分子的降解、能量转换和蛋白质合成中发挥了重要作用，以控制生命过程。这些代谢途径的下调表明，在抗生素处理下，微生态环境中细菌的生长和增殖受到了抑制。本研究表明，与对照组相比，用β-内酰胺类(14)、硝基咪唑类(23)、大环内酯类(17)、林可霉素(17)和氨基糖苷类(13)处理后，有38条功能通路发生了显著变化(图3)。

图3 利用PICRUSt2软件和KEGG数据库分析抗生素对细菌功能通路的影响。相对表达值以每个转录本的Z-core按比例调整。*表示单因素方差分析中P<0.05的统计学显著差异。

3 开发将抗生素特性与细菌群落特征相关联的模型

抗生素处理影响了水生细菌群落的多样性和组成。但是目前未不清楚的问题是：主要是哪些抗生素特性在本研究中起到了决定性的作用？我们通过随机森林(RF)算法的机器学习建立了一个回归模型，将抗生素特性与微生物群落特征联系起来，揭示了抗生素特性对细菌群落结构以及多样性和相对丰度的影响(附图7)，该模型共收集了76种抗生素的物理化学特性作为自变量(附表1)。为了简化细菌群落的组成情况，我们利用共现网络根据物种的相互作用将整个细菌群落分为几个模块，并选择由细菌数量最多的三个模块进行细菌群落预测(图4a)。为了保证预测精度的可信度和适当的适配性，我们用十倍交叉验证来验证我们三个模型的预测结果(每个模型的平均R2在57%到78%之间)(图4b)。抗生素理化性质对三个模块的细菌群落变化的影响不同。在模块1中，脂肪水系数解释了抗生素处理下微生物群落变化的24.3%，而贡献第二和第三的性质分别是原子立体中心数(13.7%)和氢原子数(12.2%)。在模块2中，羟基和二甲氨基是最重要的因素，分别可以解释14.7%和14.8%的微生物差异，其次是原子立体中心数(12.7%)。在模块3中，氢原子数和二甲氨基是最重要的抗生素特征，可以解释15.8%和15.6%的微生物差异。抗生素理化性质对水生微生物群落的丰富度和Shannon指数的影响也不同。抗生素中的氢原子数是影响Shannon指数变化的最重要因素，占20.8%，其次是二甲氨基(12.6%)。影响微生物群落丰富度的因素中，抗生素溶解度是影响最大的因素，占数据差异的33.3%，其次是氢原子数(15.9%)。在影响抗生素共享细菌平均相对丰度的因素中，主要是氢原子数和二甲氨基(图3c)。 总体而言，抗生素的原子立体中心数、氢原子数和脂肪水系数是决定微生物群落变化的最重要因素(图3d)。值得注意的是，在许多单因素研究中，抗生素的类型和浓度是影响水生微生物群落的最重要因素。抗生素处理后，我们的模型明确了原子立体中心数、氢原子数和脂肪水系数三个理化特性是塑造微生物群落更重要的潜在因素，因为这些因素可以影响微生物群对药物的吸收。因此，在设计环保型抗生素时，最好减少这三个因素的数量。

图4 抗生素特性对微生物群落多样性和结构的影响。(a) 用抗生素处理的人工水体中微生物群落的生态网络模块化分类(在Gephi中，细菌根据相互作用被分为模块1、模块2和模块3)。(b)通过十倍交叉验证评估验证模型中的R2值。(c) 抗生素特性对水生微生物群落丰富度、Shannon指数、三个微生物模块的相对丰度和抗生素共享细菌的平均相对丰度的影响。(d)抗生素理化特性(选择贡献率top 30)对M1、M2、M3、丰富度、Shannon指数和抗生素共享细菌的贡献率。

4 开发将抗生素特性与细菌群落功能相关联的模型

为了弄清抗生素的特性对细菌群落功能的具体影响，我们用随机森林算法构建了抗生素理化特性之间的非线性回归模型。结果表明，六种主要功能(辅因子和维生素、脂质、折叠、分选和降解、碳水化合物和氨基酸代谢)在二级通路中所占比例最大。通过10倍交叉预测模型，发现R2值在66-69%之间，表明抗生素特性对细菌群落功能具有影响(附图8)。氢原子数是影响辅因子和维生素代谢、脂质代谢、折叠、分选和降解以及碳水化合物代谢变化的最重要因素(图5a)。在其他氨基酸代谢的变化中，分子量是抗生素处理下最重要的影响因素，解释19.7%的差异。分子量可能影响细菌蛋白质，如一些低分子量产物在蛋白质受体上具有效力和特异性。在抗生素处理后氨基酸代谢的变化中，硫原子数的贡献率最大，占17.5%。 通过建立机器学习模型，我们可以推断出氢原子数、分子量和复杂性对细菌功能有广谱作用(图5b)。如上所述，氢原子数也是影响水生微生物群落组成的一个重要因素。因此，在设计抗生素时，可以改变氢原子数，以减少抗生素对水生微生物功能的影响。

图5 根据KEGG数据库分析抗生素特性对细菌主要代谢(氨基酸、辅因子和维生素代谢、脂质代谢、折叠、分选和降解、碳水化合物代谢和氨基酸代谢)的影响。(a) 抗生素特性对水生细菌六个代谢途径的贡献率：其他氨基酸代谢、辅因子和维生素代谢、脂质代谢、折叠、分选和降解、碳水化合物代谢和氨基酸代谢。(b) 抗生素理化特性对水生细菌六种代谢的贡献率。

结论

综上所述，本研究表明，暴露于浓度为10 μg/L的50种抗生素对水生微生物群落的组成和功能有不同程度的影响，进而可能以不同的方式影响水生生态系统的稳定性。本研究发现，抗生素的特性(如原子立体中心数、氢原子数和脂肪水系数)对水生环境中微生物群落的组成具有重要影响。同时，氢原子数、抗生素分子量和复杂性也是影响细菌功能的关键因素。本研究开发了一个精确的预测模型，建立了抗生素特性、生物多样性和水生群落生态系统功能之间的具体联系，并可以指导抗生素分子的设计和优化，使环境风险降到最低。然而，本研究并未考虑抗生素浓度的影响，主要关注抗生素的理化特性。由于可以指导环境中合理使用抗生素浓度的影响，因此，弄清楚不同浓度梯度的各种抗生素对水体微生物群落的影响依然是一个有趣又有意义的课题。