弯曲菌的流行病学特征及临床微生物检验方法

作者：北京市密云区医院 刘畅  、 首都医科大学附属北京同仁医院 鲁辛辛

弯曲菌的生物学特征

PART  0 1

弯曲菌导致的人类疾病中90%由空肠弯曲菌（C. jejuni）引起，其余大部分归属结肠弯曲菌（C.coli）。

弯曲菌是一类革兰阴性、呈杆状，螺旋形，有单鞭毛或双鞭毛，大小约为0.2-0.8x0.5-5 μm的一类可培养细菌。当暴露于低温、氧气、酸等不利条件下，弯曲菌可保持存活，但处于不可培养（VBNC）状态 。与其他人畜共患病原体相比具有苛刻的生长要求。尽管弯曲菌对人类有致病性，但在许多食用动物的肠道中可无症状繁殖，因此，宿主因素可能是人类发病的重要原因。

弯曲菌的致病性

PART   0  2

人类弯曲菌感染主要引起急性、自限性肠炎，一般可持续5-7d。主要临床表现有腹痛、水样或血性腹泻、头痛、发热及寒战，大便中可见大量白细胞和红细胞。同时，弯曲菌可导致牙周病、颈部脓肿、菌血症、脓毒症、结肠癌、脑膜炎、反应性关节炎以及包括格林-巴利综合征等免疫性疾病。尽管弯曲菌是世界范围内食源性腹泻常见原因之一，但定植的确切分子机制、感染途径和发病机制尚未完全阐明。

（1）关于弯曲菌肠内定植和毒力的研究有鞭毛介导的运动、细菌对肠粘膜的粘附、侵袭能力和产生毒素的能力等[22]。重要的毒力决定因素包括 CadF（37-kDa 的纤连蛋白结合外膜蛋白），负责弯曲菌与纤连蛋白的粘附。FlpA 也是一种纤连蛋白结合蛋白，可与 CadF同时发挥作用。III 型蛋白质分泌系统 （T3SS）将毒力因子注入分泌到宿主细胞中，这种基于鞭毛的 T3SS 由 FlhA、FlhB、FliO、FliP、FliQ 和 FliR 组成。在从鞭毛分泌的各种因子中，有 FlaC、CiaC 和 CiaI，它们是定植、入侵和细胞内存活所必需的。最具特征的毒素是使细胞膨胀毒素，它由三个亚基CdtA、CdtB、CdtC组成，CtdA 和 CdtC 负责传递活性亚基 CdtB，它以脱氧核糖核酸酶的形式进入宿主细胞核，导致细胞周期停滞和死亡。

（2）关于肠外感染机制，有研究显示弯曲菌的脂寡糖（LOS）外层核心结构与人类神经节苷脂（GM）的结构相似，因此，针对 LOS 结构表位产生的抗体不仅与弯曲菌 LOS 结构结合，而且还与GM结合，导致神经细胞的免疫损伤而发生格林-巴利综合征。

弯曲菌的流行病学特征

PART  0 3

在全球范围内，弯曲菌病的发病率因国家和地区不同而出现较大差异，其真实发病率在很大程度上是未知的，特别是在发展中国家。

在低收入和中等收入国家，由于缺乏完善的食源性疾病监测体系、对弯曲菌腹泻认识不足以及弯曲菌特殊的检测方法所限，弯曲菌的流行情况基本缺失。印度东北部2014-2016年间的一项研究发现，因腹泻住院的 5 岁以下儿童中，弯曲菌总检出率为10.1%，其中空肠弯曲菌占80.5%。孟加拉国一家医院2019年6月至2020年6月间住院腹泻患者中，弯曲菌的总检出率为 31.5%，其中包括空肠弯曲菌占69.2%，结肠弯曲菌占30.8%。中国仅部分地区开展了弯曲菌监测，且检出率差异较大。本实验室数据显示北京地区2018-2019年PCR阳性率为8.1%(168/2 062)，qPCR 阳性标本进行双孔滤膜培养法培养，阳性率为 61.9%。  

弯曲菌的耐药性

PART  0 4

虽然大多数弯曲菌腹泻为自限性，无需抗菌药物治疗，但在高烧、血便、症状持续超过1w、妊娠、感染HIV和其他免疫功能低下时应予抗生素治疗。弯曲菌已形成了多种耐药机制，特别是喹诺酮类药物。

鉴于此，WHO于2017年将耐氟喹诺酮弯曲菌列入全球高度优先开发新抗生素疗法的清单。虽然大环内酯类抗生素是目前治疗人类感染弯曲菌的首选，但孟加拉国最近的一项研究表明，空肠弯曲菌对红霉素的耐药率已达45.8%，结肠弯曲菌的耐药率高达62.5%。中国北京2017-2018年数据显示空肠弯曲菌对红霉素的耐药率为9%，结肠弯曲菌对红霉素的耐药率高达44.4%。本实验室研究数据显示，北京地区2018-2019年空肠弯曲菌和结肠弯曲菌对环丙沙星耐药率达 94.0%和 100.0%，对红霉素敏感率为 94.0%和66.7%。

弯曲菌的耐药机制

PART  0 5

关于弯曲菌耐药机制的一些研究显示，大环内酯类通过与核糖体结合并改变其构象来抑制蛋白质合成。最常见的耐药机制是 23S rRNA 突变和通过erm(B)基因甲基化修饰靶位点。氟喹诺酮类药物的结合靶点是 DNA 促旋酶，以抑制 DNA 合成而使细菌死亡。耐药是因喹诺酮结合靶位点被修饰，即形成促旋酶 A ( gyrA ) 喹诺酮耐药决定区，这是氟喹诺酮类药物在弯曲菌中的主要耐药机制。弯曲杆菌对四环素的耐药性为中度至高度，通常由tet(O)基因介导，该基因常见于 pTet 质粒上，但也存在于基因组岛上。β-内酰胺类抗生素通过与青霉素结合蛋白结合，并在细胞壁合成过程中破坏肽聚糖交联而发挥作用。通过 β-内酰胺酶 blaOXA-61 产生的耐药性在空肠弯曲菌和结肠弯曲菌中广泛存在。弯曲菌的多药外排泵 CmeABC 可协同对 β-内酰胺类以及四环素类、大环内酯类和氟喹诺酮类的耐药。

实验室检查方法 PART  0 6

弯曲菌的实验室诊断没有明确的“金标准”，目前包含两大类，即培养法和不依赖培养的检测方法:

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培养方法

弯曲菌生长缓慢，有正常粪便菌群存在的情况下很难分离。传统培养法是先将便标本进行增菌，然后转种于选择性培养基上，在42 °C的微需氧环境中孵育48-72h。临床常用的选择性培养基有：改良炭头孢哌酮 脱氧胆酸盐琼脂（modified cefoperazone charcoal deoxycholate agar, mCCDA）、Campy-Line琼脂、Karmali琼脂、木炭选择性培养基（charcoal selective medium , CSM）和头孢哌酮，万古霉素，两性霉素B（Campy cefoperazone, vancomycin, amphotericin B, CVA）琼脂等。培养基之间的主要区别是抑制杂菌的抗生素类型和浓度不同。膜过滤培养法已证明可提高弯曲菌检出率，但是这种方法并没有得到广泛应用。但由于存活但不可培养（VBNC）状态细菌的存在，以及肠杆菌科其他细菌的耐药性严重，弯曲菌极易被漏检，造成假阴性结果。菌落鉴定简单快速的方法是MALDI-TOF 质谱。鉴定明确菌落可通过MH血平板置CO2培养箱48h进行AST（抗菌药物敏感试验），判断标准采用CLSI M45。KB纸片法的药敏结果对临床有良好的指导作用。

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不依赖培养的检验方法

不依赖培养的检验方法（culture-independent diagnostic tests, CIDT）主要包括粪便抗原和PCR核酸检测。虽然抗原法使用方便，但特异性和阳性预测值变化较大，临床对粪便弯曲菌抗原检测的价值仍存在争议。

PCR检测则显示出更高的灵敏性和特异性，尤其是实时荧光多重定量PCR（mPCR）。专家建议将PCR 做为首选方法。弯曲菌早期核酸检测的目标是 16S rRNA 基因可变区，可区分空肠弯曲菌、结肠弯曲菌和拉里弯曲菌。近年开发了针对其他基因的qPCR方法，如编码鞭毛蛋白（flaA/flaB）、热休克蛋白（hsp60 ）、马尿酸酶 （hipO ）、致死细胞膨胀毒素（cdt ）和硝酸还原酶（nap）的基因。为鉴别细菌是否具有活性，开发了预富集回收活细胞、靶向 RNA 以及化学法（单叠氮化乙锭和单叠氮化丙锭等化合物）穿透死细胞膜联合DNA检测等。ddPCR具有更好细菌拷贝数定量和敏感性。

基于序列的分型方法，包括多位点序列分型 （MLST）、DNA 微阵列和全基因测序序，提高了对弯曲菌流行株遗传进化及致病性的认识。

结论与观点 PART  0 7

临床实验室应建立合理的检测流程，使用快速、低成本的检测方法是保障弯曲菌检测、监测及追踪溯源的有效途径。

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题图 | veer.com

排版 | 张宁

审校 | 方研

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