Moderna最新论文：工程改造RNA聚合酶，纯化mRNA生产，减少免疫刺激副产物

撰文丨王聪 编辑丨王多鱼 排版丨水成文 

 mRNA疗法 是一种新兴的药物，与大分子生物制剂和小分子药物相比有一些优势。 从制造业的角度来 看，mRNA疗法的一个关键的优势是可以使用 单一的标准化生产工艺，适用于一系列靶点。 为了确保重复或长期给药的治疗应用过程中mRNA的高纯度，需要几个高成本和耗时的纯化步骤。 这些额外的操作步骤常常导致RNA降解增加、质量下降和/或产量下降，因此，我们需要一个更有效的mRNA合成过程，以减少下游纯化步骤的负担。 

2022年11月10日，Moderna公司的研究人员在 Nature Biotechnology 期刊发表了 题为： An engineered T7 RNA polymerase that produces mRNA free of immunostimulatory byproducts 的研究论文。 

研究团队通过理性设计开发了一种T7 RNA聚合酶的双突变体，与野生型T7 RNA聚合酶相比，突变体可以简化体外转录 （IVT） 的mRNA生产过程，在不降低产量的情况下， 提高mRNA产物纯度，显著减少免疫刺激性副产物双链RNA （dsRNA） 的产生，还具有更快的生产时间。 这一 发现为简化治疗性mRNA生产过程的开发、 提高成本效益、 生产具有临床或商业用途的 基于mRNA的 产品打开了大门。

体外转录 （IVT） 是一种用于合成mRNA产物的酶促过程。在IVT过程中，RNA聚合酶 （RNAP） 负责从DNA模板转录RNA。 尽管IVT在 研究实验室中是一个公认的过程，但工业规模生产的优化只是最近才开始。 体外转录（IVT）最常用的聚合酶是T7 RNA聚合酶 ，分子量约99kDa。由于其高产率和转录本的高保真度，很适合体外RNA的生产，因此在科研和商业化开发中得到了普遍应用。 

然而，T7RNA聚合酶也会产生多种副产物，包括从模板转录产生的免疫刺激性副产物双链RNA （dsRNAs） ，这些可能会影响药效和安全性，特别是在治疗应用中。 在体外转录（IVT）过程中双链RNA（dsRNAs）和其他副产物的产生受催化循环中T7 RNA聚合酶构象的影响。

T7 RNA聚合酶介导的转录包括三个不同的阶段：起始、延伸和终止。在启示过程中，T7 RNA聚合酶的N端结构域 （NTD） 与启动子序列结合，形成起始复合体 （IC） 。这种起始复合物是不稳定的，会产生短RNA转录本 （长度为2-10个核苷酸） 。转录本长度大于~10个核苷酸时，NTD中的启动子结合残基重新排列，释放DNA启动子区域，形成一个稳定的、过程性的酶延伸复合体 （EC） 。 终止则发生在对 特定 信号序列的响应或到 达线性化DNA模板末端时，这个过程被称为“ 失控转录 ”，通常会产生全长RNA，但有时会在其3'端产生非模板的附加物。 此外，T7 RNA聚合酶还具有以RNA为模板的转录能力，从而形成双链RNA（dsRNAs）产物和回环dsRNA产物。

这种3'端的异质性和回环dsRNA形成的背后的确切机制尚不清楚。因此，设计合理的方法来防止这两种行为都具有挑战性。 双链RNA（dsRNAs）分子是先天免疫反应激活因子，能够被 RIG-I、 MDA5 和LGP2等识别，从而触发机体的天然免疫反应。因此，这些 dsRNA分子会影响mRNA产物的效力和安全性，需要额外的纯化步骤从最终的mRNA产物中去除dsRNA。 

在生产过程中通常使用两种方法来减少mRNA产物中的dsRNA，一种是 用色谱法纯化mRNA产物，例如反相高效液相色谱法 （RP-HPLC） 或基于纤维素的dsRNA分离；二是优化体外转录（IVT）条件以减少副产物的形成。 修改体外转录（IVT）条件可以有效地减少dsRNA负担，但还不足以消除通过反相高效液相色谱法（RP-HPLC）对mRNA产物进行下游纯化的需要， 而RP-HPLC一 个昂贵且耗时的步骤。 在这项研究中，研究团队报道了一种双突变T7 RNA聚合酶 （G47A+884G） ，它可以显著减少体外转录 （IVT） 中的dsRNA副产物，同时保持mRNA的产量和纯度，从而减少下游纯化过程中控制转录相关dsRNA副产物的负担。

总的来说，这项研究表明，通过修饰T7 RNA聚合酶可以减少免疫刺激性副产物的形成。这一发现为简化治疗性mRNA生产过程的开发、提高成本效益、生产具有临床或商业用途的基于mRNA的产品打开了大门。 

该论文的通讯作者为Moderna公司的Amy Rabideau，第一作者为Athanasios Dousis（目前已加入Tessera）、Kanchana Ravichandran。