拉曼化学成像识别结石成分

Castiglione V, Sacré PY, Cavalier E, Hubert P, Gadisseur R, Ziemons E. Raman chemical imaging, a new tool in kidney stone structure analysis: Case-study and comparison to Fourier Transform Infrared spectroscopy. PLoS One. 2018 Aug 3;13(8):e0201460. doi: 10.1371/journal.pone.0201460. PMID: 30075002; PMCID: PMC6075768.

背景和目标

除结石成分外，肾结石的结构还可能提供临床信息。拉曼化学成像是一种用于生成样品中成分分布的二维图的技术。我们旨在确定拉曼化学成像在尿结石分析中的应用。

材料与方法

使用共焦拉曼显微分光光度计通过拉曼化学成像分析十四个结石。根据它们的异质组成和形态选择它们。对结石的整个切片进行拉曼化学成像。一旦获得，数据将通过 MCR-ALS 进行基线校正和分析。然后将结果与通过傅里叶变换红外光谱获得的光谱进行比较。

结果

拉曼化学成像成功地识别了每个样品的几乎所有化学成分，包括一水和二水草酸钙、无水和二水尿酸、磷灰石、鸟粪石、透磷石，以及白磷灰石、尿酸铵和药物等稀有化学物质。然而，由于巨大的自发荧光背景和这些不良拉曼散射体的浓度很小，无法检测到蛋白质。即使碳磷灰石和草酸钙占整个结石的比例不到 5%，也能正确检测到它们。此外，拉曼化学成像提供了结石内成分的分布：准确识别了细胞核以及其他成分的薄层。在一个样品的中心正确观察到二水合物草酸钙向一水合物草酸钙的转化。

结论

与红外光谱相比，拉曼化学成像在识别肾结石成分方面表现出良好的准确性。该分析还有助于确定结石内成分的组织，这有助于定位少量成分，例如细胞核。然而，这种分析非常耗时，使其更适合于研究而不是常规分析。 去：

介绍

尿石症是发达国家的一种传播疾病，在 1994 年至 2010 年间，患病率从 5% 上升到 8% [ 1 , 2 ]。此外， 5年时的复发率接近 30%，胱氨酸或透钙石结石形成者的复发率更高 [ 3-5 ]。此外，并发症和高度活跃的遗传性尿石症可导致慢性肾病 [ 6 ]。因此，对这些患者的泌尿外科和预防性管理导致卫生保健系统的巨大成本。此外，结石形成剂治疗的建议高度依赖于结石成分和生物学评估 [ 7]。总体而言，饮食、病理甚至药物等后天因素，以及性别、年龄、泌尿系统畸形和遗传等遗传因素，都与不同的结石成分有关 [ 8 , 9 ]。此外，在某些特异性和急性肾结石，如胱氨酸尿症和腺嘌呤磷酸核糖转移酶缺乏症中，结石分析通常是最快、最可靠的诊断方法 [ 10 , 11 ]。这就是为什么对每个复发性结石形成者都必须进行结石分析的原因 [ 12 , 13 ]。 多年来，湿化学分析已被放弃，因为已经开发了许多有价值的方法来确定石头成分。傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 和粉末 X 射线衍射被认为是金标准 [ 14 ]。自 1983 年以来，另一种振动分析方法拉曼光谱已在尿石症测定中进行了测试 [ 15 , 16 ]。值得注意的是，Daudon 等人已经评估了大范围的石头化合物 [ 16 ]。因为，有几项研究使用拉曼光谱来分析尿路结石 [ 17 – 25]。它已被证明是鉴别人体肾结石各种化学成分的适当方法，并且大多数这些论文都认为拉曼光谱与 FTIR 分析具有互补性或可比性。尽管如此，其他一些不常见的化学物质，主要是药物，还没有经过测试。此外，在大多数这些研究中，甚至最近的研究中，拉曼光谱仅用作 FTIR 的替代方法，用于小样本集 [ 20 – 22 , 24 , 25]。这些研究使用了破坏性途径，而没有提供有关样品的任何结构信息。然而，化学成分并不是分析肾结石时要考虑的唯一特征。结石的结构以及某些特定元素的存在，如兰德尔斑块，也提供了有关结石形成和相关疾病的信息 [ 26 – 28 ]。大多数时候，结石由不止一种元素组成，不同化学元素的定位也为石头“历史”提供了线索[ 29、30 ]。 拉曼显微镜已在其他人类生物样本中得到广泛测试，特别是在癌症诊断中，其中组织学分类对于诊断和治疗是强制性的 [ 31 , 32 ]。一些研究将化学和生物学信息与形态学和分布参数相结合，以便以高精度正确识别肿瘤或亚细胞有机体，有时甚至优于经典组织学 [ 31 ]。 拉曼从未测试过尿石症的绘图，这就是为什么我们打算使用拉曼化学成像 (RCI) 来进行结石结构分析。拉曼光谱与显微镜的结合使获得样品中成分的分布图及其光谱成为可能，从而实现其化学表征。这提供了结石内成分的定位，因为它已用于肿瘤绘图或药物制剂控制 [ 33 , 34 ]。因此，RCI 应提供有关岩石形成的临床相关信息。我们试图评估这种方法在混合成分结石的高级或常规分析中的效用。

组件识别

我们在本文中报告说，RCI 是一种用于肾结石分析的相关方法。我们在这项研究中测试了大量的肾结石成分。RCI 正确鉴定了以下成分：COM、COD、无水尿酸、尿酸二水合物、尿酸铵、磷灰石、磷酸铵镁、透钙磷石和白磷灰石。这些发现与其他先前使用传统拉曼光谱的报告一致 [ 17 , 25 ]。拉曼光谱已经描述了常见化合物的主要拉曼振动带，但没有提供样品映射 [ 16 , 17 , 20]。这些化合物在肾结石中最常见，但其他成分，即使它们不太常见，对结石形成者的管理也很重要 [ 8 ]。此外，胱氨酸、黄嘌呤和 2,8-二羟基腺嘌呤这三种出现在某些遗传性疾病中的尿石症，也已通过拉曼光谱鉴定 [ 17 , 23 ]。必须不要错过这些化合物，因为它们与需要特殊治疗的非常罕见但危及生命的疾病有关 [ 10 ]。 经常在接受治疗的患者尿液中发现的药物晶体也容易形成肾结石。鉴定石头中的药物或其代谢物会直接导致具体建议（水合作用甚至停止药物摄入）。虽然 Hong等人报告了氨苯蝶啶石样本，但据我们所知，自拉曼振动法以来，没有其他药物结石被分析过 [ 17]。我们未能测量样品 13 中的氨苯蝶啶及其代谢物，可能是因为它存在于石头表面的痕迹中，并且因为它太易碎而无法抵抗研磨过程。然而，RCI 设法在另外两个样本中定位了 N-乙酰磺胺甲恶唑和阿扎那韦层，而据我们所知，这些化合物尚未在尿结石中描述。拉曼光谱已广泛用于药物质量控制，因此，广泛的药物光谱数据库可用于评估 [ 40]。然而，结石也可能含有药物代谢物，就像我们用 N-乙酰磺胺甲恶唑和氨苯蝶啶的硫酸盐和羟基缀合物展示的那样。这些代谢物的光谱可能无法在数据库中获得。在其他研究中，拉曼显微光谱成功地提供了阿霉素或厄洛替尼等药物的细胞分布 [ 41 , 42 ]。其他研究表明，还可以评估组织内药物的鉴定 [ 43 ]。例如，在 20 毫米厚的猪骨内评估双膦酸盐测量，这是一种类似于肾结石的基质 [ 44 ]。 在我们的样品（样品 2、7、9 和 11）中无法检测到蛋白质和糖胺聚糖，即使是大量的，因为这些较差的拉曼散射体具有巨大的自发荧光背景。蛋白质总是存在于尿结石中，但通常是微量的。当它们的比例较高时，它们可能与尿路感染、尿路上皮或肾小球损伤有关。这在感染性和药物性结石的情况下尤其具有挑战性，这些结石通常含有高有机基质 [ 45 ]。 拉曼光谱分析也被用于区分药物工业中晶体的多晶型 [ 40 ]。晶体的多态性对于区分 COM 和 COD、无水尿酸和尿酸二水合物或不同磷酸钙之间的结石很重要。例如，与无水尿酸相比，尿酸肾结石的二水合物多晶型物与较低的复发率和较高的 BMI 有关 [ 46 ]。在我们的研究中，RCI 能够将所有这些多晶型物彼此区分开来。 通过 RCI 对成分进行量化是可行的，即使在本研究中没有进行。例如，可以使用准确的量化来计算磷灰石与草酸钙的比率，以筛查甲状旁腺功能亢进症患者 [ 47 ]。然而，量化仍然是一个问题，尤其是当通过具有库比较的软件执行自动分析时 [ 17 ]。拉曼和 FTIR 光谱提供整个样品的光谱，可以通过软件进行分析 [ 48]。然而，该库将其与最佳命中进行比较，并识别最多三个组件的组合。RCI 提高了感兴趣的小元素的检测率。2013 年，Miernik 等人开发了一种自制的拉曼装置，用于分析新鲜提取的肾结石 [ 23]。它用于在表面上的 6 个随机点处分析样品，无需准备（也无需切片或干燥）。该方法显示出良好的灵敏度和特异性，但由于随机靶向，可能无法检测到低于 25% 的成分。然而，我们认为这对于质量宝石分析来说不够准确。实际上，必须不要错过一些与特定和严重情况相关的成分，即使它们是少量的，例如赖氨酸-胱氨酸尿症和产生脲酶的尿路感染中的胱氨酸或鸟粪石。我们展示了分辨率为 50μm 的 RCI 能够区分单个样品中多达 4 种不同的成分，这在我们选择的高度复杂的宝石中特别有用。此外，

结石结构和形态

除了结石成分，RCI 还提供了样品中成分分布的精确映射。原子核以及其他成分的薄层被准确定位。石头的形态和不同层的连续性可以可靠地告知石头形成的“历史”。大多数人类尿路结石是异质的，由至少 2 种不同的元素组成 [ 48 – 50 ]。肾结石具有多种形态，其部分内的成分分布高度可变且复杂 [ 51]。表面、内层和核心之间的成分可能会有很大差异，尤其是对于草酸钙和磷酸钙结石。磷酸钙更多地存在于结石的核心而不是外层。因此，与外部和较新的层相比，石核可能与不同的尿液饱和风险相关。肾结石患者的治疗应考虑到这一点。 不同的成分与不同的尿液生化扰动和不同的病理有关。COD 结石主要与高钙尿症有关 [ 18 , 52 ]。COD 与磷灰石的混合结石与高钙尿症有关，而不是纯磷灰石结石中的低柠檬酸尿症 [ 52 ]。带有磷灰石核心的草酸钙结石可能是由尿路感染引起的 [ 50 ]。Daudon 团队对石头结构进行了广泛的研究，并将其与特定条件联系起来 [ 53 , 54 ]。甲状旁腺功能亢进更常见于具有特定形态的结石，称为 IVd 或 II/IVa1 [ 47]。这些石头由透钙石或 COD 和磷灰石层制成。有关结石形态分类的更多详细信息，请参阅 Daudon 等[ 54 ]。一些附着在肾乳头上的 COM 结石表面出现小于 0.5 毫米的非常小的磷灰石斑点，称为 Randall 斑块 [ 28 ]。这些患者可能已经改变了与肾脏炎症和氧化应激相关的基因表达 [ 55 ]。检测特殊结构很重要，尽管它们仅代表样本的一小部分，因为它们可能与临床相关。 所有这些元素都是对整合组件定位的石头进行准确和精确分析的论据。 在我们的研究中，石头 9 的核心是由白磷灰石构成，周围是磷灰石，最后涂有磷灰石（图2）。我们假设尿液成分发生了变化，导致这些不同相的沉淀。结石的核心可能与导致磷酸钙沉淀的古代复发性尿路感染有关。相反，我们假设透钙石和 COD 外部晶体在取石时与高钙尿症有关。如果尿路感染的其他症状已经停止，这种结石形成者的治疗应遵循钙结石建议（包括甲状旁腺功能亢进筛查）而不是抗生素治疗。 从样本 12 中可以看出（图 3），COM根据其在石头中的定位呈现不同的光谱。吸光度峰的强度在石头部分是可变的。经过光谱的数学解析，一些COM点在1487cm -1处有一个主吸收峰（图 3A), 等1462cm -1 (图 3B）。草酸钙光谱的这种变化与结石结构有关。两种类型的 COM 光谱以来自石核的径向线排列。在大多数情况下，COM 结石的截面具有放射状结构，可以用显微镜或扫描电子显微镜观察到 [ 52 , 56 ]。相比之下，有人怀疑某些 COM 结石中缺乏放射状组织可能与 COD 多形性转变有关，或者当结石颜色也非常清晰时，可能与原发性高草酸尿症有关 [ 56 , 57 ]。根据 Daudon 的说法，Ic 型（无组织，浅色）的 COM 结石的复发率高达 82%，而 Ia 型（放射状和较暗）的复发率较低，为 34%。58 ]。RCI 提供了一种最简单、更标准化的方法来检测 COM 的径向组织，并且可以减少观察者间的变异性。 我们在样品 3 中表明，外部的、最近的、尖锐的晶体由 COD 组成，而石头的较旧部分，即中心，由 COM 组成（图。1）。我们假设随着时间的推移，尿潴留可能导致 COD 晶体转化为 COM，这是最稳定的热力学形式 [ 59 ]。此外，根据光谱，与样品 12 相反，COM 没有径向组织。这也表明 COM 没有像往常一样增长，而是 COD 转换的结果。事实上，已经表明草酸钙结石的结构可以可靠地与其成分相关联。Duan 等人表明，使用计算机断层扫描可以根据形状准确区分 COM 结石和 COD 结石 [ 60]。他们根据断层扫描结果开发了一种形状指数的自动计算方法，该结果显示 COD 结石中的曲线更多。该指数可用于评估结石对冲击波碎石治疗的反应。COM 和 COD 出现在不同的尿液饱和度条件下。虽然 COM 优先在高草酸尿中产生，但当尿中草酸盐与钙的比例降低时，COD 会沉淀 [ 61 , 62 ]。此外，COD 结石形成者通常更年轻，并且结石复发的风险增加 [ 63 , 64 ]。这些考虑对于涉及钙摄入以及抗冲击波碎石术的治疗很重要 [ 60]。该样品中磷灰石的内部沉积物可能与高钙尿症和低柠檬酸尿症的尿液成分变化有关，而不是如上所述的尿路感染。Blanco 等人还提出，在 COD 晶体形成后，尿液可以在 COD 晶体之间流动，磷灰石随后会因尿淤滞而沉淀 [ 65 ]。所有这些考虑都意味着对患者的不同治疗和随访。 此外，良好的 RCI 分辨率（低于 2-3 μm）提高了灵敏度，并允许检测极小的元素，如核和兰德尔斑块，这些元素很难通过 FTIR 或 X 射线衍射分析来识别。兰德尔斑块是出现在肾乳头上的磷灰石小点，可作为结石生长的成核因子。它们越来越多地出现在 COM 宝石的顶部 [ 26 ]。此外，它们必须与尿液 pH 值较高时简单沉淀的随机磷灰石沉积物区分开来。在这两种情况下，FTIR 或 X 射线衍射分析将提供低磷灰石百分比，而 RCI 可以通过它们的定位来区分它们。

与其他方法的比较

在本研究中，我们比较了肾结石分析中的 RCI 和 FTIR 光谱。FTIR 是金标准方法，粉末 X 射线衍射也证明了在结石测定中的性能，但使用较少 [ 30 , 35 , 66 ]。两者都有很好的石材分析记录，但与 RCI 相比，它们没有提供任何结构信息。在将拉曼光谱与 FTIR 进行比较的几项研究中，对样品的分析表明，某些成分只能通过两种方法中的一种来识别 [ 23 ]。拉曼光谱在成分识别方面几乎与 FTIR 相同，在某些情况下甚至可能更有效 [ 25 ]。 还开发了更复杂的方法，例如 microCT 扫描和电子扫描显微镜来收集广泛的结构信息。但是，它们目前专门用于学习目的，因为它们特别昂贵且耗时。此外，它们在区分一些相似成分方面不够具体 [ 14 , 24 , 67 ]]。这些方法在形态测定方面比 RCI 更准确，但在成分测定方面不太精确。总之，所有技术都存在缺点，因此应结合使用以避免信息丢失并获得对成岩途径中涉及的代谢风险因素的最佳理解。与其他方法相比，RCI 将振动技术与非常不同的面向结构的分析很好地结合起来 [ 14 , 68 ]。单个样品的分析时间从 10 到 36 小时不等。对于临床实验室来说非常耗时，并且使其更适合于研究而不是常规分析。RCI 是非破坏性的，可以存储样本。 拉曼光谱测量振动和旋转分子的散射，而 FTIR 显微镜评估这些分子的吸收。两种方法相似且互补，但在光谱和成像分辨率方面各有优缺点。拉曼几乎不需要样品制备，并且不受水或尿素的阻碍，这在尿石症分析中很有用 [ 17 , 23 , 69 , 70 ]。此外，与 FTIR 显微镜相比，拉曼光谱具有更好的空间分辨率，而不是更低的光谱分辨率和更长的分析时间，这一点被普遍接受 [ 31 , 69 – 72]。此外，拉曼光源可能具有破坏性，特别是对于蛋白质等较差的拉曼散射体。 Daudon 等人使用与 MOLE（激光分子微声）相关的拉曼光谱，可以分析 1 或 2μm 的非常小的晶体 [ 16 ]。最近，Shameem 等人在尿路结石调查中评估了与 LIBS（激光诱导击穿光谱）相关的显微拉曼显微镜 [ 51 ]。这些方法是互补的，可以提供高分辨率的样品分子和元素数据。LIBS-Raman 要求样品切片在相对较大的区域内具有物理均匀性 [ 51]。此外，仅靠拉曼无法识别所有样品，结果也无法通过 FTIR 金标准方法得到证实。与市场上现有的拉曼显微镜相比，MOLE 和 LIBS 都是昂贵且不易获得的方法。再一次，这些论文中没有提供元素分布。Tang 等人最近使用 1μm 分辨率的 RCI 设备对分枝杆菌进行了表征 [ 69 ]。RCI 的高分辨率使这种方法甚至可以提供药物在细胞器官中的细胞分布图 [ 41 , 42 ]。 Krafft 等人在结肠组织上测试了拉曼和 FTIR 成像 [ 71 ]。以 2.5 μm 的步长执行 RCI。作者证实，与 FTIR 显微镜相比，RCI 具有更好的空间和光谱分辨率，但光谱质量较低，分析时间较长。值得注意的是，一些论文还使用 FTIR 显微镜来测量肾脏内的微晶。Daudon 等人确定了肾组织中的磷酸钙和草酸钙晶体沉积 [ 73]。Crystal's plug 在 50μm 左右测量，在 4μm 切片的组织中检测到，分辨率为 6.25μm。这些药物沉积物比我们在样本中检测到的要小。在样品 12 中测得 N-乙酰磺胺甲恶唑层的厚度约为 100μm。同样，在一份病例报告中，作者使用红外显微镜来识别急性肾功能衰竭患者肾脏内的小万古霉素沉积物（100-900nm）[ 74 ]。最后，更值得注意的是，Blanco 等人最近在尿路结石上测试了红外显微镜，并设法获得了 80 微米的分辨率，提供了结石成分的准确映射 [ 65]。在一个样本中，他们确定了从核心到表面的多达 5 个具有不同光谱的不同区域。FTIR 成像分辨率受限于接近 25μm 的衍射[ 72 ]。通过与同步加速器、原子力显微镜或 ATR 等其他技术结合使用，可以提高分辨率。使用带有同步加速器源的 FTIR 显微镜可以获得 10μm 的分辨率，用于使用金属涂层玻璃进行肾活检中的晶体沉积 [ 70]。显然，这种样品制备方法不适用于几毫米大小且无法在 μm 范围切片的肾结石样品。尽管如此，拉曼显微光谱具有更好的成像分辨率，可以识别如上所述的细胞和有机物，但速度较慢，这使得红外显微镜成为一种很有前途的方法 [ 31 , 41 , 42 ]。

研究偏差

这项研究的主要偏差是我们没有通过 RCI 对成分进行量化。也可以通过 FTIR 分析高度区分碳酸磷灰石和弱碳酸磷灰石。Daudon 等人还使用拉曼微探针 [ 16 ] 评估了这些参数。尽管 RCI 对尿路感染筛查很有意义，但在本研究中并未记录到这种差异 [ 75]。那么，这两种方法都无法对样品进行全面分析，并且该方法需要选择同一块石头的不同样品碎片。RCI 不是一种破坏性方法，但用于分析的胶水会损害 FTIR 测量。尽管我们使用 RCI 测量了最常见的宝石成分，但我们只评估了一小部分样本。不幸的是，我们没有 FTIR 显微镜，我们无法直接将其与 RCI 进行比较。

观点

除肾结石外，其他人类生物样本也已通过拉曼分析进行了评估。RCI 已在癌症诊断中得到广泛测试 [ 31 ]。实际上，癌症的组织学分类在诊断和治疗中是强制性的 [ 32 , 76 ]。因此，RCI 可以提供对癌症管理有用的肿瘤组织图谱。拉曼显微镜能够区分正常组织与宫颈组织中的低级别或高级别鳞状上皮内病变 [ 33]。在 Rashid 等人的研究中，RCI 还发现了具有生化异常的组织层，尽管使用了 100μm 的相当低的空间分辨率，但在光子显微镜上并未发现这些异常。RCI 甚至已在脑外科手术中用于区分肿瘤浸润组织和非浸润组织 [ 77 ]。该方法与组织学结果高度相关，灵敏度分别为93%和91%，分辨率为300～25μm。一些研究将化学和生物信息与形态学和分布参数相结合，能够以高精度正确识别肿瘤或亚细胞有机体，有时甚至优于经典组织学 [ 31 ]。 考虑到尿石症测量在实验室之间存在很大差异，并且依赖于分析人员 [ 35 ]，因此此类方法应适用于结石评估，以减少操作人员的可变性并提供高质量的分析。事实上，正如对尿结石分析的两次质量评估所证明的那样，缺乏识别有趣元素的教育是一个主要问题，特别是对于破坏性方法 [ 35 , 66 ]。自动化软件分析和计算机辅助诊断的发展应减少观察者间和实验室间的变异性 [ 31 , 69 ]。 在经典拉曼光谱中可以对湿样品进行分析 [ 78 ]，但可能是 RCI 的限制，因为切片不规则。当切片面不够光滑时，孔隙会发出较弱的信号。这也是一些太易碎的化学物质的问题，如磷灰石、MAP 和蛋白质。这个步骤可以通过 3D 映射设备来克服，该设备允许保持对弯曲或粗糙表面的关注，而无需进一步的样品制备 [ 79 , 80 ]。此外，它可以很容易地提供有关晶体几何形状或表面的信息，因为它已显示在骨骼或软骨以及岩石上。然而，在我们的研究中，拓扑分析的用途有限，因为样品是根据我们的协议进行研磨的。 去：

结论

这是第一次使用拉曼化学成像来生成肾结石的二维图。我们发现，与 FTIR 金标准分析相比，RCI 是一种识别肾结石成分的有效工具。此外，RCI 提供了有用的成分分布图，可以更好地检测细胞核和药物层等小结构，从而提高灵敏度。RCI 允许检测 COD 向 COM 的转化，以及 COM 结石的径向结构。这种分析是半破坏性的，但很耗时。该分析是 FTIR 和其他先进技术（如 micro-CTscan）之间的良好折衷，但可能会被红外显微镜超越。蛋白质测量仍然是一个我们未能克服的问题，并且在质量评估中可能很麻烦。

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