杨乃彬医生团队解读：XBP1在调控NASH进展中的作用

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近日，南京医科大学吕凌教授团队在肝病领域TOP期刊Journal of Hepatology (2022最新IF= 30.083, JCR及中科院分区双一区杂志)非酒精性脂肪性肝病和酒精性肝病专栏发表研究文章，题为“Role of XBP1 in regulating the progression of nonalcoholic steatohepatitis”，主要研究XBP1在调控NASH进展中的作用。“顶刊之声”第三期，杨乃彬医生团队特对这项研究进行摘译解读。

文章摘要

研究背景和目的

NASH与脂质代谢紊乱和肝脏炎症有关，机制仍不清楚。本研究聚焦XBP1(X-box binding protein-1，X-盒结合蛋白1)在NASH进展中发挥的作用。

方法

首先使用NASH患者及正常对照组患者肝组织评估XBP1蛋白表达水平。然后使用肝细胞特异敲除XBP1小鼠、巨噬细胞特异性敲除XBP1小鼠、巨噬细胞特异性敲除NLRP3小鼠、野生型小鼠，通过高脂饮食26周或缺乏蛋氨酸和胆碱饮食6周到小鼠NASH模型。

结果

XBP1蛋白表达在NASH患者肝组织中明显上调。肝细胞特异性缺失XBP1可以抑制小鼠脂肪性肝炎进展。同时, 巨噬细胞特异性缺失XBP1的小鼠比野生型小鼠的脂肪性肝炎及肝纤维化更轻微。巨噬细胞特异性XBP1的小鼠中出现发挥抗炎作用的M2极化。缺失XBP1的巨噬细胞可以抑制NLRP3表达及促炎因子分泌，通过介导M2型巨噬细胞极化，减轻脂肪性肝炎。肝细胞特异性敲除NLRP3小鼠比野生型小鼠的脂肪性肝炎更轻微。XBP1缺失的巨噬细胞通过降低TGF-β1抑制肝星状细胞的激活。巨噬细胞特异性敲除XBP1的小鼠比野生型小鼠的纤维化更少。因此，抑制XBP1可以抑制NASH进展。

结论

XBP1调节NASH进展，抑制XBP1可对抗脂肪性肝炎。因此，XBP1是NASH潜在治疗靶点。

总结

转录因子XBP1在NASH患者肝组织中表达上调。小鼠研究发现，在肝细胞中条件性敲除XBP1可导致脂肪蓄积减少，然而在巨噬细胞中敲除XBP1基因可以减轻营养性脂肪性肝炎和纤维化。抑制XBP1的药物可能减轻脂肪肝炎和肝纤维化，提示XBP1是NASH潜在治疗靶点。

正文解读

研究背景

NASH的特征是肝内脂肪过度蓄积、脂质代谢紊乱。脂毒性可通过炎症，启动和加速肝细胞损伤，从而引发NASH。研究表明，脂质代谢紊乱、巨噬细胞相关炎症在调控NASH进展中发挥关键作用。此外，糖脂代谢、胆酸毒性、肝星状细胞激活等多种致病机制，促进肝细胞损伤，导致NASH进展。而且，肝内脂质稳态机制复杂，涉及脂质生成、脂质分解相关基因及信号通路。但NASH中代谢紊乱、炎症免疫反应的具体机制仍不清楚。目前治疗NASH及其并发症仍无有效药物。研究NASH致病分子机制对于开发有效治疗方案至关重要。

XBP1调节哺乳动物未折叠蛋白反应(UPR)或内质网(ER)应激反应。内质网应激下，核糖核酸内切酶IRE1a诱导XBP1 mRNA剪接，产生成熟mRNA，编码活性转录因子剪接的XBP1 (sXBP1)。此外，XBP1对胚胎肝脏的发育至关重要。在不同的病例中，XBP1特异性缺失导致不同结果。然而，XBP1在NASH中调节肝脏炎症、纤维化和脂质代谢紊乱的作用尚不明确。因此本研究采用肝细胞特异性XBP1缺失小鼠、巨噬细胞特异性缺失XBP1小鼠探索XBP1在NASH进展中的机制。

结果

1. NASH患者肝组织中XBP1表达上调

作者检测46例NASH患者及35例正常对照组肝组织XBP1表达水平。RT-PCR结果显示，NASH组XBP1基因表达水平比对照组明显升高(图1A)。WB及免疫组化证实NASH患者肝组织sXBP1蛋白水平上调(图1B、1C)。进一步分析显示sXBP1在NASH患者肝组织中的肝细胞中和巨噬细胞中均表达(图1D)。

2. 巨噬细胞XBP1特异性敲除抑制实验性脂肪性肝炎进展

由于在NASH进展过程中存在巨噬细胞浸润，作者评估了巨噬细胞XBP1在其中的作用。巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠及野生型小鼠高脂喂养造模NASH或正常饮食喂养26周。在同种喂养方法下，巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠的体重、肝脏重量、内脏脂肪含量比野生型小鼠要低。高脂饮食喂养的巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠的内脏脂肪组织炎症比野生型小鼠明显更少。肝组织病理显示，高脂饮食喂养的巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠比野生型小鼠肝脏病理状况改善，表现为更少的肝脏脂肪变性及炎症细胞浸润。同样，高脂饮食喂养的巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠比野生型小鼠血清ALT水平及肝脏甘油三酯含量明显降低(图1H)。

巨噬细胞XBP1在脂肪性肝炎中的作用在胆碱缺乏饮食造模NASH中得到进一步证实。同样在胆碱缺乏饮食6周后，巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠比野生型小鼠脂肪性肝炎减少、血清AlT水平降低、肝内甘油三酯含量下降、肝内脂质蓄积更少(图1I-L)。上述结果表明巨噬细胞中XBP1缺乏可减轻小鼠脂肪性肝炎。

图1: NASH患者肝组织中XBP1表达上调，而巨噬细胞XBP1敲除可抑制实验性脂肪性肝炎的进展

(A) 46例NASH患者及35例正常对照组个体肝组织XBP1 mRNA表达水平; (B)WB检测NASH患者和对照组个体肝组织XBP1蛋白表达水平;(C)NASH组和对照组中sXBP1的代表性HE染色、油红染色、免疫组化图片(放大400倍)，每组6例;(D)NASH组和对照组肝组织CD68及sXBP1双能免疫荧光染色(放大400倍)，每组6例;(E)巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠及野生鼠通过高脂饮食或胆碱缺乏饮食造模后的体重变化，巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠及野生型小鼠高脂喂养造模的肝脏重量及内脏脂肪重量;(F)代表性HE染色结果，放大400倍; (G)巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠及野生型小鼠高脂喂养造模NAS(脂肪肝活动评分);(H)巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠及野生型小鼠高脂喂养造模后血清ALT水平及肝内总甘油三酯含量;(I)肝脏组织代表性HE染色图;(J)巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠及野生型小鼠由胆碱缺乏饮食造模后NAS(脂肪肝活动评分);(K)巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠及野生型小鼠由胆碱缺乏饮食造模后血清ALT水平及肝内总甘油三酯含量;(L)巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠及野生型小鼠由胆碱缺乏饮食造模NASH肝组织油红染色代表性图片

3. 肝细胞XBP1特异性敲除可减轻小鼠脂肪性肝炎

作者使用高脂饮食26周喂养肝细胞XBP1特异性敲除小鼠及野生型小鼠，研究肝细胞XBP1在脂肪性肝炎进展中作用。肝细胞XBP1 mRNA、sXBP1蛋白在野生型小鼠中高表达，但在肝细胞XBP1特异性敲除小鼠中不表达。肝细胞XBP1特异性敲除小鼠高脂饮食喂养后比野生型小鼠体重减轻、肝脏重量减轻、内脏脂肪含量减轻。高脂喂养条件下，肝细胞XBP1特异性敲除小鼠比野生型小鼠内脏脂肪组织炎症明显更低。肝脏组织病理检测发现高脂喂养条件下，肝细胞XBP1特异性敲除小鼠的脂肪性肝炎比野生型小鼠更少。油红染色证实肝细胞XBP1特异性敲除小鼠比野生型小鼠肝脂肪变性程度轻微。肝细胞XBP1特异性敲除小鼠血清ALT水平、肝内总甘油三酯水平比野生型小鼠明显更低, 表明肝细胞中特异性敲除XBP1可减轻小鼠肝损伤。肝细胞XBP1在脂肪性肝炎中的作用在缺乏胆碱饮食NASH造模中得到验证。与野生型小鼠相比，肝细胞中特异性敲除XBP1小鼠缺乏胆碱饮食喂养6周，出现脂肪性肝炎减少，ALT水平降低和肝内总甘油三酯含量减少。

图2: 巨噬细胞XBP1导致M1巨噬细胞计划和肝细胞脂质蓄积

(A)高脂喂养的巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠及野生鼠肝组织中iNOS-阳性和CD206-阳性细胞的定量;(B)高脂喂养的巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠及野生鼠肝组织中p-STAT1、STAT1、p-STAT6和STAT6蛋白表达水平;(C)高脂喂养的巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠及野生鼠肝组织中Tnfa、Il6、Il1b和Cxcl10基因表达;(D)流式细胞分析LPS处理骨髓来源巨噬细胞后总巨噬细胞(F4/80+CD11b+)和M1型巨噬细胞(F4/80+CD11b+CD11c+);(E)流式细胞分析LPS处理骨髓来源巨噬细胞后总巨噬细胞(F4/80+CD11b+)和M2型巨噬细胞(F4/80+CD11b+CD206+);(F)高脂喂养的巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠及野生鼠分离的原代肝细胞油红染色图片;(G) 高脂喂养的巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠及野生鼠分离的原代肝细胞中Tnfa、Il6和Il1b基因表达。

为了解为何肝细胞XBP1敲除后降低肝脂肪变，作者评估了调控脂肪生成及脂肪酸氧化相关基因的表达。与野生型小鼠相比，高脂喂养的肝细胞中特异性敲除XBP1小鼠调控脂肪酸合成相关基因(Pparg、Srebp-1c、ChREBP、Fasn) mRNA水平更低，调控脂肪酸降解的相关基因(Ppara、Acadl、Cpt1a) mRNA水平升高。同时, 与野生型小鼠相比，高脂喂养的肝细胞中特异性敲除XBP1小鼠脂肪酸合成相关基因(Pparg、Srebp-1c、ChREBP、Fasn)的蛋白水平降低，调控脂肪酸降解的相关基因(Ppara、Acadl、Cpt1a)的蛋白水平升高。

为进一步确定XBP1敲除是否在细胞水平减轻肝细胞中脂肪降解，作者从肝细胞中特异性敲除XBP1小鼠及野生型小鼠中分离原代肝细胞，培养在棕榈酸(PA)培养基中。肝细胞中特异性敲除XBP1小鼠原代肝细胞中，脂质蓄积明显降低。高脂饮食喂养的肝细胞特异性敲除XBP1小鼠和野生型小鼠的原代肝细胞进行RNA测序分析。在XBP1特异性敲除的肝细胞中，脂肪肝降解通路及PPAR通路明显上调。为了进一步探索XBP1在脂肪性肝炎中的作用，XBP1在野生型小鼠原代细胞中过表达。结果显示XBP1过表达导致升脂基因mRNA水平增高，引起野生型小鼠原代肝细胞调节β氧化基因的mRNA水平减少。在野生型小鼠原代肝细胞中过表达XBP1可增加升脂基因(如PPARc、ChREBP和 FASN)的蛋白水平；降低调节脂肪酸基因(PPARa、ACADL和CPT1A)的蛋白水平。总之，上述结果表明肝细胞XBP1敲除可维持脂质代谢自稳态。

图3: 巨噬细胞XBP1通过激活巨噬细胞NLPR3信号通路促进脂质蓄积和肝细胞中促炎因子的表达

(A)野生型小时分离出的原代肝细胞与LPS处理的巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠及野生鼠中提取的原代骨髓来源巨噬细胞或肝脏巨噬细胞共培养原理图;(B) LPS刺激24小时后，原代巨噬细胞与原代骨髓来源巨噬细胞共培养后油红染色;(C) LPS刺激24小时后，原代巨噬细胞与原代肝脏巨噬细胞共培养后油红染色;(D)棕榈酸处理的肝细胞与巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠及野生鼠的骨髓来源的巨噬细胞共培养后Tnfa、Il6和Il1b的mRNA水平;(F) 肝细胞与巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠及野生鼠的骨髓来源的巨噬细胞共培养后β氧化基因Ppara、Acadl、Acox和Cpt1a的mRNA水平;(E) 肝细胞与巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠及野生鼠的骨髓来源的巨噬细胞共培养后生脂基因Pparg、Srebp-1c、ChREBP和Fasn的mRNA水平;(G)高脂喂养的巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠及野生的肝巨噬细胞中NLRP3、C-caspase-1、pro-caspase-1、IL-1b和pro-IL-1蛋白表达水平;(H)LPS处理的骨髓来源巨噬细胞中NLRP3、C-caspase-1、pro-caspase-1、 IL-1b和pro-IL-1蛋白表达水平; (I)HE染色; (J) NAS; (K) 高脂喂养的巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠及野生鼠中血清ALT和肝脏总甘油三酯内容物水平;(L) 高脂喂养的巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠及野生鼠肝脏组织油红染色图片;(M) 高脂喂养的巨噬细胞XBP1特异性敲除小鼠及野生鼠肝组织中Tnfa、Il6、Il1b和Cxcl10基因表达水平。

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