“不限癌种”的TMB检测，检测时不送检“配对样本”可能导致假阳性！

2020年6月，帕博利珠单抗（Pembrolizumab）第二项“不限癌种”的新适应症获美国FDA批准用于治疗具有高组织肿瘤突变负荷（TMB-H）≥10个突变/Mb的无法切除或转移性实体瘤的成年和儿科患者。

这次批准是基于KEYNOTE-158临床试验结果：非TMB-H的患者，帕博利珠单抗单药的客观缓解率（ORR）仅6.7%，而TMB-H患者的ORR可达29%，包括4%完全缓解和25%部分缓解。

也就是说，TMB高的患者对帕博利珠单抗获益较高。

什么是TMB？

TMB：肿瘤基因突变负荷，Tumor Mutational Burden。指肿瘤基因组中，所评估基因的编码区发生置换和插入/缺失性突变（体细胞突变）的总数，通常按每兆碱基（Mb)中的突变数来计算。

2021年，国家卫生健康委临床检验中心（NCCL）启动了“2021年全国肿瘤突变负荷检测生物信息学分析室间质量评价预研活动”，共有来自11个省（市、自治区）的30家实验室参加，在回报了结果的28家实验室中（收到结果39份），仅有13家实验室通过，所有实验室提交结果的总合格率为43.58%（17/39）。

国家卫生健康委临床检验中心（NCCL）指出，各实验室建立的特定生物信息学分析流程中是否使用配对样本，计算时所纳入的突变类型以及过滤参数，往往会影响TMB检测的准确性。

为什么NCCL重点提出配对样本会影响TMB检测的准确性呢？而且，TMB这个生物标记物获批是基于欧洲血统的白人患者研究中确定的。那么，TMB作为生物标志物在不同患者队列中是不是普遍适用？

带着这两个问题，我们来看今天的这篇文献“Ancestry-driven recalibration of tumor mutational burden and disparate clinical outcomes in response to immune checkpoint inhibitors”，文章发表在《Cancer Cell》杂志。

研究者分析了2000例接受免疫检查点抑制剂治疗的常见实体瘤类型和患者的遗传祖先，并确定了基因组和临床相关性。

并且在一个独立队列中确认了祖先与TMB的相关性，并特别指出TMB结果和祖先特异性偏差相关。同时指出了这些偏差对患者预后的潜在影响，并提出了TMB重新校准的策略。

基因分析能够更好的区分种族

整个DFCI/PROFILE队列中使用了8,193名具有可用遗传数据的癌症患者。研究者在一个包括目标数据人群中使用主成分分析推断遗传祖先，重点关注捕捉欧洲/非洲/亚洲血统的两个“大陆”成分。

与自我报告的种族相比，基因分析发现非洲和亚洲血统的患者分别增加了42%和38%（219/312名非洲血统的患者自我报告为黑人/非裔美国人，53/312名自我报告为白人；

248/343例东亚血统患者自我报告为亚裔，57/343例自我报告为白人）。

通过人群过滤胚系突变导致TMB数值增大

从单独肿瘤测序中，容易将胚系变异误认为体细胞变异，并需要使用人群参考数据库过滤胚系变异。由于可用的欧洲人群参考组比非欧洲人群的参考组要大，假设在非欧洲血统的个体中，单独肿瘤TMB估计的增大程度会特别明显。

研究者使用TCGA队列3,618个样本和Oncopanel-restricted基因的基因组变异，比较了来自全外显子组测序(WES)配对的肿瘤-正常样本和单独来自相同样本的TMB肿瘤样本的相关性。

正如预期的那样，单独TMB肿瘤组显著高于配对TMB组(单独TMB肿瘤组中位数=5.3，配对TMB中位数=3.3,p<0.0001)。

重要的是，与欧洲人相比，非欧洲人的单独肿瘤TMB增大明显更高:平均而言，非欧洲人的TMB增大了2.2倍(计算中位数)，而欧洲人的TMB增大了1.5倍。

为了研究当下现实世界测序中单独肿瘤测序中，不同大陆血统的差异增大现象，研究者参考了AACR GENIE v11.0项目收集的来自多个机构的超过12万个肿瘤的数据。

研究者比较了每个变体的变体等位基因频率(VAF)分布。由于罕见的胚系变异的VAF一般为50%，预计的胚系污染导致更多的高频VAF变异情况，与肿瘤/正常配对组相比在纯肿瘤组中明显可见。

此外，在纯肿瘤组中，非白人患者的肿瘤(种族作为祖先的粗略代表，尚不清楚)中普遍观察到更多高频VAF变异情况，但在肿瘤/正常配对组中则没有。

配对样本数据证实了祖先特异性TMB偏倚

为了确认祖先差异和单独肿瘤检测TMB之间的关系，研究者对现实世界中MSKCC IMPACT中456名患者的队列的肿瘤样本进行测序。在MSKCC IMPACT队列中，有亚洲和非洲血统的患者。其中327例接受免疫检查点抑制剂治疗的非小细胞肺癌患者和139例随机选择的其他癌症患者。

正如研究者预期，与肿瘤/正常配对TMB相比，单独肿瘤TMB的增大更明显，特别是在非欧洲人。这些发现证实了非欧洲患者单独采用肿瘤组织进行TMB检测的结果过高。

TMB校准消除了大多数癌症类型的祖先差异

研究者考虑了panel大小和癌症类型，使用TCGA数据来进行单独肿瘤检测TMB的祖先特异性校准系数。然后，将其应用到完整的DFCI/PROFILE(n=8,193例患者)，以计算重新校准和祖先校正的TMB，并称之为TMB-c。

在DFCI/PROFILE队列重新校准之前，在7种癌症类型(结直肠癌、食道胃癌、头颈鳞状细胞癌和非小细胞肺癌)中，非欧洲人的TMB明显高于欧洲人。

TMB校准后，食管癌和非小细胞肺癌在TMB-c中不再表现出显著的祖先差异，结直肠癌中非欧洲患者中只有TMB-c显著高于欧洲患者(在调整微卫星不稳定状态后)。后续，TMB-c进行所有后续分析。

7种癌症类型中未校准和校准后TMB值分布

肿瘤组TMB校准对临床决策的潜在影响

在确定单独肿瘤组检测TMB中存在不同血统的差异增大后，研究者提出了以下假设:

(1)单独肿瘤组织检测TMB，非欧洲人群中TMB高的比例将增大。 (2)TMB-c可以更好地预测单独肿瘤检测TMB指导免疫检查点抑制剂的的临床结果。

研究者因此计算了DFCI队列中8193例患者的TMB和TMB-c。与欧洲人相比，非欧洲人假TMB高(即原始TMB高更正为TMB-c低)的发生率显著更高(非洲人，51/117,43.6%;亚洲,54/145,37%;欧洲，528/ 2538,21%，p < 0.0001)。

也就是说，分别在100名欧洲、亚洲、非洲血统混合肿瘤类型的患者中，21例欧洲人可能有假TMB-H、37例亚洲人可能有假TMB-H、44例非洲人可能有假TMB-H，这部分人可能就因此接受了免疫检查点抑制剂治疗。在DFCI/PROFILE队列中，在Cox比例风险模型中考虑肿瘤类型和遗传祖先作为协变量后，真正的TMB-H肿瘤总体上明显优于假的TMB-H和真的TMB-L肿瘤（中位OS 27.7个月VS.14.4个月）。

重要的是在DFCI ICI队列中，假TMB-H和真TMB-L肿瘤之间的OS没有观察到显著差异。

三个人群中假TMB的比例

为了验证，对234例接受免疫检查点抑制剂治疗的NSCLC患者计算了单独肿瘤、校准单独肿瘤TMB(TMB-c)和肿瘤/正常配对TMB的值。

真正的TMB-H肿瘤被定义为肿瘤/正常组和单独肿瘤组的TMB-H或纯肿瘤组和纯肿瘤组TMB-c组的TMB-高。

真正的TMB-L的肿瘤被定义为根据肿瘤/正常和纯肿瘤计算的TMB都低或纯肿瘤TMB和纯肿瘤TMB-c均为TMB-L。

假的TMB高的肿瘤仅通过原始肿瘤计算得到高TMB，通过肿瘤/正常计算或TMB-c校正为低TMB。

与DFCI队列相似，使用配对的肿瘤/正常TMB或仅肿瘤TMB-c作为TMB状态分类的金标准，与真TMB-低肿瘤和假TMB-高肿瘤患者相比，真TMB-高肿瘤患者的预后有显著改善。

TMB校准对非小细胞肺癌合并ICI患者MSKCC队列临床结局的影响

检测TMB指导免疫检查点抑制剂，需要组织和配对样本进行，能够得到准确的TMB数值。

那么，如果确实无法取到配对样本的患者来说怎么办呢？小编注意到在AMP 2022美国分子病理学会年会上，一家公司基于SvG算法的单样本检测显示一定可能。

根据报道，该算法对变异来源的预测准确率高达99.83%，肿瘤单样本检测TMB具有与配对检测（tumor-normal）高度一致的性能（R2=0.99，分类结果一致性为98.7%）。

如果可以取到配对样本，建议在检测TMB时送检配对样本进行检测。

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