科研丨Genome Biology: 宿主-微生物组蛋白质-蛋白质相互作用捕获疾病相关途径

编译：微科盟北岸，编辑：微科盟居居、江舜尧。

导读   

宿主-微生物相互作用对正常生理和免疫系统发育至关重要，并与多种疾病有关，包括炎症性肠病(IBD)、结直肠癌(CRC)、肥胖和2型糖尿病(T2D)。

尽管大规模的病例-对照研究旨在确定与致病有关的微生物类群或基因，但迄今为止，它们与疾病之间的联系机制仍然难以捉摸。

为了确定人类相关细菌影响宿主健康的潜在途径，本研究利用公开的种间蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)数据，寻找与已知人类蛋白质相互作用物具有高度序列一致性的微生物群衍生蛋白质簇。

在9项独立的宏基因组研究中，观察到假定的人类相互作用的细菌基因的差异靶向性，证据表明微生物群广泛靶向与IBD、CRC、肥胖和T2D诊断相关的免疫、致癌、凋亡和内分泌信号通路中涉及的人类蛋白。

这种以宿主为中心的分析提供了一个机制假设生成平台，并广泛地为共生细菌蛋白质添加了人类功能注释。    

论文ID

原名：Host-microbiome protein-protein interactions capture disease-relevant pathways

译名：宿主-微生物组蛋白质-蛋白质相互作用捕获疾病相关途径

期刊：Genome Biology

IF：17.906

发表时间：2022.3

通讯作者：Ilana Lauren Brito

通讯作者单位：美国康奈尔大学

DOI号：10.1186/s13059-022-02643-9

实验设计

结果

将微生物组蛋白定位到已知的PPIs可以确定与疾病的潜在机制联系 

为了区分可能与健康相关的PPI和与疾病相关的PPI，研究人员比较了大量病例-对照队列中已确定的微生物相关疾病，即炎症性肠病(IBD)、结直肠癌(CRC)、肥胖和T2D的群落水平PPI概况(图1A，附件3：表S2)。

为了构建群落水平的PPI图谱，将这9项研究中的基因家族丰度与一个新构建的细菌与人类蛋白相互作用体及其相关UniRef簇的细菌成员数据库相关联(附件2：图S2)。

为了实验可靠性，研究人员要求微生物组蛋白质与特定蛋白质具有高度的氨基酸相似性(至少70%)，并有与人类蛋白质相互作用的实验证据。

研究人员发现，在以相同方式过滤的同一UniRef簇的成员之间，种间细菌-人类蛋白质界面残基通常高度相似，甚至完全相同(附件2：图S3)。

研究人员注意到，这一过程只过滤出致病生物体中的蛋白质，如与FZD2结合的Clostridium difficile 毒素B(TcdB)，或主要由致病菌株表达的蛋白质，如与免疫球蛋白L链结合的Finegoldia magna蛋白L。

在对应每个疾病进行随机森林分类(附件2：图S6)后，研究人员发现了1102个与疾病相关的共生细菌蛋白质簇，这是由于它们与648种人类蛋白质的假定相互作用(附加文件4：表S3)。

关注与疾病密切相关的假定微生物组相互作用，可以去除最初通过酵母双杂交(Y2H)方法检测到的更大比例的相互作用，并富集基于亲和技术的相互作用(附加文件2：图S4)，从而去除最“粘性”的细菌蛋白质(附件2：图S5)。

残留程度最高的人类蛋白质是核因子NF-κB p105亚基(NFKB1)，这是一种参与免疫缺陷和细菌感染的蛋白质，在CRC中有不同的靶向性。 

为了测试在每个疾病队列中确定的人类-微生物组PPIs是否与该疾病相关，分析了人类蛋白质靶点与整个人类蛋白质组以及检测到但与疾病无关的那些靶点的作用。

研究人员发现，从相互作用网络(“HBNet”)中的5770种人类蛋白质，到人类微生物组中检测到的2279种具有细菌相互作用物的人类蛋白质(“已检测到”)，再到与疾病相关的648种蛋白质(“疾病相关”)，研究人员观察到，在大CRC、糖尿病、肥胖症和IBD中，先前报道的与基因-疾病关联(GDA)相关的蛋白质的富集增加(图1B)。

在检查每个特定的疾病队列时，疾病特异性富集更为明显(附件2：图S7)。

然而，在每个队列中都看到了所有四种微生物组相关疾病的富集，反映了它们相关的相对风险。

在所有与疾病相关的蛋白质中，有45.2%的蛋白质有一个以上的GDA在研究人员感兴趣的疾病中。

研究人员怀疑这可能会扩展到自身免疫性疾病，这类疾病越来越多地在肠道微生物组学的背景下进行研究。

正如预期的那样，我们的方法所涉及的人类蛋白质中也发现了针对自身免疫疾病的GDA富集(图1B，附件2：图S7)。

此外，将超过一半的PPIs与一个或多个宏基因组研究相关联，这些PPIs在结合及其对人类细胞生理学或疾病病理生理学的影响方面已得到充分研究(附件1：表S1)。

每个微生物组队列的已知基因-疾病注释和疾病关联之间的一致性证表明，使用PPIs捕获微生物组相关疾病的分子异质性的效用。 

在评估反复出现的人体功能注释的统计学意义时，对相关的人类蛋白质进行了通路富集分析，并发现在与IBD、CRC、肥胖和T2D的病理生理学相关的细胞通路中具有既定作用的蛋白质(图1C)，即涉及免疫系统、细胞凋亡、肿瘤发生和内分泌信号通路的蛋白质。富集通路不是特定于疾病的，但包括了分析的四种疾病队列的人类蛋白质。

疾病相关的人类靶点在包括细菌发病机制和潜在炎症的通路中显著富集，如IL-12信号通路和网格蛋白介导的内吞信号通路。

由于筛选出的病原体和肠道微生物群之间有着共同的进化史，以及微生物群内的机会主义，这些途径是可以预期的。

富集通路还包括胆盐代谢和胆固醇代谢(LXR/RXR、TX/RXR和FXR/RXR激活途径)，这些途径也与免疫逃避有关，扩大了微生物群在这些途径中的作用，超出了它们的酶功能。 

在这些途径中，我们看到了目前与微生物组-宿主PPIs有关的这些疾病的已知分子机制的具体例子：肌动蛋白相关蛋白2/3复合体亚基2(ARPc2)(与IBD和CRC队列相关)调节上皮粘附连接的重塑，这是IBD中被破坏的常见途径。

在Zeller等人的CRC队列中看到了丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶1(MAP 4K1)的靶向性，这与其在炎症中的作用一致。

DNA甲基转移酶3a(DNMT3A)参与染色质重塑，已被证明对肠道肿瘤的发生非常重要，在克罗恩病的GWAS研究中作为一个风险位点，介导胰岛素抵抗，并在小鼠脂肪组织中异常表达。

与之一致的是，它与该研究的CRC、IBD、T2D和肥胖微生物组研究有关。

这种以宿主为中心的注释在宏基因组数据的大规模分析之外是有用的，因为它广泛地支持假设驱动的研究，以探讨微生物组对宿主健康影响的蛋白质介导机制。

图1 疾病中微生物组差异靶向的人类蛋白质因相关基因-疾病关联而富集。

A 人类-细菌PPIs网络中的种间细菌蛋白质簇(蓝色)、人类蛋白质(橙色)和相互作用(深蓝色)的数量；在九项宏基因组研究的患者中检测到的细菌蛋白簇的数量，这些研究也与实验验证的相互作用物及其假定的人类相互作用物具有同源性；通过宏基因组机器学习方法，通过比较病例(灰色)和对照(红色)中的丰度，确定与疾病相关的细菌簇和人类蛋白质的数量。

B 根据其在DisGeNET中的GDAs(GDAs>0.1)，与疾病有关的人类蛋白质的比例。

富集的p值表示为：*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 10−3; **** p < 10−4(卡方检验)。

C 在HBNet(左)和所有九项宏基因组病例-照研究中(右)检测到的一组人类蛋白质中富集的人类细胞通路(由IPA注释)，根据Benjamini Hochberg错误发现率(BHFDR)校正后的p值进行着色。

在疾病相关组中，仅显示了BHFDR校正<0.05的途径。富集的p值表示为：*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 10−3；**** p < 10−4(Fisher精确检验)。

D 在3056个细菌蛋白簇中，有106种（左）具有实验验证的蛋白质的物种被映射到患者宏基因组中检测到的821种具有同源性的细菌（右），总共代表1698个簇。物种根据门进行着色。 

微生物组蛋白通过各种途径接触人类蛋白质 

尽管一组经实验验证的相互作用模型(HBNet)包括来自82种独特细菌的相互作用，但最初的担忧是，对少量细胞内病原体进行的高通量筛选所产生的细菌-人类PPIs数量过多，如Salmonella enterica、Yersinia pestis、Francisella tularensis、Acinetobacter baumannii、Mycobacterium tuberculosis、Coxiella burnetii、Chlamydia trachomatis、Legionella pneumophila、Burkholderia mallei和Bacillus anthracis，以及一种细胞外病原体Streptococcus pyogenes (附件5：表S4)。

尽管存在这种偏差，我们发现在患者微生物组中检测到的同源物来自一组821个物种，它们更好地反映了通常与人类-肠道微生物组相关的菌门(图1D)。 接下来，研究人员检查了人类蛋白质靶点的定位。

在“检测到的”和“疾病相关的”人类靶点中，发现上皮、肝脏、脂肪组织和血液成分中表达的基因丰富(图2A)。

尽管假定许多相互作用发生在胃肠道上皮层内，但与疾病相关的人类相互作用者并不特别局限于胃肠组织，也不局限于任何组织，骨髓除外(p = 0.047，卡方检验)(附件2：图S8)。肠道屏障功能受损和共生细菌易位是IBD、CRC和其他微生物相关疾病的发病机制中的特征，这两种功能允许细菌蛋白质进入肠道外部组织。

然而，研究人员怀疑肠道组织中缺乏富集在很大程度上反映了用于实验性相互作用筛选的人类组织、细胞和液体(例如，HeLa细胞、HEK293T、巨噬细胞、血浆、唾液、脾脏和肺)，从而选择具有更一般表达模式的蛋白质。

这一数据强调了使用胃肠病学蛋白质库筛选肠道特异性宿主-微生物组PPIs的必要性。 

在细胞水平上，微生物蛋白质可以通过几种成熟的方法获得人类蛋白质(图2B)。

典型的MAMP往往涉及表面受体(例如TLR、Nod样受体)，包括59.2%的疾病相关相互作用物(图2C)，尽管无法确认它们的方向。

研究人员预计这可能低估了涉及人类生物膜相互作用物的相互作用，因为溶解度问题排除了它们在相互作用中的表现。

除了典型的MAMP受体，新描述的表面受体包括粘附G蛋白偶联受体E1(ADGRE1)，一种参与调节性T细胞发育的蛋白质；受体型酪氨酸蛋白磷酸酶mu(PTPRM)，参与钙粘蛋白相关的细胞粘附等。

另外，相互作用可能涉及分泌的人类蛋白质，如一些已建立的宿主-微生物组PPIs(附件1：表S1)所证明的，包括细胞外基质蛋白层粘连蛋白和免疫调节剂，如细胞外组蛋白。分泌蛋白占疾病靶向人类相互作用物的34.8%，除了细胞因子IL-8、半乳糖凝集素-3和补体4A外，还包括相互作用蛋白质。 

有趣的是，大量与疾病相关的人类相互作用物(178种蛋白质或29.1%)仅存在于细胞内(图2C)，这表明存在其他相互作用方案。

MAM(微生物抗炎分子)是Faecalibacterium prausnitzii分泌的一种蛋白质，可以抑制NF-κB信号并增加紧密连接的完整性，无论是通过小鼠模型灌胃引入，还是在体外肠上皮细胞异位表达，表明MAM在体内被细胞吸收。

细菌产物，或在某些情况下，完整的细菌，可能是内、外或跨细胞的，这一过程可以由受体启动，允许细菌蛋白质进入细胞质甚至核靶标。

或者，用蛋白质修饰并携带周质、细胞质和细胞内膜蛋白作为货物的膜囊泡可以通过内吞或膜扩散被人类细胞吸收。

尽管革兰氏阴性细菌中已充分记录到膜囊泡，但革兰氏阳性分节丝状菌产生的囊泡最近被证明与肠上皮细胞相互作用，并促进Th17细胞的诱导。 因此，与人类分泌物和表面蛋白相互作用的细菌蛋白质有望包含表面定位或细胞外分泌的特征。

事实上，研究人员发现12.2%的疾病相关微生物组蛋白预计包含允许通过Sec或Tat途径分泌的信号肽(图2D)，这在整个菌门中普遍存在(附件2：图S9)。

这些系统通常与其他分泌系统一起工作，将蛋白质定位在细胞膜内或在细胞外分泌，尽管其相关的信号肽更难预测。

另外16.6%的疾病相关微生物组蛋白被预测是跨膜的，尽管其方向未知。

表面定位可能允许人类蛋白质与活的或完整的细菌，或细菌产生的膜泡表面的蛋白质直接接触。

少量蛋白质被发现会进入细胞壁(图2D)。令人惊讶的是，在与疾病相关的细菌相互作用物中，发现分泌蛋白和表面蛋白呈负向富集。

最后，3型、4型和6型分泌系统(T3SS、T4SS和T6SS)可用于直接向人类细胞分泌蛋白质。

带有T3SS和T4SS信号的蛋白质构成了一个重要的组成部分(13.6%)，尽管与疾病相关的微生物组蛋白质的比例在减少(图2D)。这些蛋白质主要来源于肠道变形菌，这些系统通常受到限制(图2D，附件2：图S9)。

基于这九个队列中微生物组中的菌群代表，我们发现有证据表明，至少79.0%(94/119)和58.9%(20/34)的疾病相关簇预测分别由T3SS和T4SS分泌，在具有相应分泌系统的生物体中发现具有代表性的蛋白质(由于预测工具的可用性有限，T6SS被排除在外)。

然而，这些系统以及革兰氏阳性细菌中的同源系统在宿主-微生物组蛋白运输中的作用程度仍不清楚。总体而言，这些数据表明，并不是单一的机制主导宿主-微生物组相互作用，而是通过多种方式促进相互作用。

图2 细菌蛋白质通过多种机制与人类蛋白质接触。

A 根据其在组织和体液中的富集程度绘制HBNet、检测到的和疾病相关亚群中的人类蛋白质比例，如使用DAVID注释的那样。

仅显示在任何两个亚群之间显著富集的蛋白质。富集的p值：*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 10−3; **** p < 10−4。

图例中注明了每组的总数。B 描绘细菌蛋白质接触人类蛋白质的潜在机会的示意图。

相互作用可能涉及(1)分泌的人类蛋白质，(2)分泌到细胞外空间的细菌蛋白质；(3)被内吞或能与人类细胞膜融合的膜泡；(4)细菌细胞裂解物；(5)通过T3SS、T4SS和T6SS注入人类细胞的蛋白质，(6)由于屏障功能障碍或“肠漏”而易位的细胞及其产物，和/或(7)与M细胞、树突状细胞(DC)或上皮细胞直接接触的蛋白质。

C 根据亚细胞位置绘制检测到的人类蛋白质在HBNet和疾病相关亚群中的比例，如使用基因本体论细胞成分注释所示。

富集的p值表示为：*p < 0.05；**p < 0.01；***p< 10−3；**** p < 10−4(卡方检验)。

右侧列出了这些子集的总百分比以及p值。D 根据跨膜和分泌预测绘制HBNet、检测到的和疾病相关亚群中细菌基因簇的比例，并使用TMHMM、EffectiveDB和SignalP进行注释。富集的p值：*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 10−3；**** p < 10−4(卡方检验)。

讨论

微生物组蛋白获得与宿主相关的“兼职”注释 

本研究的一个主要优点是，通过这种新的交互网络，极大地提高了对宿主相关微生物组功能的注释能力。

13.5%的疾病相关细菌簇不包含KEGG(京都基因和基因组百科全书)中具有注释微生物途径/功能的成员(图3A)。

通过对细菌相互作用物进行类似的同源性搜索，这些基因中的大多数现在可以根据其人类靶点的途径进行注释，从而获得假定的疾病相关分子机制(附件2：图S10)。

有趣的是，大多数带有KEGG途径注释的细菌簇也获得了第二条人类途径注释。

在那些可以注释的基因中，与疾病相关的簇主要参与翻译和中枢代谢(图3B)。

这种双重功能并不完全令人惊讶，因为其中许多具有直系同源体，以前被认为是细菌“兼职”蛋白质，除了在细胞中发挥主要作用外，还具有次要功能。

Mycoplasma pneumoniae GroEL和Streptococcus suis烯醇化酶(一种参与糖酵解的蛋白质)与人纤溶酶原和细胞外基质组分结合。

Mycobacterium tuberculosis DnaK向白细胞发出信号，导致趋化因子CCL3-5的释放。

Streptococcus pyogenes甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)通常参与糖酵解，可被转移到细胞表面，在细胞表面发挥粘附素的作用，也可促进人类细胞凋亡。

这些例子清楚地说明了细菌蛋白是如何被病原体用来调节人类健康的。

在这项研究中，研究人员发现了类似的共栖蛋白，它们同样可能具有“种间兼职”功能，并且似乎普遍存在于原生微生物群中。

尽管该方法产生了直接将人类相关微生物群与疾病联系起来的启发性假设，但仍需要功能性实验和结构证据来证实这些特定的宿主-微生物组PPIs。

图3 人类通路注释可以通过相互作用蛋白进行联动，以改进细菌通路注释。

A 成对的堆叠条形图显示了1102个与疾病相关的细菌蛋白质簇，根据它们是否能够被KEGG注释(左)，以及根据它们所靶向的人类蛋白质推断出的途径(右)，如WikiPathways注释。

B 根据COG功能类别绘制HBNet、检测到的和疾病相关亚群中细菌簇的比例。p值：**p < 0.05；**p < 0.01；***p < 10−3；**** p < 10−4(卡方检验)。

微生物组蛋白可作为治疗药物作用于人体靶点 

研究人员发现许多与疾病相关的人类蛋白质是已知的药物靶点(附件6：表S5)。

例如，甲磺酸萘莫司他是一种抗凝剂，可以结合补体蛋白C1R，抑制凝血和纤溶，并提供预防IBD和CRC的保护作用。

乳酸菌、链球菌和F. prausnitzii中的转录调节因子spo0A也对健康患者的这些人类蛋白质进行了差异靶向(图4A)。

甲磺酸伊马替尼(格列卫)靶向多种Src家族酪氨酸激酶，包括参与T细胞发育并在炎症中具有公认作用的LCK。

在分析的IBD和三个CRC队列的健康对照中，靶向这些相同激酶的细菌蛋白持续增加(图4B，附件7：表S6)。

此外，伊马替尼还可以通过抑制TNF-α的产生，阻止结肠肿瘤细胞的增殖，并通常参与炎症途径。

与细菌蛋白单独发挥治疗作用的观点一致，有直接证据表明，至少有两种共生蛋白在灌胃给药时对宿主产生生理作用：纯化的A. muciniphila Amuc1100和F. prausnitzii MAM分别可改善葡萄糖耐受不良和结肠炎。研究人员怀疑这可能会延伸到其他共生蛋白。 

研究人员还发现，与药物相关的标签外效应或副作用与微生物组驱动的人类蛋白质关联相匹配。

例如，抗疟疾药物青蒿素靶向IBD队列微生物群所发现的人类蛋白质：RNA解旋酶DDX5、嘌呤霉素敏感的氨肽酶(NPEPS)、膜联蛋白A2(ANXA2)和剪接因子SFPQ(图4C，附件7：表S6)。

虽然青蒿素及其相关类似物已被证明能有效预防小鼠DSS诱导的结肠炎，其天然来源艾草已被确定为治疗IBD的中草药，但微生物群衍生蛋白与IBD患者的相关性更大，表明青蒿素和共生蛋白可能以相反的方式作用于相同的靶点。

虽然微生物衍生代谢物作为药物的概念得到了广泛认可，但这项工作扩大了微生物源性药物的范围，包括通过PPI发挥作用的蛋白质产物。

图4 肠道共生蛋白靶向的人类蛋白质包括已知的治疗药物靶点。

A 萘莫司他、B 伊马替尼和C 双氢青蒿素靶向在所述宏基因组研究中检测到的细菌蛋白质差异靶向的人类蛋白质。

提供了患者与对照组中细菌相互作用物的Log10相对平均总丰度。p值通过Mann-Whitney秩和检验计算，**p < 0.05；**p < 0.01；***p < 10−3；**** p < 10−4。

结论

这种方法能够对宿主-微生物组的相互作用进行高通量观察，允许从任何宏基因组数据集进行机械推理和假设生成。

然而，这一网络还远远不够完善。对阳性和阴性宿主-病原体PPIs比率的估计高达1:1000，甚至1:100。

共栖微生物群与宿主蛋白质的相互作用是否达到这种程度还需要进行大量的研究。

这种相互作用网络所基于的研究很少是在共生细菌和肠道组织上进行的，因此，我们可能会错过与我们最密切相关的细菌的特定相互作用。

除了涉及共生细菌及其宿主的大规模PPI研究外，还需要进一步深入的研究来充分描述这些机制，例如这些细菌蛋白质是否激活或抑制其人类蛋白质相互作用途径，以及这些相互作用在什么条件下发生。

精确定位这种直接与人类蛋白质相互作用的微生物衍生蛋白质，将有助于发现微生物驱动疾病的新诊断和治疗方法，以及细菌菌株之间宿主相关功能差异的更细微定义，并更深入地了解人类和其他生物及其共生菌群的共同进化。