快报 | 广州市胸科医院分离的结核分枝杆菌临床株中与利福平耐药水平相关基因突变的特征

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Characterization of Genetic Variants Associated with Rifampicin Resistance Level in Mycobacterium tuberculosis Clinical Isolates Collected in Guangzhou Chest Hospital, China 

Hameed HMA，Fang C，Liu Z，Ju Y，Han X，Gao Y，Wang S，Chiwala G，Tan Y，Guan P，Hu J，Xiong X，Peng J，Lin Y，Hussain M, Zhong N, Maslov DA，Cook GM， Liu J，Zhang T.

Infect Drug Resist，2022 ，15：5655-5666.

doi: 10.2147/IDR.S375869. 

近日，德孚医药出版社旗下的《感染和耐药性》（Infection and Drug Resistance）杂志在线发表了中国科学院广州生物医药与健康研究院和广州市胸科医院、深圳市第三人民医院、广州医科大学、广州实验室等单位合作的一项关于结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）临床株中与利福平（Rifampicin，RFP）耐药水平相关基因突变的特征研究。中国科学院广州生物医药与健康研究院助理研究员Hafiz Muhammad Adnan Hameed和博士生方翠婷为共同第一作者，中国科学院广州生物医药与健康研究院张天宇研究员和广州市胸科医院刘建雄教授为论文的共同通讯作者。

背 景

RFP是1965年发现的一种药物，是利福霉素B的半合成衍生物，对活动性和潜伏性MTB均具有很强的杀菌活性。RFP的耐药性常常与异烟肼（INH）耐药性同时出现，而同时对这两种药物都耐药的MTB导致的结核病（TB）被归类为耐多药（MDR）TB。RFP耐药（RFPR）-TB是MDR-TB的代表，2018年，世卫组织报告了约50万例RFPR-TB病例，其中78%为MDR-TB。中国的RFPR结核病负担全球第二高，仅排在印度之后，占全球RFPR-TB病例的14%。RFP靶向DNA依赖性RNA聚合酶（RNAP），通过阻止第一个磷酸二酯键形成后的移位，防止RNA延伸，从而抑制转录来达到杀菌作用。RFPR主要与编码RNA聚合酶β亚基的rpoB基因突变有关。大约90%~95%的RFPR菌株在rpoB的81-bp区域内存在突变，该区域位于MTB的507~533密码子之间，被称为RFP抗性决定区（RRDR）。剩余约5%~10%的RFPR菌株的突变发生在rpoB的N末端或簇II区域中，或者可能具有未知的耐药机制。

目前在我国临床应用的MTB的药物敏感性测试（DST）检测方法主要分为两种类型：表型DST和基因型DST。表型DST是建立在培养基础上的，其结果能体现出耐药水平，但由于MTB生长十分缓慢，所以出结果的耗时长且受操作手法影响较大，这不仅会导致诊断延迟还会阻碍TB治疗。而基因型法快速准确但如Xpert MTB/RFP只能检测RFP或同时检测RFP和异烟肼的耐药情况，能检测的药物种类有限，且仅检测RRDR内的突变。而最近斯威士兰的一项调查显示，高达30%的MDR-TB在RRDR之外具有RFP耐药相关突变。

基于检测MTB耐药突变的DST结果的准确性对于可靠的早期诊断和确定有效的治疗方案至关重要。然而，关于MDR-TB患者中导致RFP耐药性的各种rpoB突变的流行率和作用的数据有限。故我们综合调查了从广州收集的临床分离株的表型和遗传特征来确定RRDR内外的RFPR相关突变的分布和频率，同时检测了RFP对具有不同rpoB突变的菌株的MIC。这项前瞻性研究将有助于确定新发现的rpoB突变在MTB中引起RFPR的潜在作用，以提高提高分子诊断的准确性。

研究设计

广州市胸科医院是一家位于华南地区最大的TB专科医院，主要收治广东、福建、广西、海南、湖南等地区的病人。从2019年9月至2021年11月在该院登记的患者（年龄范围15~89岁）中随机采集临床分离株465株。根据先前的治疗记录对临床反应不佳的TB患者进行分类，对疑似病例进行痰涂片镜检和培养检测、TB感染T细胞检测(QFT-GIT)、结核菌素皮肤试验（TST）和影像学评估。同时通过Ziehl-Neelsen染色和商业MPB64单克隆抗体测定确定临床菌株的物种。最后选择了175株经证实为MTB的菌株进行这项研究，通过比例法和Bactec MGIT 960系统进行了药敏检测，使用GeneXpert MTB/RIF和Sanger测序确定遗传特征，并使用阿尔玛蓝试验测定RFP的最小抑菌浓度（MIC）。

研究结果

1.患者特征

本研究选取的175株MTB临床分离株来源的病例中，男性TB患者比例较高，为115/175（65.71%），女性患者为60/175（34.28%）。MTB阳性病例的约半数（49.71%）来自45~65岁患者的年龄组，其中 RFPR-TB 患者的数量为74/150 （49.33%）。此外，本研究中分析的大多数MTB分离株105/175（60.00%）来自复发的TB患者，而70/175（40.00%）来自新发TB患者（详见表1）。

在175株MTB临床分离株中，150/175（85.71%）被鉴定为对RFP耐药（MIC：4至> 64 µg/ml），25/175(14.28%)对RFP敏感。其中，检测到57株MDR-MTB和81株pre-XDR-MTB，累计占总数的78.85%（138/175），而剩下有4个菌株对RFP具有单一耐药性，其余8/150（5.33%）的RFPR菌株具有不同的耐药模式。在这项研究中，复发患者中的的RFPR MTB数量91/150(60.66%)比新发患者59/150（39.33%）要高得多。

表1 175 MTB临床分离株来源病例的人口统计学特征

2.MTB中rpoB的遗传特征

本研究中MTB菌株的遗传特征是通过Sanger测序检测rpoB基因中赋予RFP耐药性的突变来确定的。除了RRDR中的突变外，我们还鉴定了RRDR之外的非同义突变，这些突变仍未被GeneXpert MTB/RIF检测纳入。本研究中所有RFPR菌株150/150（100%）在rpoB基因中含有赋予耐药性的突变或插入缺失。我们在整个rpoB基因中检测到67个不同类型的突变，包括46个非同义突变、13个同义突变、4个缺失和4个插入。

通过遗传分析发现146/150（97.33%）株耐药菌株的rpoB的RFP耐药决定区（RRDR，密码子426-452）中有17种突变，主要位于：L430（P）、D435（V、E、G、N）、H445（N、D、Y、R、L）、S450（L、F）和L452（P）。D435V（12/146，2%）、H445N（16/146，10.9%）和S450L（70/146，47.94%）是最常见的突变。RRDR中很少发现Q432K、M434V和N437D突变。

图1 rpoB基因的RRDR（位于大肠杆菌密码子507~533，MTB密码子426~452）中的突变和插入缺失；本研究中RFPR菌株中新检测到的和较少被检测到的突变和插入缺失；括号中为包含对应突变的MTB菌株的数量。

完整rpoB基因的测序结果显示还中存在47个不同类型的非RRDR突变/插入缺失（包括13个同义突变）（图2）。其中，27个非同义突变/插入缺失仅在RFPR菌株中观察到，2个（R1162H，A1166T）同时存在于RFPR和RFPS菌株中，5个仅在RFPS菌株中。而I491（L，M）、P541（T，K，Q)、N673（S）和A1166（T）为经常检测到的非RRDR突变。在RRDR之外仅检测到4株RFPR菌株的新突变/缺失和插入，分别为（K274Q+C897del+I491M）、（A286V+L494P）、（G1687del+P454L）和（TT1835-6 ins+I491L）。

图2rpoB基因RRDR之外的突变和插入缺失

*表示本研究中在RFPR菌株中新检测的和很少被检测到的突变和插入缺失；#表示在RFPR和RFPS菌株中同时存在的非同义突变；§表示仅在RFPS菌株中存在的非同义突变；括号中为包含对应突变的MTB菌株的数量

3.rpoB突变与RFP耐药水平的关系

最小抑制浓度（MIC）测试表明，rpoB RRDR中的突变/插入缺失主要与RFP耐药（CC > 1 µg/ml）相关，MIC范围为4到 >64 µg/ml。有趣的是，具有双RRDR突变或同时具有RRDR和非RRDR突变的RFPR菌株比只有一个RRDR突变的菌株有更高的耐药水平。主要是，在密码子445和S450L突变处具有突变的RFPR菌株产生了更高水平的抗性。一般来说，突变氨基酸在药物结合位点的距离与耐药性水平之间存在直接的关系。主要导致 MTB中更高水平的RFP耐药性的突变位于RFP结合口袋（RBP）的确切位置或附近（图3）。

图3 RpoB中突变和结合位点残基的位置

4.Xpert和DNA测序结果的评估

为了评估基因型DST在预测RFPR中的性能，对175个MTB临床分离株的表型和基因型DST数据进行了统计比较。以表型DST结果为参考，通过Xpert测定法检测到RFPR的敏感度为95.33%（95% CI：90.62%～98.1%），特异度为100%（95% CI：86.28%～100%），准确度为96%（95% CI：91.93%～98.38%）。而通过对rpoB整个区域进行测序分析以检测赋予耐药性的突变显示出100%（95% CI：97.57%～100%）的敏感度和100%(95% CI：86.28%～100%)的特异度及100% 的准确度（95% CI：97.91%～100%）（表2）。我们的分析表明，Xpert系统覆盖rpoB的RRDR的灵敏度（95.33%）与整个rpoB基因测序（100%）基本相近，但通过整个rpoB基因测序的方法与表型DST结果具有最大的准确性。此外，Xpert系统未检出其中7株MTB菌株的RFP耐药性，而通过对整个rpoB基因的测序证明了这些菌株为RFPR菌株，其中3/7在RRDR内有插入缺失，4/7有非RRDR 突变。

表2基因型药物敏感性测试方法的评估

研究的意义及展望

RFP耐药是MDR-TB的替代标志，RFPR/MDR-TB的出现是一个严重的公共卫生问题。结核病快速诊断设施的缺乏和结核病治疗方案的不当是导致 RFPR/MDR-TB 出现的关键原因。

这项研究揭示了RFPR MTB临床分离株的综合表型和遗传谱。对rpoB的非RRDR的评估揭示了可用于检测假RFP敏感菌株的耐药相关非同义突变，而获得假阴性结果的患者有可能接受药物敏感TB的治疗方案，于是往往治疗效果不佳。然而，我们观察到检测RDRR之外的突变仅能提高约5%的诊断灵敏度，覆盖RRDR的Xpert探针显示了约95%的诊断灵敏度。因此，改善获得WHO认可的GeneXpert MTB/RIF可能有助于快速分子诊断MTB中 RFP耐药性。在这里，我们提供了详细的见解来理解MTB中位于基因rpoB的RRDR内外的非同义突变对RFP易感性的作用。rpoB的RRDR内外的耐药相关突变突出了它们作为潜在诊断耐药标记的作用，以及作为MTB中RFP和其他利福霉素的靶标的可能性。这些发现可能有助于设计与RFP耐药相关的各种等位基因的新探针，能支持疾病的早期发现，并有利于在高TB负担环境中推荐适当的抗TB治疗方案。