科研丨港中大: 急性后COVID-19综合征患者肠道菌群的动态变化 (国人佳作)

编译：微科盟蔚蓝，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

COVID-19后的长期并发症很常见，但病毒清除后持续症状的潜在原因仍不清楚。研究肠道微生物组组成是否与急性后COVID-19综合征(PACS)相关，PACS定义为SARS-CoV-2病毒清除后4周内至少出现一个持续症状。本研究对106名COVID-19严重程度不同的患者(随访时间从入院到6个月)和68名非COVID-19对照组进行了前瞻性研究。使用鸟枪法宏基因组测序分析了258个样本的粪便微生物组，并将结果与6个月时的持续症状相关联。结果发现，6个月时，76%的患者出现PACS，最常见的症状是疲劳、记忆力差和脱发。入院时肠道微生物组成与PACS的发生有关。与非COVID-19对照组相比，非PACS患者肠道微生物组在6个月时恢复。PACS患者的肠道微生物组特征为Ruminococcus gnavus、Bacteroides vulgatus的水平较高，而Faecalibacterium prausnitzii的水平较低。持续性呼吸道症状与肠道机会性病原体相关，神经精神症状和疲劳与医院肠道病原体相关，包括Clostridium innocuum和Actinomyces naeslundii(p<0.05)。产丁酸盐细菌(如Bifidobacterium pseudocatenulatum和普氏栖粪杆菌)在6个月时与PACS的负相关性最大。综上，这些研究结果为COVID-19长期并发症患者肠道微生物组的组成改变提供了观察性证据。进一步的研究应探讨微生物群调节是否有助于急性后COVID-19综合征的及时康复。    

论文ID

原名：Gut microbiota dynamics in a prospective cohort of patients with post-acute COVID-19 syndrome

译名：急性后COVID-19综合征患者前瞻性队列中的肠道菌群动态

期刊：Gut

IF：31.793

发表时间：2022.1

通讯作者：黄秀娟(Siew C Ng)

通讯作者单位：香港中文大学

DOI号：   10.1136/gutjnl-2021-325989  

实验设计

结果

1.急性后 COVID-19 综合征

2020年2月1日至8月31日期间，我们从香港的三个医院招募了106名患者，并对其进行了为期6个月的随访。中位年龄为48.3岁(IQR 33-62岁)，56人(52.9%)为女性(表1)。在这些患者中，高血压(17%)是最常见的合并症，其次是2型糖尿病(15.1%)。大多数患者在住院期间出现轻度至中度COVID-19(81.1%)，25名患者(23.6%)在住院期间接受了抗生素治疗。总体而言，在3个月和6个月时，分别有86名 (81.1%)和81名 (76.4%) COVID-19患者发生PACS。6个月时最常见的症状是疲劳(31.3%)、记忆力差(28.3%)、脱发(21.7%)、焦虑(20.8%)和睡眠困难(20.8%；图1A)。在6个月时，有或无PACS的患者在年龄、性别、合并症、抗生素的使用、抗病毒药物的使用和COVID-19的严重程度方面没有显著差异(图1B)。

图1 病毒清除后的急性后COVID-19综合征 (PACS)。(A) 106名患者在急性COVID-19后3个月和6个月出现30种症状的比例；(B) PACS发生相关因素的多变量分析。中心点表示平均值，方框表示上、下四分位数范围。

表1 106名COVID-19康复患者的临床特征。

2.COVID-19患者肠道菌群组成改变在疾病消退后持续6个月

在106名COVID-19患者中，68名在入院时(n=47)、1个月(n=64)和6个月(n=68)随访时收集粪便样本进行肠道微生物群分析。在9个月的随访中还收集了11名患者的粪便样本。我们首先检测了住院期间未使用(图2)或使用抗生素的随访COVID-19患者的肠道微生物组组成。6个月时未使用抗生素患者的肠道微生物群组成仍然不同(图2A)，6个月时的细菌多样性(Shannon指数)和Chao1丰富度显著低于非COVID-19对照组(图2B，C)。在未使用过抗生素的患者中，1个月和6个月时的肠道微生物组组成的聚类中心几乎相同(p=0.555，图2A)，但与非COVID-19对照组的样本不同(图2A)。此外，在疾病消退后1个月、6个月和9个月的样本分析中，肠道微生物群组成稳定。我们观察到，与非COVID-19 对照组相比，1个月和6个月时未使用过抗生素的 COVID-19 患者肠道微生物群的生态失调和异质性由前5个门(图2D)和前 10 个最常见的属定义(图 2E)。COVID-19 患者瘤胃球菌属(Ruminococcus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的相对丰度显著低于非 COVID-19对照组(平均3.02% vs 6.75%，平均16.36% vs 19.22%，p<0.001，Mann-Whitney检验；图2E)。

在6 个月的随访中检测抗生素效果，未使用抗生素患者和抗生素治疗患者的总体肠道微生物群组成相似(p=0.351)。基线时，未使用抗生素患者和抗生素治疗患者之间的微生物群组成没有显著差异，而在1个月的随访中，整体肠道微生物群组成不同。根据医生的判断，患者接受4至12天的抗生素治疗，平均为7.89 (IQR 6-11)天。我们发现肠道微生物群组成与抗生素治疗持续时间之间没有显著相关性。这些数据表明，抗生素对COVID-19患者肠道微生物组的持续影响不会超过6个月。

图2 住院患者(未使用抗生素)、SARS-CoV-2阴性后随访和非COVID-19个体粪便中肠道微生物群的组成差异。(A) 与非COVID-19个体相比，COVID-19患者SARS-CoV-2 阴性前后肠道微生物群组成的主坐标分析(PCoA)。(B)病毒清除后1个月和6个月时COVID-19患者肠道微生物群的多样性和丰富度分析。(D) SARS-CoV-2阴性后1个月内和6个月以上的住院患者和随访粪便中检出的前5个门和前10个微生物属(E)的平均相对丰度。

3.PACS患者具有明显的肠道微生物群失调

在68名COVID-19患者中(在6个月时分析了粪便样本)，其中50名(73.5%)患有PACS。我们检测了病毒载量，发现病毒载量(粪便和呼吸道样本)与PACS发展之间没有显著相关性。在6个月的随访中，我们在有和无PACS的患者中发现了两种不同的肠道微生物群(图3A和4A，p<0.05)。与非COVID-19对照组相比，无PACS的患者肠道微生物组恢复(图3A和4A，p=0.470)，而在6个月时 PACS患者的肠道微生物组成与非COVID-19对照组仍旧不同(图3A, p< 0.001)。在6个月的随访中，PACS患者的细菌多样性和丰富度(分别通过Shannon多样性指数和Chao1丰富度指数衡量)显著低于无PACS和对照组患者(图 3B，C)。此外，与非COVID-19对照组相比，发生PACS的患者入院时的细菌Shannon多样性和肠道微生物组丰富度显著降低(图4C)，但未发生PACS的患者与对照组之间的Shannon多样性和丰富度没有差异(图4B)。在PACS患者中检测到的肠道细菌种类中，基线和随访样本中28种细菌减少，14种增加(图4D，E)。在6个月时，与非 COVID-19对照组相比，PACS患者的产气柯林斯菌Collinsella aerofaciens、普氏栖粪杆菌F. prausnitzii、Blautia obeum水平显著降低，而Ruminococcus gnavus和普通拟杆菌Bacteroides vulgatus水平显著升高(p<0.05，LefSe>2；图3D)。无PACS受试者在入院时仅显示25种细菌种类的改变，在6个月时完全恢复(图4D)。据报道，PACS患者表现出多种持续性生化病理生理学特征。使用HUMAnN3研究肠道细菌组的功能改变。通过MaAslin2分析发现，PACS患者和非COVID-19对照组之间32种MetaCyc通路的相对丰度存在显著差异(p<0.05)。PACS患者的肠道微生物组中尿素循环途径、L-瓜氨酸生物合成途径和L-鸟氨酸生物合成Ⅱ途径的丰度增加。

图3 6 个月时有或无急性后COVID-19综合征(PACS)的COVID-19患者的肠道微生物群组成。(A) 6个月时有或无PACS的COVID-19患者肠道微生物群组成的主坐标分析(PCoA)。(B)细菌多样性和丰富度。(C)有或无PACS患者的肠道微生物群组成分析。(C) 6个月时PACS患者肠道微生物组分类群LefSe分析。LDA，线性判别分析。

图4 病毒清除后不同时间点基线和随访样本肠道微生物群的组成差异。(A)  与非 COVID-19受试者相比，有或无PACS的COVID-19患者在SARS-CoV-2定量逆转录-聚合酶链反应阴性前后肠道菌群组成的主坐标分析 (PCoA)。(B) 与非COVID-19受试者相比，基线时COVID-19患者肠道微生物群的多样性和丰富度分析(分别以 Shannon多样性和Chao1丰富度指数衡量)。(C) 与非COVID-19 受试者相比，随访6个月时COVID-19患者肠道微生物群的多样性和丰富度分析。(D)有或无PACS的COVID-19患者在病毒清除后从基线到随访6个月的肠道微生物组成的变化。(E)基线时PACS康复患者肠道微生物组的线性判别分析效应大小。

4.肠道微生物组组成反映了PACS患者的不同症状

随后我们检测了6个月时肠道微生物组的组成及其与不同症状的关联。基于 PERMANOVA，肠道组成与住院期间的药物治疗或疾病严重程度无关(图5A)。我们将PACS的症状分为呼吸系统(咳嗽、咳痰、鼻塞/流鼻涕、气促)、神经精神系统(头痛、头晕、味觉丧失、嗅觉丧失、焦虑、注意力不集中、睡眠困难、悲伤、记忆力差、视力模糊)、胃肠道(恶心、腹泻、腹痛、上腹痛)、皮肤病(脱发)、肌肉骨骼(关节痛、肌肉痛)和疲劳。我们使用MaAsLin2检测了单个细菌类群与不同类别症状的关联。

不同的症状与不同的肠道微生物组模式相关(图5B)。共有81种细菌与不同类别的PACS相关，其中许多细菌与两种以上的持续症状相关(图5C)。在6个月时，持续呼吸道症状患者的肠道微生物组组成与许多机会性病原体呈正相关，包括咽峡炎链球菌Streptococcus anginosus、Streptococcus vestibularis、Streptococcus gordonii和Clostridium disporicum，而许多与机会性感染相关的医院病原体(包括Clostridium innocuum和Actinomyces naeslundii)则与神经精神症状和疲劳相关。与非COVID-19对照组相比(p<0.05)，6 个月时持续脱发的患者(n=23)中产生丁酸盐的物种显著减少，如Roseburia inulinivorans和普氏栖粪杆菌。此外，已知对宿主免疫有益的多种细菌物种的相对丰度，包括Bifidobacterium pseudocatenulatum、普氏栖粪杆菌、R. inulinivorans和Roseburia hominis，在6个月时与PACS的负相关性最大(图5C)。

6 分钟步行测试常用于确定患者的功能。先前的研究表明，微生物群丰富度较低的康复后患者的肺功能受损，但COVID-19后6分钟步行距离缩短的原因仍然未知。在6个月随访时提供粪便样本的68名COVID-19患者中，其中52个在 6个月时进行了6分钟步行测试评估。PACS患者的中位6分钟步行距离明显低于非PACS患者(平均382 m vs 464 m，p<0.001)。我们观察到步行距离与病原菌种类呈显著负相关(例如Clostridium innocuum和Clostridium bolteae)，这些菌在不同人群中可能具有致病性或与疾病风险相关(p<0.05)。步行距离与肠道微生物组的几种短链脂肪酸和丁酸盐生产菌呈正相关，包括Bifidobacterium pseudocatenulatum、Roseburia inulinivorans和Bacteroides ovatus，这意味着病毒清除后人类与肠-肺-微生物组轴之间的有益共生关系。

图5 病毒清除后患者随访粪便中肠道微生物组的影响因素。(A)由置换多元方差分析 (PERMANOVA)检验确定的受试者元数据对肠道微生物组组成的影响大小。(B)通过PERMANOVA检验确定的肠道微生物组组成与急性后COVID-19综合征(PACS)不同亚组之间的总体关联。(C) 6个月时不同类别PACS与细菌种类的关联。

5.入院时的肠道微生物群组成可预测PACS

本研究探究了入院时的肠道微生物组谱是否会影响 PACS 的发展。我们通过入院样本观察到患有和未患PACS的患者中有两个明显不同的细菌簇(图6A，p<0.05)。与PACS患者相比，非PACS患者的基线肠道细菌组成富集19种细菌，并以双歧杆菌属、布劳特氏菌属Blautia和拟杆菌属为特征(图6B、C，p<0.05，线性判别分析效应大小>2)。入院时，发生PACS的患者肠道细菌Shannon多样性和丰富度显著低于非COVID-19对照组。图4C)。入院时包括Blautia wexlerae和Bifidobacterium longum在内的13种细菌，在6个月时与PACS呈负相关，表明这些物种在SARS-CoV-2感染恢复中的特定保护作用(图6B，C)，而Actinomyces sp S6 Spd3、Actinomyces johnsonii和Atopobium parvulum与PACS呈正相关。我们发现了细菌种类的重叠，例如R. gnavus、C. innocuum、Erysipelatous ramosum，从基线到随访仍然发生变化，并与几种PACS症状相关，进一步表明肠道微生物组改变与 COVID-19 患者的恢复过程之间存在联系(图6D)。这些发现共同表明，入院时个体的肠道微生物组成可能会影响受试者对COVID-19长期并发症的易感性。

图6 6个月时有或无任何持续症状的COVID-19患者入院时的肠道微生物群组成。(A)清除SARS-CoV-2后第6个月有或无任何持续症状的COVID-19患者肠道微生物群组成的主坐标分析(PCoA)。(B)期间确认SARS-CoV-2定量逆转录-聚合酶链反应呈阳性后首次粪便样本的肠道微生物群组成。(C)由MaAsLin2确定的COVID-19康复患者的持续症状与基线微生物特征之间的关联(p<0.05)。(D)肠道微生物组与PACS发展之间关联的示意图。

讨论

本研究是首个证明COVID-19康复后6个月持续存在的肠道菌群失调以及肠道菌群改变与常见的持续症状间关联的研究。本研究的新颖性在于评估急性COVID-19后的持续症状及其与不同COVID-19严重程度(包括轻度疾病)患者肠道微生物群改变的关联。本研究的一个优势是使用鸟枪法宏基因组测序对从入院到6个月的肠道微生物群进行前瞻性评估，并收集完整的临床数据。香港很少发生与COVID-19相关的死亡事件，受试者来自收治香港大部分COVID-19患者的三个区域医院，因此该队列不太可能存在选择偏倚。样本量小是本研究的一个局限性，本研究的发现应该在不同人群的更大队列中进一步证实。

特定的肠道微生物组谱与PAC存在相关，这表明人类肠道微生物组可能在PACS的发展中发挥重要作用。肠道微生物通过细菌的肠-肺易位、免疫和炎症的调节在急性肺损伤中发挥潜在作用，表明微生物组谱在PACS风险分层中的前景。对宿主免疫有益的多种共生细菌的丰度(C. aerofaciens、F. prausnitzii、E rectale 和B.obeum)与PACS的发展呈显著负相关。已知PACS患者中F. prausnitzii的减少具有免疫调节特性并有助于宿主防御，包括通过抑制NF-κB通路下调炎症反应、干扰白细胞介素-8合成和抑制白细胞介素-8分泌，而来自Blautia属的Blautia obeum可以发挥抗炎作用。不同的厚壁菌门细菌在小鼠肠道中ACE2表达的上调或下调中具有不同作用，而F. prausnitzii衍生分子与诱导白细胞介素-10(一种抗炎细胞因子)的能力相关。此外，一系列产丁酸盐细菌的存在与6分钟步行试验密切相关，这意味着这些微生物在减少急性感染后的全身并发症方面具有潜在的有益作用。由于呼吸道是COVID-19的主要靶器官，我们关于肠道中某些链球菌与持续的肺部症状(包括呼吸困难)之间存在关联的发现并不令人惊讶。本研究的数据与之前报道的慢性疾病中肠道微生物组紊乱的研究一致，从胃肠道、炎症和代谢疾病到神经和呼吸系统疾病。据报道，大约20%的COVID-19幸存者出现脱发。急性COVID-19后脱发患者的粪便微生物群组成中产丁酸盐物种减少，如R. inulinivorans和F. prausnitzii。此前丁酸盐已被证明可以对大脑的可塑性和功能产生有益适应性，产丁酸盐微生物可以保护宿主免受压力的许多负面影响，包括脱发和焦虑样行为

细菌类群及其与特定急性后症状的关联表明，不同的微生物模式可能促进不同PACS症状的发展。因此，微生物组有可能作为预测急性后COVID-19症状发展的指标。 本研究确定了多种有益细菌物种的丰度与6个月时PACS的发展之间存在很强的负相关性。几种共生菌的缺失，包括已知具有免疫调节功能的双歧杆菌属、罗氏菌属和粪杆菌属，与COVID-19康复患者的持续症状相关。后两种细菌是几种重要短链脂肪酸的生产菌和免疫稳态维持的主要参与者。这些脂肪酸已被证明可以改变趋化性和吞噬作用，诱导活性氧，改变细胞增殖和功能，并具有抗菌和抗炎作用。

尽管观察到的关联令人鼓舞，但该研究的说服力可能会受到与COVID-19无关但可能影响细菌微生物组的未识别因素的限制，包括宿主环境、饮食、生活方式、药物(尽管所有受试者在随访期间都未服用任何抗生素，并且两组患者合并症无差异)以及患者对问卷的主观回答可能存在偏差。由于患者出院后没有重复的病毒检测，我们无法确定有和无PACS患者病毒活动的持续时间。需要进一步的研究来了解微生物群调节是否以及如何减轻PACS负担。需要结合饮食、血清学和免疫学数据进行研究，以进一步阐明急性COVID-19感染后持续症状的机制。

综上所述，肠道微生物组组成的改变与SARS-CoV-2病毒清除后6个月COVID-19患者的持续症状密切相关。考虑到持续的大流行期间有数百万人受到感染，本研究的结果为考虑微生物群调节以促进及时恢复并减轻急性后COVID-19综合征的负担提供了强大推动力。