项目文章丨东北农大: 邻苯二甲酸酯会导致十二指肠屏障缺陷中的微生物群-屏障-免疫交互的破坏(国人佳作)

编译：杨天宁，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

邻苯二甲酸酯是常见的塑化剂，邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)是一种常用的邻苯二甲酸酯类化合物，是世界范围内普遍使用的增塑剂，被EPA列为环境内分泌干扰物。持久性极强的塑料会通过水生环境进入动物的食物链，影响代谢途径，并对消化系统造成损害。肠道具有免疫功能、屏障功能、消化吸收功能等，是首过代谢的重要途径，然而微生物群落和肠道功能的关系仍然需要进一步探索。为了研究邻苯二甲酸酯在十二指肠中的毒性，本研究用250、500和750 mg/kg剂量的DEHP灌胃鹌鹑45天，并保留水和油对照组。这项研究表明，亚慢性接触DEHP可导致鹌鹑十二指肠屏障缺陷。十二指肠的损伤反映在绒毛长度和隐窝深度的比值和紧密连接蛋白的减少。此外，DEHP还通过作为生物屏障的菌群失调导致抗菌防御系统的崩溃。Proteobacteria和Bacteroidetes是Vcon组的优势菌群，而D750组的Proteobacteria增加了19.2%，Bacteroidetes减少了6.8%。作为属水平上的优势菌，D750组的Sediminibacterium(32.8%)和Lactobacillus(25.11%)的丰度百分比下降，而Bradyrhizobium(20.7%)和Methylovirgula(6.2%)的丰度百分比增加。脂多糖的大量存在导致TLR4受体的活化。此外，DEHP激活氧化应激，从而协同TLR4-NFκB途径诱导的炎症反应，并进一步促进十二指肠损伤。本研究为进一步研究邻苯二甲酸酯对微生物屏障免疫相互作用的影响奠定了基础。  

图文摘要      

论文ID

原名：Disrupted microbiota-barrier-immune interaction in phthalates-mediated barrier defect in the duodenum

译名：邻苯二甲酸酯会导致十二指肠屏障缺陷中的微生物群-屏障-免疫交互的破坏

期刊：Chemosphere

IF：8.943

发表时间：2022.9.1

第一作者：杨天宁

通讯作者：李金龙

通讯作者单位：东北农业大学动物医学学院

DOI号：10.1016/j.chemosphere.2022.136275    

实验设计

结果

1.DEHP诱导十二指肠组织病理学改变

如图1a所示，对照组鹌鹑的十二指肠绒毛呈现长指状，具有完整且整齐排列的绒毛和隐窝。然而，DEHP处理组的十二指肠隐窝稀疏，绒毛破裂、中空，显现出不同程度的炎性细胞浸润(图1a)。盲评法评估的结果显示DEHP治疗组的损伤严重程度升高(图1b)。与Vcon组相比，D250、D500和D750组的绒毛长度显著降低，而隐窝深度显著增加(图1c-d)。与Vcon组相比，绒毛长度与隐窝深度的比值显著降低(图1e)。

图1 鹌鹑十二指肠的组织学分析。(a) Con组、Vcon组、D250组、D500组和D750组鹌鹑十二指肠组织学分析。(b)鹌鹑十二指肠组织损伤的损伤严重程度等级。测量鹌鹑十二指肠的绒毛长度(c)、隐窝深度(d)和绒毛长度和隐窝深度的比值(e)。

2.DEHP诱导十二指肠的氧化应激

检测十二指肠中氧化应激的生物标志物。与Vcon组相比，DEHP处理组MDA含量、H2O2含量、GSH-Px活性和MPO含量明显增加，CAT活性、T-AOC水平、T-SOD活性、GSH/GSSG、GST活性和GCS含量显著降低(图2a-j)。DEHP处理后，Nrf2及其下游基因(GST、GCLC、GCLM、HO-1、CAT、SOD2、NQO1)的mRNA表达水平明显高于Vcon组(图2k)。通过相关分析，可以发现SOD2的增加不如其他基因明显(图2l)。因此，研究检测了Nrf2和SOD2的蛋白质水平。然后本研究发现在所有DEHP处理组中Nrf2均明显增加，并且在D750组中SOD2蛋白水平显著降低(图2m-o)。总之，DEHP导致氧化应激和抗氧化功能障碍的发展。

图2 DEHP对氧化应激反应和Nrf2信号通路的影响。(a) MDA含量。(b) H2O2含量。(c) CAT活性。(d) T-AOC水平。(e) T-SOD、SOD1和SOD2含量。(f) GSH/GSSG比率。(g) GST活性。(h) GSH-Px活性。(i) γ-GCS含量。(j) MPO含量。(k) Nrf2信号通路相对mRNA水平的热图。(l) Nrf2信号通路相对mRNA水平的相关性分析。(m-o)十二指肠中Nrf2和SOD2的相对蛋白质水平。

3.DEHP导致了十二指肠的紧密连接和肠道功能的破坏

为了证实除氧化应激外DEHP对十二指肠的损伤，我们检测了紧密连接蛋白、抗菌功能和相关的炎症介质作为十二指肠功能的评估。紧密连接处的蛋白质水平(Occludin和ZO-1)显著降低。在DEHP处理组中，除IRF1外，炎性细胞因子(IL-1β，TNF-α)的蛋白质水平显著增加。同时，D250组iNOS蛋白水平呈下降趋势，D500和D750组iNOS蛋白水平呈上升趋势(图3a-g)。ELISA结果显示，DEHP处理组IL-1β，IL-18和LPS含量明显增加。与Vcon组相比，LZM水平显著降低，ADA显著升高(图3h-l)。在mRNA水平，促炎细胞因子(nNOS、iNOS、eNOS，IL-1β、IL-18、IL-6、IL-8、TNF-α)增加，而抗炎细胞因子(IL-10)减少。AVBD(AvBD1、AvBD3)水平升高，紧密连接蛋白相关(ZO-1、ZO-2、Occludin、Claudin1)水平明显降低(图3m-n)。上述结果可能表明十二指肠抗菌和免疫功能受损，炎性反应正在发生。

图3 DEHP对十二指肠屏障和功能的影响。(a-g)紧密连接和细胞因子的相对蛋白质水平。(h-l)通过ELISA和试剂盒测定十二指肠的IL-1β、IL-18、LZM、ADA和LPS含量。(m)紧密连接、抗菌功能和细胞因子相关蛋白的相对mRNA水平的热图。(n)紧密连接、抗菌功能和细胞因子相对mRNA水平的相关性分析。

4.DEHP诱导十二指肠TLR4-NF-κB信号通路激活

本研究检测了TLR4-NF-κB通路，探讨DEHP是否可导致十二指肠炎症反应，以验证十二指肠LPS含量的升高。TLR4、p-p65和TRAF6的蛋白质水平显著增加，而DEHP处理组p-p65/p65和IκB/p-IκB明显升高(图4a-e)。qRT-PCR结果显示，与TLR4-NF-κB信号通路相关的mRNA水平(NF-κB、IRAK4、TAK1、RIP1、TIRAP、IRF7、TRAF6、TRAF3、TRAF2、TRIF、TRAM、MYD88、TLR4)在DEHP处理组中有不同程度的增加(图4f)；在PPI网络中揭示了与氧化应激，炎症和紧密连接相关的蛋白质。鹌鹑和小鼠中的这些已知蛋白质在功能上没有特别的同源性差异。在图中，具有不同颜色的边表示它们代表不同的相互作用，例如已知的相互作用，预测的相互作用等(图4g-h)。

图4 DEHP对TLR4/NF-κB信号通路的影响。(a-e) TLR4/NF-κB通路的相对蛋白水平。(f) TLR4/NF-κB相关蛋白相对mRNA水平的热图。(g-h) PPI分析。在Coturnix (g)和Mus musculus (h)中表达的蛋白质网络。

5.DEHP诱导十二指肠菌群的变化

我们对Vcon和D750组进行了16S rDNA高通量分析，因为LZM的异常减少可能表明十二指肠中的细菌分布可能发生了显著变化。质控分析和Qiime2过滤低质量标签后，结果显示12个样本中，平均每个样本有13857个有效标签，足以进行进一步的分类注释。Vcon和D750组中门(图5a)、属(图5b)和种(图5c)水平细菌成员的物种丰度图如图5所示。结果表明，Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Actinobacteria和Thermi是十二指肠微生物群中存在的主要门水平细菌，其中Proteobacteria和Bacteroidetes分别占所有细菌的35.8%和35.3%，并且是Vcon组的优势门(图5a)。与Vcon组相比，Proteobacteria的百分比增加了19.2%，但Bacteroidetes的百分比减少了6.8%。作为优势细菌属，Sediminibacterium(32.8%)和Lactobacillus(25.11%)的丰度百分比下降，而在D750中Bradyrhizobium(20.7%)和Methylovirgula(6.2%)增加(图5b)。LEfSe分析的LDA评分显示17个分类群明显影响D750组微生物群的生物学特征(图5d)。这17个分类群包括两个门(Firmicutes和Proteobacteria)、三个纲(Bacilli、Alpha Proteobacteria和Beta Proteobacteria)、三个目(Lactobacillales、Rhizobiales和Burkholderiales)、三个科(Leuconostocaceae、Beijerinckiaceae和Burkholderiaceae)、三个属(Weissella，Methylovirgula和Burkholderia)和三种细菌(Paramesenteroides、Iigni和Graminis)。LDA评分显示，与Vcon组相比，D750组的Ligni增加了15.3%，对照组中Paramesenteroides减少了10.5%，Graminis减少了7.8%(图5c-d)。

具体而言，DEHP引起十二指肠中Firmicutes、Actinobacteria、Proteobacteria和Bacteroidetes的物种和丰度的变化。Proteobacteria和Bacteroidetes之间的同源性很高，进化关系非常相似(图6a)。网络图显示了微生物群落之间可能的相互作用。微生物之间的联系越多，它们之间的相关性就越高。在有变化的门中，Proteobacteria显示出菌群变化之间的最大相关性。其中，细菌属Reyranella、Mesorhizobium、Sphmgomonas和Variovorax与其他丰度较高的细菌相关(图6b)。chao1代表的α多样性分析表明，DEHP大大增加了微生物种群的多样性(图6c)。基于NMDS的PCoA分析表明，十二指肠微生物群落Vcon和D750组之间的分布不集中，表明两组微生物β多样性存在差异(图6d)。功能预测的富集分析表明，DEHP诱导的微生物群落变化可能影响宿主的代谢、遗传信息处理功能、细胞过程甚至可能导致人类疾病。(图6e)。

图5 DEHP对鹌鹑从门到种的十二指肠微生物菌群的影响。(a)门水平的物种丰度图(TOP10)。(b)属水平物种丰度图(TOP 20)。(c)Vcon和D750组的十二指肠微生物群的LEfSe分析结果。(d)种水平的物种丰度图(TOP 20)。

图6 通过DEHP分析十二指肠微生物菌群的物种相关性和功能预测。(a)D750和Vcon组十二指肠微生物群的差异和相似性，采用层次聚类和样本距离的热图分析。(b)鹌鹑十二指肠微生物网络图。(c)chao1分析D750和Vcon组十二指肠微生物群α多样性。(d)NMDS分析D750和Vcon组十二指肠微生物群的β多样性。(e)十二指肠菌群功能预测分析。

讨论

邻苯二甲酸酯很容易从塑料产品中析出并释放到环境中，最终威胁环境安全和动物健康。据报道，大多数邻苯二甲酸酯都会引起多器官损伤并导致内分泌紊乱。然而，邻苯二甲酸酯对十二指肠损伤和鸟类细菌菌群调节的直接影响尚不清楚。这项研究证实了亚慢性剂量DEHP暴露引起的鹌鹑十二指肠屏障缺陷，以及抗氧化功能、微生物菌群、先天免疫调节和肠功能的损害。因此，本研究有助于评估邻苯二甲酸酯的十二指肠屏障毒性。

邻苯二甲酸酯可以共同破坏十二指肠微生物-屏障-免疫交互。这项研究表明，亚慢性暴露于DEHP可能导致鹌鹑十二指肠屏障缺陷。DEHP诱导紧密连接蛋白表达的减少。作为物理屏障，由上皮细胞组成的紧密连续的上皮细胞的肠上皮层。此外，DEHP还通过作为生物屏障的菌群紊乱导致抗微生物防御的破坏。除了更明显的种群多样性外，病原菌丰度的增加也可能导致宿主代谢和免疫功能的改变。与宿主-微生物组相互作用一起，屏障缺陷和过敏原暴露共同调节先天免疫反应。然后，通过配体激活TLR是触发细胞因子产生、炎症和适应性免疫的第一个分子事件。LPS的大量存在导致TLR4受体的激活。据报道，粘膜细胞因子促进粘膜屏障损伤和绒毛萎缩。此外，一旦粘膜屏障功能受到干扰，它也可能加剧炎性细胞因子的进一步过量产生。因此，我们的研究提供了亚慢性DEHP暴露激活氧化应激的证据，其协同由TLR4-NFκB途径引起的炎症反应。它促进了I-B和NF-B-p65的磷酸化，导致了鹌鹑十二指肠屏障缺陷和菌群紊乱。

图7 由邻苯二甲酸酯介导的微生物群-屏障-免疫交互破坏的示意图。

结论

亚慢性暴露于DEHP可导致鹌鹑十二指肠的屏障缺陷，其中十二指肠的损伤体现在绒毛长度与隐窝深度的比值和紧密连接蛋白的减少。DEHP还通过作为生物屏障的菌群失调导致了抗菌防御系统的崩溃，LPS的大量存在导致了TLR4受体的激活。此外，DEHP激活了氧化应激，协同TLR4-NFκB途径引起的炎症反应，促进了十二指肠的损伤。本研究为邻苯二甲酸酯对微生物群-屏障-免疫交互的影响提供了基础。