陈宝惠/邹炜团队发表LiveArt新技术实时监测和定量核糖体

在人细胞内，RNA聚合酶I (Pol I)专职介导上百个拷贝的核糖体RNA基因(rDNA)的转录，合成核糖体47S rRNA，进一步剪切加工成18S、5.8S和28S rRNA。这些RNA约占细胞总RNA的60%。核糖体RNA是组装核糖体大小亚基的重要组分。因此，Pol I的转录活性控制着核糖体的生成水平和细胞增殖、生长。Pol I转录紊乱会导致癌症和其他人类疾病。然而，目前仍旧缺乏实时监测和定量Pol I活性的方法。

2022年10月25日，《Journal of Cell Biology》在线刊登了浙江大学基础医学院/良渚实验室陈宝惠研究员-转化医学研究院邹炜研究员联合团队的学术论文“Real-time imaging of RNA polymerase I activity in living human cells”。该研究开发了LiveArt（live imaging-based analysis of rDNA transcription）技术，用于实时可视化和定量单个内源rDNA位点产生rRNA的动态变化。LiveArt技术能够动态追踪细胞有丝分裂过程中rDNA转录沉默与重新激活的全过程，首次揭示了间期rDNA的转录动力学和调控规律。该研究表明LiveArt作为 Pol I转录活性的活细胞报告系统，为筛选Pol I活性的调控因子以及靶向Pol I转录的抗肿瘤药物提供了高效的平台，并为深入研究核仁功能提供了一个新的可视化方法。

基于MS2/MCP系统的RNA标记技术已经被广泛地运用于RNA聚合酶II（Pol II）活性的定量成像。然而，Pol I的实时转录动态尚未有报道。其最大的挑战在于人的基因组大约有400个rDNA拷贝，很难实现在单个内源rDNA位点上去实时检测Pol I介导的转录动态变化。该研究结合MS2/MCP系统的RNA标记方法和CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过控制编辑效率和分离单细胞克隆的方法，分别建立了新生rRNA和成熟rRNA的可视化方法。

本研究结果表明：

1）LiveArt标记的rRNA定位于核仁内，其生成能被Pol I特异的抑制剂（例如CX-5461）阻断。

2）通过在3‘-ETS或ITS1区域插入MS2标签而标记的新生rRNA主要聚集于转录中心，而通过在5.8S区域插入MS2标签而标记的新生及成熟rRNA定位于核仁内的不同位点。

3）LiveArt可在单细胞水平上监测有丝分裂过程中rDNA先沉默再激活的过程。

4）LiveArt可灵敏地反应Pol I转录的上调和下调。因此，LiveArt技术可用于监测Pol I转录的实时变化。

现有的rRNA探针，例如J1，可结合核仁内所有rRNA, 其结合特异性有待提高。另外，这种标记方法无法用于对rDNA的实时转录水平进行定量。

LiveArt有两个显著的优点：

1）仅单个或低拷贝的rDNA所产生的rRNA被荧光标记；

2）通过分离单细胞克隆可获得rRNA稳定标记的细胞株。

因此，研究人员可以在不同条件下，长时间观测Pol I的转录动力学。此外，LiveArt的细胞株为筛选Pol I调控基因以及靶向Pol I的小分子药物提供了一个简单、高效的筛选平台。

本研究利用LiveArt技术进行了若干个探索：

1）通过对rDNA转录进行长达8小时的追踪，揭示了Pol I介导的rDNA转录呈现转录爆发模式(transcriptional bursting)并解析了其调控规律。

2）结合核仁结构的动态分析，发现rRNA对细胞分裂末期核仁重建以及细胞间期核仁形态的维持至关重要。

3）鉴定了SRFBP1蛋白作为调控Pol I转录的新作用。

4）完成了一个小规模的药物筛选，结果揭示LiveArt可作为高效筛选抗肿瘤小分子的新策略。

rRNA合成的异常增加被证明是肿瘤细胞快速增殖的重要分子基础。这一发现开辟了新的肿瘤治疗探索方向，即寻找选择性抑制Pol I转录的小分子药物。

靶向Pol I转录对肿瘤治疗理论上有两大好处：

1）Pol I只转录47S rRNA，不对其他RNA的转录产生干扰，因此有可能最大程度地避免副作用；

2）在大多数肿瘤类型里Pol I转录异常增高，因此Pol I的选择性抑制剂有治疗多种癌症的潜力。因此，LiveArt技术将有助于大大加快靶向Pol I抗肿瘤小分子的发现和研发。