重大发现 | 高密度CAR或将显著限制CAR-T疗效！附临床分析

引言

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法已成为一种有前途的癌症治疗工具，彻底改变了癌症免疫疗法。尽管缓解率很高，但并非每个患者在CAR-T细胞治疗后都能达到完全缓解（CR）。此外，大量患者会经历复发，特别是MM患者[1]。是什么影响了CAR-T细胞的临床疗效呢？

随着基因组学和基因调控网络的技术进步，如单细胞测序等，帮助我们在理解CAR-T细胞的基因组景观方面取得显著进展 [2]。

近日，来自纳瓦拉大学的团队的研究表明CAR密度在CAR-T活性中起着重要作用，对临床反应有着显著影响。 [4]。

作者 | 小鱼  

☆ 本文重点：

1. 1.  揭示了高、低表达CAR分子的CAR-T细胞之间的不同特征；

2. 2.   定义了与CAR密度相关的分子特征，用以预测临床反应；

3. 3.  高表达CAR的CAR-T细胞增加CAR信号，上调耗竭标志物，增加体外细胞毒性，减少体内BM浸润，限制CAR-T疗法的功效；

4. 4.  在不同的血液系统恶性肿瘤中，CARHighT水平升高的患者表现出明显较差的临床反应。

☆ 在此之前，我们已知影响CAR-T细胞功效的因素包括：  

1. 1. 外在因素，如抗原密度或肿瘤负荷信号；

2. 2. CAR结构相关的因素，如共刺激域或铰链长度；

3. 3. 内在细胞因子，如T细胞的分化状态，CD4 / CD8比率或T细胞多功能性；

4. 4. 具有耗竭表型的T细胞的增加可能导致CAR-T细胞的持久性降低，临床反应下降。

☆ 本文在此基础上做了以下几项工作：  

1. 1. 讨论CAR密度对B细胞成熟抗原（BCMA）CAR-T细胞功能的影响；

2. 2. 正式探讨CAR-T细胞膜中CAR分子的密度对临床疗效的影响。

以下附上正文详解：  

01  

CAR-T细胞表面的CAR密度影响CAR介导的信号传导  

目前的CAR-T细胞产物是使用逆转录病毒/慢病毒（LV）载体产生的，这些载体在细胞内产生不同水平的转导和转基因表达，从而观察到转导细胞表面上的各种不同的CAR分子密度（图1）。

图1：CAR-T细胞在膜表面呈现出不同的CAR密度

为了确定CAR密度是否会影响CAR介导的信号传导，从而影响CAR-T细胞功效。研究人员首先在Jurkat细胞中使用三重参数报告器（TPR）系统，通过流式细胞术测量CAR介导的主要信号通路的激活。Jurkat-TPR细胞靶向BCMA， 4-1BB作为共刺激结构域，用报告基因（EGFRt）进一步修饰，便于测量CAR水平（图2）。  

图2：CAR构建

然后，根据EGFRt的荧光强度(FI)区分不同水平CAR的Jurkat -TPR细胞亚群(称为CARHigh和CARLow细胞)(图3)。  

图3：CARHigh和CARLow细胞分群

并与表达不同BCMA的MM细胞系共培养后进行分析，我们观察到CAR内三种途径的激活水平显著增加（图4）。  

图4：CAR密度影响CAR介导的信号

02  

CAR密度影响靶向BCMA的CAR-T细胞的抗肿瘤反应  

为了进一步分析CAR密度对抗肿瘤功效的影响，表征了来自10个健康供体的CAR-T细胞，这些细胞采用BCMA靶向CAR构建体（来自ARI-0002h）共表达蓝色荧光蛋白（BFP）（图5）。  

图5：CAR构建  

基于BFP表达，将CAR-T细胞分选为CARHigh和CARLow细胞亚群（图6）。  

图6：分类示意图

CARHigh T细胞：细胞毒性活性增加，干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子-α（TNFα）和颗粒酶B（GZMB）的产生水平更高（图7）。  

图7：CARHighT和CARLow T细胞毒性活性和上清液中IFN-γ水平

接下来，研究人员分析了CAR的表型。观察CARHigh T和CARLow T细胞在用肿瘤细胞刺激之前和之后的表型变化，发现CARHighT细胞的基础激活增加，人白细胞抗原（HLA）-DR和CD137细胞的水平显著升高（图8E、F），以及表达两种或更多种耗竭标志物（LAG3，TIM3和/或PD1）组合的CD8+T细胞的百分比显著升高（图8G）。  

图8：CARHigh T细胞和CARLowT细胞耗竭表型比较

用肿瘤细胞连续重复体外刺激21天，发现CARHigh T细胞和CARLow T细胞分化和耗竭表型差异显著，并且CARHighT细胞损失严重（图9）。  

图9：CARHighT细胞和CARLow T细胞数量比较

总体而言，这些结果表明 CARHigh T细胞增加细胞毒性和CAR信号传导。此外，在CARHigh T细胞中观察到的分化和耗竭的表型更多，导致在刺激条件下体内抗肿瘤作用降低，这可能对临床反应产生影响。  

03  

CARHighT细胞显示出不同的转录组和染色质景观  

深入研究CAR-T细胞的两个亚群（CARHighT细胞和CARLow T细胞）的转录组和表观遗传景观，CARHigh T细胞显示出与淋巴细胞活化相关的基因（如HLA-DRA，CIITA和CD74）以及共刺激分子（如CTLA-4，TNFRSF4（OX40）和TNFRSF9（4-1BB）的表达增加（图10）。

图10：CARHighT细胞和CARLow T细胞基因表达定量分析

表现出差异和染色质可及性的基因主要与T细胞活化和共刺激有关（图11）。  

图11：UCSC基因组浏览器分析

总之，这些结果表明，与CAR水平升高相关的基因表达和染色质可及性的微小差异可以显著改变CAR-T细胞的整体表型和功能特征。  

04  

单细胞测序揭示了CARHigh T细胞的CAR特异性分布  

为了更好地了解CAR-T细胞的异质性以及CAR水平对其转录组学的影响，研究人员对来自三个独立生产的43981个CAR-T细胞进行了单细胞转录组分析。在质量控制和过滤后，研究人员进行综合分析，并确定了23个CAR-T细胞亚群集群。根据表型结果，研究人员鉴定出一个预先耗竭的CD8 CAR-T细胞簇，其特征在于细胞毒性基因的表达以及抑制性受体，如LAG3和TIGIT（图12）。  

图12：在单细胞水平上表征CAR-T细胞

1. 05

2. CAR密度与监管网络的差异激活有关

为了阐明CAR的分子调控机制，研究人员应用了SimiC，这是一种用于scRNA-seq数据的新型GRN推理算法，在共同推断每个特定细胞状态的GRN时施加相似性约束。SimiC的GRN分析提供了表型和功能差异背后的监管网络（图13）。  

图13：CAR密度与监管网络的差异激活有关

1. 06

2. CARHighT基因特征与临床反应相关

研究人员推断CAR密度可能对CAR-T细胞疗法在临床反应中产生影响。由图观察到，CD4+和CD8+CARHighT细胞在来自临床反应不佳的患者（PR/NR）中均显示出更高的分数（图14）。  

图14：CD4+和CD8+CARHigh T细胞特征评分

研究人员还评估了来自24名DLBCL患者的抗CD19 CAR-T输注产物的T细胞特征。发现，来自无反应患者（PR/NR）的输注产物显著富集CD8+CARHighT细胞，支持CAR密度与临床反应之间的相关性（图15）。  

图15：CD8+CARHighT细胞比例与临床反应

与严格意义完全缓解（sCR）的患者相比，部分缓解（PR）的患者CARHigh T细胞数量增加（图16）。  

图16：CARHighT细胞比例与临床反应

总体而言，我们的数据表明，在膜上具有高CAR密度的CAR-T治疗产品会对临床反应产生负面影响。  

总结与展望

CAR-T细胞的功能依赖于肿瘤和工程T细胞之间的相互作用。然而，作为活的药物，CAR T细胞是异质产物，其中内在和外在因素可以影响其功能，从而对其临床疗效产生显著影响。本文确定了影响CAR-T细胞功能的新决定因素——CAR表达水平。  

高水平的CAR表达与增强的CAR信号和细胞耗竭表型有关，其特征在于多种抑制性受体的表达，如PD1，CTLA4，LAG3，TIM3和TIGIT等，本文研究也表明在不同的血液系统恶性肿瘤中，CARHigh T水平升高的患者临床反应下降。  

如何防止CAR增加？  

使用生理启动子：大多数CAR-T构建体是使用具有强启动子的逆转录/ LV载体生成的。这些启动子诱发高水平的CAR表达，可导致CAR信号传导和过早耗竭。通过较弱的启动子以及通过更多的生理启动子减少基因表达，从而减少CAR信号传导。MND启动子的使用可以降低CAR表面密度，而EF1a启动子增加了其密度，导致细胞毒性活性增强，细胞因子产生增强和耗竭标志物表达。  

因此，使用生理启动子将防止CARHighT细胞增加，从而减少了CAR-T细胞的衰竭，有利于维持长期持久的抗肿瘤功效。  

如何正确识别CAR？  

对CD4+和CD8+ CAR-T细胞的转录组学分析，研究人员定义了与CAR密度增加相关的分子特征，该特征与细胞表面CAR水平的相关性高于RNA水平。单细胞数据进行GRN分析，识别与CAR-T细胞耗尽相关的关键区域。  

总之， CAR密度在CAR-T活性中起着重要作用，对临床反应有影响。此外，在单细胞水平上理解CAR密度驱动的调节机制，可以用于改进CAR-T疗法。最后，CAR密度增加相关的基因特征有望预测患者对CAR-T细胞治疗的反应。  

参考文献  

1. Berdeja, Jesus G et al. “Ciltacabtagene autoleucel, a B-cell maturation antigen-directed chimeric antigen receptor T-cell therapy in patients with relapsed or refractory multiple myeloma (CARTITUDE-1): a phase 1b/2 open-label study.” Lancet (London, England) vol. 398,10297 (2021): 314-324. doi:10.1016/S0140-6736(21)00933-8  

2. Chen, Gregory M et al. “Integrative Bulk and Single-Cell Profiling of Premanufacture T-cell Populations Reveals Factors Mediating Long-Term Persistence of CAR T-cell Therapy.” Cancer discovery vol. 11,9 (2021): 2186-2199. doi:10.1158/2159-8290.CD-20-1677  

3. Deng, Qing et al. “Characteristics of anti-CD19 CAR T cell infusion products associated with efficacy and toxicity in patients with large B cell lymphomas.” Nature medicine vol. 26,12 (2020): 1878-1887. doi:10.1038/s41591-020-1061-7  

4. Rodriguez-Marquez, Paula et al. “CAR density influences antitumoral efficacy of BCMA CAR T cells and correlates with clinical outcome.” Science advances vol. 8,39 (2022): eabo0514. doi:10.1126/sciadv.abo0514