科研丨北京协和医院: 支气管肺发育不良早产儿细胞因子和肠道菌群的变化(国人佳作)

编译：微科盟北岸，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

支气管肺发育不良(BPD)是发生在早产儿中的一种破坏性慢性肺部疾病。推测BPD是由异常炎症反应引起的，这与共生菌群的组成有关，因此我们假设肠道菌群可能通过炎症反应影响BPD易感性。本研究旨在检测BPD患者的细胞因子和粪便肠道微生物组成的差异。2018年6月至2020年6月，招募了胎龄 ≤ 30周出生的早产儿。收集婴儿临床特征资料。在出生后第3-7天和14-28天，收集新鲜粪便样本和血清。通过16S rRNA测序检测BPD组和对照组的肠道微生物群组成。在第3-7天和第14-28天，血清中检测到10种细胞因子，包括IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13、IFN-γ和TNF-α。本研究纳入了38名早产儿；BPD组和对照组的早产儿数量分别为18例和20例。BPD组的胎龄(27.4 ± 1.5周vs. 29.5 ± 0.9周，p = 0.000)和出生体重(971 ± 240克vs. 1262 ± 335克，p = 0.000)均低于对照组。本研究发现BPD组的IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8和TNF-α水平较高，而IL-10水平较低。BPD组的Shannon多样性指数较低。BPD组变形菌门的相对丰度在第3-7天到第14 - 28天期间显著增加，而厚壁菌门则减少。在第14-28天，BPD组的变形菌门相对丰度显著高于对照组，而厚壁菌门则较低。支气管肺发育不良可通过炎症反应受到肠道微生物群的影响。对于BPD婴儿中细胞因子和微生物组的失衡以及益生菌是否可以逆转这种失衡还需要更多的研究。本研究为BPD的治疗提供了一个新的视角。  

论文ID

原名：The Change of Cytokines and Gut Microbiome in Preterm Infants for Bronchopulmonary Dysplasia

译名：支气管肺发育不良早产儿细胞因子和肠道菌群的变化

期刊：Frontiers in Microbiology

IF：6.064

发表时间：2022.3

通讯作者：李正红，万伟琳

通讯作者单位：中国医学科学院北京协和医学院，北京协和医院

DOI号：10.3389/fmicb.2022.804887

实验设计

结果

1 基线数据

从2018年6月到2020年6月，我院共出生胎龄≤ 30周的早产儿42例。由于残余血清细胞因子检测不足，排除了4例早产儿。本研究共纳入38名早产儿；BPD组和对照组的早产儿数量分别为18例和20例。无小胎龄早产儿。肠内喂养开始时间为出生后12小时内。因为研究人员的医院没有母乳库，所以所有早产儿都是母乳喂养。

BPD组的胎龄(27.4 ± 1.5周)低于对照组(29.5 ± 0.9周)(p = 0.000)。BPD组的出生体重(971 ± 240克)低于对照组(1262 ± 335克)(p = 0.000)。从表1和表2可以看出，BPD组PDA的发病率较高；BPD组的机械通气时间和住院时间均显著高于对照组。本研究采用Logistic回归分析。以胎龄、出生体重和PDA为自变量。数据显示，胎龄 < 28周(OR = 5.528，p = 0.000)和出生体重 < 1000克(OR = 3.416，p= 0.037)是BPD的高风险因素。

表1 BPD组和对照组婴儿的基本特征。

表2 BPD组和对照组产妇的基本特征。

2 炎性细胞因子

从76份血样中检测了760次细胞因子。检测到的10种细胞因子包括IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13、IFN-γ和TNF-α(见表3)。在第1-7天，BPD组和对照组之间没有显著差异。在第14-28天，BPD组的IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8和TNF-α显著升高，而IL-10则降低(表3)。

表3 患者的细胞因子。

3  支气管肺发育不良 婴儿与对照组微生物组的Shannon多样性

BPD组(M(P25-P75)，3.41(3.14-3.87))在第3-7天的Shannon微生物多样性低于对照组(4.38(4.25-4.68))(p = 0.00)。BPD(3.71(3.34 - 3.83))组在第14 - 28天的Shannon微生物多样性低于对照组(4.58(4.35 - 5.11))(p = 0.00)。

4 支气管肺发育不良婴儿与对照组的微生物组进化差异

图1显示了第3 - 7天和第14 - 28天两组主要菌群在门水平上(前10)的平均相对丰度。在第3 - 7天和第14 - 28天，两组的粪便微生物群均以四个菌门(变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门)为主。

使用双向方差分析比较不同组之间整体微生物组的组成。结果发现：第3 - 7天BPD组与第14 - 28天BPD组有显著性差异(p = 0.03)；第14 - 28天BPD组与第14 - 28天对照组相比有显著性差异(p < 0.001)。用t检验分析两组间门水平微生物的差异。BPD组的变形菌门相对丰度从第3 - 7天到第14 - 28天显著增加(53.9 vs. 80.1%，p = 0.032)。相反，对照组的变形菌门相对丰度从第3 - 7天到第14 - 28天下降，但不显著(72.9 vs. 47.7%，p > 0.05)。BPD组厚壁菌门的相对丰度从第3 - 7天到第14 - 28天显著降低(45 vs. 16.7%，p = 0.021)。相反，对照组厚壁菌门的相对丰度从第3 - 7天到第14 - 28天增加，但不显著(23.4 vs. 41.2%，p > 0.05)。在第3 - 7天，BPD组和对照组之间的微生物组没有发现显著差异。在第14 - 28天，BPD组的变形菌门相对丰度显著高于对照组(80.1 vs. 47.7%，p = 0.001)，BPD组的厚壁菌门相对丰度显著低于对照组(16.7 vs. 41.2%，p = 0.016)。

图2显示了两组在属分类水平上主要微生物(前10)的平均相对丰度。用t检验分析组间属水平微生物的差异。第14 - 28天BPD组和对照组的肠球菌属(Enterococcus)相对丰度分别为41.1%和52.4%。差异有统计学意义(p= 0.049)。本研究发现，BPD组在第14 - 28天肠球菌属的相对丰度较低。图3显示了每个婴儿在门分类水平上主要微生物(前10)的平均相对丰度。

图1 第3-7天和第14-28天，两组在门分类水平上的主要微生物(前10)的平均相对丰度。

图2 两组在属分类水平上主要微生物(前10)的平均相对丰度。

图3 在门水平上，每个婴儿主要微生物(前10)的平均相对丰度。BPD.A：在第3 - 7天患有BPD的婴儿。BPD.B：在第14 - 28天患有BPD的婴儿。对照A：第3 - 7天无BPD的婴儿。对照B：第14 - 28天无BPD的婴儿。

讨论

在首次描述BPD 50多年后，BPD仍然是早产儿严重的肺部并发症。它被认为涉及呼吸机和氧气对未成熟肺的损伤，导致炎症反应，最终导致血管生成和肺泡增生失调的异常肺发育。这种最常见的慢性肺部疾病有显著的发病率和死亡率。过去的研究和我们之前的研究已经清楚地表明，炎症反应和细胞因子的形成与BPD的发生有关。现在有大量证据表明，肠道微生物群可能会影响全身免疫和炎症，包括肺部。

然而，目前尚不清楚肠道菌群是否影响BPD的易感性。为了研究肠道菌群的变化是否与BPD有关，我们使用16S rRNA基因测序分析了从38名胎龄 < 30周早产儿中收集的粪便菌群组成。本研究检测了BPD早产儿细胞因子和肠道微生物群的变化。

胎龄和出生体重是影响BPD发展的最重要因素之一。在本研究中，BPD组的胎龄和出生体重均低于对照组，而PDA的发生率在BPD组较高。PDA可延长出生后机械通气时间。严重的左向右分流可导致肺充血和水肿，从而加重肺血管损伤和肺部炎症。

支气管肺发育不良与体内促炎症因子失衡有关。大量促炎症因子被释放，加重未成熟肺的损伤，导致BPD。本研究发现，BPD组的细胞因子IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8和TNF-α在第14-28天显著升高，而IL-10则降低。在之前的研究中，BPD婴儿的羊水、脐带血和气管吸出物样本中的IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10细胞因子水平发生了改变。因此，本研究推测这些细胞因子可能与BPD婴儿的肺损伤有关。细胞因子在不同时间点动态变化。这些细胞因子在早期基本相同，但在晚期有明显变化。

本研究发现，BPD组的机械通气持续时间明显更长。机械通气引起中性粒细胞和巨噬细胞涌入肺泡。这些细胞产生的细胞因子会破坏肺部发育，增加BPD的风险。患有BPD的婴儿气管吸入物和血液中的促炎症细胞因子(IL-1β、IL-6和IL-8)持续升高。在早产羔羊中，2小时的机械通气可引发肺部炎症，导致IL-1β、IL-6和IL-8的类似上调，这些生物标志物与机械通气婴儿相同。早产羔羊的长时间机械通气(3-4周)增加了中性粒细胞和巨噬细胞向肺部的浸润，导致不均匀的充气模式和异常的肺血管发育，这与死于BPD的婴儿相似。

越来越多的证据支持“肠-肺轴”理论，该理论认为肠道微生物群与肺内稳态之间存在潜在联系。本研究发现，患有和未患BPD的婴儿的肠道微生物群落Shannon多样性指数存在显著差异。高Shannon指数值通常反映了群落物种丰富且分布相对均匀，而低Shannon指数值通常反映了该群落的物种丰度较低，可能由少数优势类群所主导。图4、图5显示了两组之间Shannon多样性指数的差异。Shannon指数显示BPD患儿的微生物群落多样性和物种数量显著下降。这种多样性的差异在婴儿中表现出明显的数量差异，这可能是BPD发展的预测，实际上可能与机制有关。

图4 第3-7天，BPD组和对照组之间Shannon微生物多样性比较。Shannon指数(M(P25-P75)：3.41(3.14 - 3.87)vs. 4.38(4.25 - 4.68)，p = 0.00)。

图5 第14-28天，BPD组和对照组之间Shannon微生物多样性比较。Shannon指数(M(P25-P75)：3.71(3.34 - 3.83)vs. 4.58(4.35 - 5.11)，p = 0.00)。

早产儿，尤其是极低出生体重早产儿，在健康微生物群的发育中处于不利地位。事实证明，早产儿肠道微生物群降低了微生物的多样性，增加了病原微生物的定殖。此外，早产儿肠道微生物组的稳定性低于足月婴儿。先前的研究表明，放线菌门、变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门是早产儿肠道的四个主要菌门。根据对肠道菌群的分析，这四个门也是患者肠道的优势菌群。研究人员注意到，在第14 - 28天，BPD组的变形菌门数量较多，厚壁菌门数量较少，差异具有统计学意义。相比之下，未患BPD的婴儿的微生物群仍然相对稳定且有弹性，而优势物种保持不变。对照组的微生物多样性和物种数量仍然很高。正如其他研究所指出的那样，该研究结果表明，微生物的多样性与健康状况有关。

在疾病组和健康组的微生物群对比研究中，疾病组中变形菌门的丰度普遍增加。也有人认为，变形菌门的高丰度代表了微生物失调的物特征，反映了肠道微生物群落结构的不稳定。似乎肠道微生物组在病程早期的改变可能与BPD的发展有关。

微生物群的生态变化与人体其他系统炎症的增加有关。成人和早产儿肠道中微生物组的获取和组成的特定模式以及上皮屏障功能的改变与炎症有关。然而，由于早产儿的免疫系统仍处于发展阶段，简单的细菌定植可能足以驱动炎症反应，破坏肺部发育，并导致BPD。另一方面，可能存在潜在的益生菌，这些益生菌对维持肺生理稳态具有重要意义。本研究的数据显示出临床应用的潜力。

本研究假设微生物组可能通过细胞因子影响BPD；因此，推测益生菌可以通过恢复微生物组成来缓解BPD。在一项体外研究中，益生菌双歧杆菌和乳杆菌显著抑制了变形菌门的数量，增加了拟杆菌门和放线菌门的数量。此外，益生菌抑制小鼠体内IL-4的表达，但抑制了Th2细胞的激活。它们还可以增加Treg细胞分化，如IL-10的表达。此外，它们还抑制活化巨噬细胞中TNF-α的表达。在另一项研究中，联合益生菌(含L. plantarum 20%、B. longum 40%和B. bifidum 40%)治疗可显著增加早产儿厚壁菌门的丰度，而变形菌门丰度显著降低，同时伴有IL-6的降低。因此，我们假设微生物组可能通过细胞因子影响BPD。与本研究BPD组细胞因子和微生物组的变化相比，益生菌可诱导完全相反的变化。因此可以假设，益生菌可以逆转BPD婴儿体内细胞因子和微生物组的失衡。

本研究存在几个局限性。由于这一生命阶段的肠道菌群不稳定，我们关注了少量婴儿(n = 38)和许多重复样本，以评估肠道菌群的变化是否与BPD有关。样本量限制了数据的统计能力，现在需要更大样本量的进一步研究来证实此研究的发现。由于本研究的样本量相对有限，我们没有评估微生物群和BPD亚型之间的关系。此外，所有婴儿都来自同一家医院的新生儿重症监护室，这可能是一些常见微生物的来源。在更大的多中心研究中重现本研究的发现是下一步的关键。最后，我们假设微生物组可能通过细胞因子影响BPD，需要更多的研究来验证这一观点。

结论

支气管肺发育不良是多种因素综合作用的结果。BPD组的胎龄和出生体重均低于对照组。本研究发现BPD组的IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8和TNF-α水平较高，而IL-10水平降低。BPD组的Shannon多样性指数较低。BPD组的变形菌门相对丰度从第3 - 7天到第14 - 28天显著增加，而厚壁菌门相对丰度降低。在第14 - 28天，BPD组的变形菌门相对丰度显著高于对照组，而厚壁菌门则较低。对于BPD婴儿中细胞因子和微生物组的失衡以及益生菌是否可以逆转这种失衡还需要更多的研究。本研究为BPD的治疗提供了一个新的视角。

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