泌尿系统疾病背景下的膀胱微生物组——是否存在间质性膀胱炎的生物标志物潜力？

Bschleipfer T, Karl I. Bladder Microbiome in the Context of Urological Disorders-Is There a Biomarker Potential for Interstitial Cystitis? Diagnostics (Basel). 2022 Jan 22;12(2):281. doi: 10.3390/diagnostics12020281. PMID: 35204374; PMCID: PMC8870776.

泌尿系统疾病背景下的膀胱微生物组——是否存在间质性膀胱炎的生物标志物潜力？

自现代培养和测序技术的发展以来，人类微生物组日益成为科学关注的焦点。即使在膀胱中，长期以来被认为是无菌生态位，现在已经证明了高度可变和复杂的微生物定植。特别是在间质性膀胱炎等疾病的背景下，其病因在很大程度上是未知的，其诊断是基于排除可混淆疾病的过程，科学希望获得对病因和诊断的深远见解，包括识别潜在的生物标志物。虽然对于功能障碍，如急迫性尿失禁和膀胱过度活动综合征，已经证明了微生物多样性减少与症状增加之间的初步关联，以及特定微生物（如乳酸杆菌或变形杆菌）丰度的变化，但间质性膀胱炎的研究显示出相互矛盾的结果，并且未能确定明确区分尿微生物组的假定生物体或泌尿类型。 来自健康对照组的IC / BPS患者。因此，目前，对膀胱微生物组及其对泌尿系统疾病潜在影响的新见解还不能用于阐明可能的病因，以及用于诊断或预后目的的生物标志物。进一步的研究应主要侧重于统一的程序和检测方法，以实现更好的结果可比性，并增加发现隐藏模式的可能性。

1. 简介

最近，分子生物学技术和培养方法的进步使人类微生物组的研究变得越来越重要，并促进了人体几个物理区域中特定微生物组的定义。在健康状态下，人类会携带多种微生物，包括细菌、真菌、病毒和原生动物[ 1 ， 2 ]。现在人们普遍认识到，特定疾病状态与微生物组的改变之间存在关联，微生物组控制着健康和疾病的各种生理过程[ 2 ， 3 ， 4 ， 5 ， 6 ]。然而，尽管大量研究已经充分探讨了特定疾病状态与皮肤、胃、结肠和肠道微生物组变化的作用，但尿路长期以来被认为是无菌的[ 7 ， 8 ， 9 ]。然而，由于最近的发现，现在很明显，即使在健康状态下，膀胱也不代表无菌生态位[ 10 ， 11，12 ]，这一点从根本上改变了我们对细菌在尿路中的作用以及我们对泌尿生殖系统健康的看法[ 13 ].虽然膀胱微生物组的确切功能仍有待阐明，但许多研究结果表明，泌尿微生物组的改变，无论是特定微生物的丰度还是整体多样性，都可能是下尿路各种功能障碍的触发因素、放大器或可能的连接因素 。

IC/BPS是一种病因不明的疾病，表现为间歇性或慢性盆腔疼痛/膀胱痛和下尿路症状，如无尿路感染时的频率和尿急，但未证实[ 16 ， 17 ]以病例数衡量，间质性膀胱炎（IC）根据定义属于欧洲罕见疾病（孤儿病），患病率为<5/10，000居民。女性IC/BPS患者的患病率为52-500/100，000，女性患者受累的发生率约为男性患者的9倍，其中IC/BPS的发生率约为8-41/100，000人 。症状本身可能伴有或不伴有膀胱镜和/或组织学上可检测到的膀胱疾病典型变化。在Hunner型中，膀胱镜检查可发现清晰的病变，而在更常见的非Hunner型中，没有明显可检测到的病变 。

迄今为止，IC/BPS的发病机制和病因在很大程度上是未知的，多种混杂因素使其成为排除性诊断[ 16 ]。针对膀胱壁GAG层结构改变和尿路上皮通透性、神经内分泌通路上调、自身免疫、膀胱敏感性中枢失调伴中枢神经系统（尤其是交感神经系统）和感觉神经支配改变、细胞因子介导的炎症反应和肥大细胞活化 ，在这种情况下，即使是基于微生物组的病因也从未被排除为IC / BPS的机制。因此，在过去几年中，越来越多的研究试图检测特定的模式，甚至是特定的细菌或微生物，这些模式可能是IC / BPS疾病症状的病因，并可能作为诊断中的生物标志物获得重要意义。

因此，除了对先前关于人类膀胱微生物组的发现以及与下尿路症状学的可能关联的总体概述外，在本叙述性综述中，我们特别旨在全面总结先前关于微生物组变化的发现，特别是在IC / BPS患者中，并评估其作为生物标志物的潜在适用性用于诊断目的。

2. 人类泌尿微生物组

2.1. 尿液微生物组测定的现代方法

标准尿培养仅用于检测最常见、生长快速的需氧尿路病原体，如大肠杆菌[ 11 ]。厌氧细菌，需要特定营养物质且生长缓慢的细菌，数量很少（每毫升<103个菌落形成单位），或嵌入生物膜中。然而，常规标准尿培养无法检测到这些疾病[ 25 ]。只有使用NGS应用非培养物非依赖性宏基因组分析，或结合质谱增强定量尿培养（EQUC），才能更全面地评估膀胱内的微生物，并快速推进泌尿微生物组知识[ 10 ， 11 ， 12 ]。

NGS技术可以基于扩增子测序和鸟枪测序。扩增子测序包括基于PCR的分析，重点是标记基因，例如16S rRNA亚基，以确定不同细菌物种之间的进化距离和高度保守的区域间序列，用于引物设计[ 11 ， 26 ]。作为所有基于DNA的生命形式的转录机制的高度保守的组成部分[ 27 ]，并且足够大，具有足够的种间多态性以提供区分和统计学上有效的测量[ 28 ]，16S rRNA基因非常适合作为靶基因对含有多种不同物种的样品进行测序。此外，16S rRNA基因在细菌中是通用的;因此，可以测量所有细菌之间的关系，并且可以可靠地揭示分类学和进化关联[ 29 ， 30 ]。相比之下，鸟枪法测序基于各种样本中的全微生物组测序。除细菌成分外，还可以记录病毒或真菌[ 31 ]。

为了克服基于DNA测序的方法的一个局限性，即无法显示已鉴定细菌的活力，还开发了扩展的定量尿培养（EQUC，[ 32 ， 33 ]）。通过这种改良的培养方案，包括接种更大和可变体积的尿液，在不同的大气条件（包括好氧和厌氧条件）下孵育，以及更长的孵育时间[ 32 ， 33 ]，可以培养通过16S rRNA基因测序鉴定的尿液中的大谱微生物。由于高达92%的物种无法通过标准尿液培养检测到，并且培养的属与测序的细菌DNA之间有80%的一致性[ 10 ]，该方法为微生物组研究提供了另一个极好的基础。

2.2. 复杂多变：健康的人类泌尿微生物组

在检测和表征人体微生物定植的新技术和最先进的技术的帮助下，已经重申了对膀胱中预先建立的无菌概念的排斥。尽管尿液中的微生物群数量较少（例如，与面部相比，~1/10集落形成单位（CFU）/mL[ 34 ]），并且不如身体其他部位的微生物群多样化，但目前已报道了多种微生物和细菌用于尿液微生物组[ 35 ]。在健康尿液微生物组中鉴定出的许多分类群包括通常称为生长缓慢的微生物的物种，这些微生物需要特定的环境条件[ 12 ， 15 ]。它们主要属于五大门：厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、梭菌门和变形杆菌属[36]，男性和女性均常见于乳酸杆菌属、棒状杆菌属、普雷沃氏菌属、加德纳菌属、葡萄球菌属、放线菌属和链球菌属[ 10 ， 34 ，35， 37 ， 38 ， 39 ， 40 ， 41 ]。

然而，这种粗略描述的核心微生物组并没有开始包含人类膀胱微生物群可以检测到的丰度和多样性的真正个体性、复杂性和变异性。例如，一项研究报告了多达321种不同的属，可以在培养阴性患者的样本中检测到[ 12 ];然而，在绝大多数研究中，检测到的不同物种的数量要少得多。此外，一些研究表明，男性和女性的泌尿微生物组存在差异[ 35 ， 37 ， 40 ， 42 ， 43 ]。一般而言，女性的微生物组多样性似乎更具异质性，放线菌和拟杆菌门的发生率增加[ 35 ， 40 ]。相比之下，另一项研究显示，男性和女性的α多样性（样本内）无显著差异，但β多样性（样本间）存在显著差异[ 42 ]。在属水平上比较，雌性样本中乳酸杆菌和普雷沃氏菌的丰度最高，而在雄性中，链球菌、韦洛氏菌、葡萄球菌、加德纳菌、肠杆菌属、奈瑟菌、嗜血杆菌和棒状杆菌占主导地位[41， 42，44 ]。此外，随着年龄的增长，女性乳酸杆菌、双歧杆菌、梭菌或芽孢杆菌的相对丰度降低[ 39 ， 45，46 ]，进入绝经期后，Mobiluncus、Oligella或卟啉单胞菌的相对丰度同时增加[ 45 ]。有趣的是，Jonquetella、Parvimonas、嗜蛋白菌和酵母菌仅在70岁以上的男性和女性中发现[ 40 ]。

3. 膀胱微生物组和泌尿系统疾病

现在，近年来无菌膀胱的旧教条终于垮台，泌尿道中也接受了多种微生物细菌群落的存在，一个新的、广阔的研究领域已经打开。与人体的其他部位不同，泌尿道细菌在健康和泌尿生殖系统疾病中的作用在很大程度上是未知的。在此背景下，近年来已经开展了几项研究，以调查特定疾病或症状背景下特定微生物的存在或微生物组组成的改变之间的可能相关性[ 7 ， 8，47 ， 48 ， 49 ]。

3.1. UUI 和 OAB 中膀胱微生物组的改变

尽管个体样本的多样性和丰富度差异很大[49]，但在UUI患者中发现，较高的症状严重程度（以较高的UDI评分和较高的急迫性尿失禁发作百分比衡量）与较低的微生物多样性之间存在显著关联[ 34 ， 49 ]。虽然从两个队列中分离出乳酸杆菌，但与UUI女性相比，健康女性表现出更多的乳酸杆菌序列。此外，在物种水平上也存在差异，UUI队列中更常检测到加氏乳杆菌，对照组最常检测到脆乳杆菌[ 34 ， 50，51 ]。这两种物种也经常出现在阴道微生物群中，并且都被认为在这个生态位中具有保护作用。这一发现表明，这两种物种在膀胱中起着不同的作用[ 34 ]。在UUI女性中，先前与UTI相关的特定细菌（Alteromonadaceae属、狭窄滋养单胞菌属、短单胞菌属、Elizabethkingia属和甲基杆菌属[52， 53 ，54， 55， 56 ]）也被发现在UUI女性中丰度增加[ 49 ]，表明细菌的持续低度感染是导致UUI刺激症状的原因，至少对某些人来说是这样。

症状学和膀胱微生物组改变的关联也见于膀胱过度活动症 （OAB）。基于加权UniFrac距离度量，可以检测到OAB和对照组的显著差异细菌群落[ 57 ]。在OAB组中，有13个属代表性不足，即普雷沃氏菌属、二甲菌属、梭杆菌属、琼克氏菌属、弯曲杆菌属、细金菌属、厌氧球菌属、乳酸杆菌属、锥体杆菌属、解脲支原体属、肠球菌属、新鞘膜菌属和乳球菌属。 相比之下，OAB组中有7个属代表性过高，即Sneathia，Staphylococcus，Proteus，Helcoccus，Gemella，Mycoplasma和Aerococcus。特别是，OAB女性中乳酸杆菌DNA的检测频率较低[ 58 ]，以及变形杆菌（一种具有许多泌尿致病物种的属）的聚集存在[ 59 ]，在另外的研究中再次得到证实。

3.2. 膀胱微生物组改变与 IC/BPS 之间关联的相互矛盾的证据

由于病因发病机制基本不明确、症状多变以及易混淆疾病的多样性，间质性膀胱炎的诊断迄今为止一直基于排除过程[ 16 ， 17 ]，这使得受累患者的早期识别和治疗变得困难。因此，膀胱微生物组在泌尿系统症状（也发生在间质性膀胱炎）背景下的当前和初步发现也集中在可能识别触发因素，病因学基础，但也关注基于IC / BPS背景下微生物组的潜在新诊断，预后或预测生物标志物。

Siddiqui及其同事[ 60 ]对间质性膀胱炎女性的清洁中段尿液进行了高通量测序分析。与历史对照组（先前研究的数据[ 36 ]）相比，作者能够显示两组之间微生物谱的分类组成，丰富度和多样性的显着差异。在IC尿液中鉴定出的属总数大幅减少（健康女性为31属，而健康女性为45属），并且通过稀疏分析，OTU的数量，香农指数和逆辛普森指数估计表明，与健康女性相比，IC / BPS样本的整体丰富度和生态多样性显着下降。此外，普雷沃氏菌和加德纳菌的丰度减少，IC / BPS患者专门鉴定的四个属（肠球菌，Atopobium，变形杆菌和克罗诺杆菌），一组仅在健康女性尿液中相关的17属，有趣的是，间质性膀胱炎样本中乳酸杆菌的显着增加表明IC / BPS患者微生物群的结构转变。

Abernethy等人[ 61 ]通过对40名参与者的导尿进行测序来进行横断面研究。与Siddiqui等人相似[ 60 ]，与对照组相比，间质性膀胱炎女性表现出更少的微生物多样性和更少的明显操作分类单位。然而，与上述研究有很大不同，研究人员发现间质性膀胱炎女性的尿液不太可能含有乳酸杆菌属，特别是嗜酸乳杆菌。此外，这项研究还证明了嗜酸乳杆菌的存在与间质性膀胱炎症状指数和女性泌尿生殖系统疼痛指数的较低分数之间的关联。与已知的嗜酸乳杆菌抗炎作用[62， 63 ，64]可能存在相关性，或者乳酸杆菌的整体保护作用（与阴道环境类似[ 65 ]）是否对记录的模式具有重要意义，目前仍难以捉摸。

在一项更大的研究中，有181名患有IC/BPS的女性和182名女性对照参与者参加了美国国立卫生研究院（NIH）慢性盆腔疼痛研究（MAPP）研究网络的多学科方法[ 66 ]，对92个检测到的物种（41属）中的大多数物种（41属）的相对丰度的分析无法证明两个队列内的显着差异。然而，在物种水平上，在健康对照组中，间质性膀胱炎和嗜酸乳杆菌的参与者中，约翰氏乳杆菌和加氏乳杆菌的丰度更高，而在属水平上，棒状杆菌的相对丰度显着更高。在控件中可以检测到。此外，29种，包括被认为具有潜在泌尿致病性的细菌（如大肠杆菌、奇异变形杆菌和铜绿假单胞菌），以及潜在毒性生物（如土拉弗朗西斯菌、猪鼻支原体、肝螺旋杆菌、产气荚膜梭菌和都柏林念珠菌），可以在IC/BPS患者的尿液中独家验证。

此外，Xu等人[ 67 ]能够证明几个属的转变，沙雷氏菌，短杆菌，卟啉单胞菌和柠檬酸杆菌的代表过多，以及随之而来的代表性不足的塞内加尔，Howardella，Gemella，Dialister，Moheibacter，Sphingobium，Fastidiosipila，Megasphaera，Thermovum， IC/BPS 队列样本中的分枝杆菌和阿托博菌。在家族水平上，乳酸杆菌科在IC/BPS中的丰度显着降低。香农指数和辛普森指数缺少显著性，同时ace和Chao1指数较低，表明IC/BPS中微生物丰度总体较低，但两组之间的多样性没有显著差异。

另一方面，也有研究无法证明间质性膀胱炎与泌尿微生物组改变之间存在任何相关性。在Meriwether等人对绝经前妇女进行的一项研究中[ 68 ]，IC/BPS和未受影响的女性在尿液和阴道样本中的Chao1和Simpson指数相似。此外，加权和未加权的UniFrac分析显示两组之间没有差异。相比之下，患有间质性膀胱炎的女性的阴道和泌尿微生物组之间存在更强的相关性，研究人员将这一事实归因于膀胱上皮功能的改变。Bresler等人[ 69 ]也未能证明间质性膀胱炎背景下尿液微生物组的明显显着差异。在他的前瞻性病例对照研究中，有21名IC/BPS女性和20名无症状对照，尽管通过经过验证的EQUC、对照尿液、IC/BPS阴道拭子和IC/BPS扩展了16S rRNA分析，但尿液没有显着差异。仅在物种水平上，可以证明对照组尿液中卢格杜氏葡萄球菌和无乳链球菌的频率略高，并且IC / BPS患者中大肠杆菌的发生率增加。最后，即使是Jacobs等人[ 70 ]的结果也不能得出结论，膀胱微生物组改变与IC疾病之间存在联系。仅在受影响参与者的尿液中观察到链球菌的检测，这也与不太严重的症状相关，很难解释。然而，这项研究的一个重要观察结果是，排尿和导尿样本之间存在很大差异，尿样中检测到的生物量增加了10，000倍。这证实了排尿不能准确代表膀胱微生物群，并且使用排尿样本描述膀胱微生物组会导致假阳性率显着增加。

上述UUI，OAB和IC / BPS的微生物组变化模式概述总结在 表 1 .应该注意的是，所描述的模式不能代表对膀胱微生物组的完整分析，因为迄今为止进行的研究很少，微生物组测定方法尚未遵循统一的指南。此外，膀胱微生物组的巨大个体、性别依赖性和年龄依赖性变异性限制了描述重要模式的能力。

3.3. 亨纳病变中没有基于微生物组的病因

在诊断为间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征的患者中，约10%-20%可检出所谓的HLs[ 71 ， 72 ， 73 ]。这些病变的病因从未明确描述过，表现为“局限性”、黏膜发红的炎症反应，可见小血管放射至覆盖有小中央血凝块或纤维蛋白层的中央瘢痕[ 19 ， 74，75 ]，但这些病变的病因尚未明确[ 71 ]。与无病变的患者相比，诊断为Hunner病变的患者似乎具有更严重的以膀胱为中心的症状，年龄较大，症状更严重[ 72 ， 75 ， 76 ]，再加上可观察到的炎症病理，因此可以假设间质性膀胱炎患者与该亚组内的特定细菌种类或微生物模式相关。然而，目前只有一项研究调查了霍奇金淋巴瘤患者和非霍奇金淋巴瘤间质性膀胱炎患者微生物组之间的可能变化[ 77 ]。总体而言，12种物种已被证明HL和非HL患者样本之间存在差异丰度;然而，在应用邦弗朗尼调整后，这些物种中没有一个在所有霍奇金淋巴瘤患者与所有非霍奇金淋巴瘤患者之间以及女性霍奇金淋巴瘤患者与非霍奇金淋巴瘤患者之间达到显着差异丰度。相反，在男性亚分析中，可以确定HL患者中琥珀酸负性球藻，somephyroma和Mobiluncus curtisii以及非HL患者中的肾棒状杆菌显着增加。此外，香农多样性指标显示，HL男性患者的α多样性略高于HL女性患者，但HL和非HL患者之间总体上没有。目前，无法解释为什么仅在HL和非HL男性之间发现这些差异;然而，这些特定的细菌种类似乎不太可能仅与男性患者的HL发病机制相关，而与女性患者无关。

4. 结论—间质性膀胱炎是否存在基于微生物组的生物标志物潜力？

即使在健康状态下，膀胱微生物定植的检测也为科学开辟了一个令人兴奋的新领域，特别是在与泌尿系统疾病相关的病因和诊断发现的调查中。直到几年前，膀胱被认为是人体的无菌生态位，泌尿病微生物的检测通常与泌尿系统疾病的存在有关。间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征被认为是排除性诊断，因为病因背景仍然未知，并且迄今为止尚无诊断标志物。然而，在许多其他因素中，微生物组从未被排除为这种慢性疾病的可能调节器或触发因素。随着通过下一代测序（NGS）或增强定量尿培养（EQUC）进行非培养非培养性宏基因组分析的发展，与这种疾病相关的膀胱微生物组的改变越来越成为当前研究的焦点。微生物组多样性和丰富度的变化，以及特定微生物代表性过高或不足的模式，为作为诊断、预后、风险分析和精准治疗的生物标志物提供了巨大的潜力，并将代表IC / BPS研究的里程碑。然而，在该领域进行的研究总数仍然相当有限，研究设计、测序技术或生物鉴定水平的差异使得难以比较所获得的结果。

强烈影响从不同研究收到的微生物组数据的可比性的另一个重要因素是收集尿液样本的方式。迄今为止，确定IC/BPS微生物组的研究已经分析了清洁捕获的中段尿液[60， 67 ，68， 69 ]和导尿[ 61 ， 66 ， 70 ]。然而，应该注意的是，在排尿尿液采样时必须考虑尿道和姿势污染，例如女性外阴阴道微生物污染或男性尿道微生物由于尿道较长的解剖学特征而导致尿道微生物过多。因此，排尿和导管插入的微生物组样本之间的可比性没有意义，对于进一步的研究，应努力实现收集技术的标准化，例如[ 78 ]。

此外，膀胱微生物组高度复杂，个体，年龄和性别依赖性，以及队列内的变异性可能大于受影响者和健康人之间的差异，这一事实使可能模式的分解进一步复杂化。一些研究结果表明，微生物组可能发挥保护作用，例如，通过健康个体中更高水平的乳酸杆菌，并且IC / BPS患者中该属的缺失或丰度减少可能对IC / BPS的病因具有重要意义。微生物组的较低多样性或丰富度与IC / BPS疾病之间存在关系。然而，其他研究未能揭示这种关系，目前不允许我们识别出一种推定的生物体或泌尿类型，该微生物组清楚地将IC / BPS患者的泌尿微生物组与健康对照区分开来，因此实际上不能作为潜在的基于微生物组的生物标志物用于诊断或预后目的。