Genentech：三特异抗体降低On-target off-tumor效应

作为双特异抗体开发的重要玩家，罗氏已经有三款双特异抗体获批上市，靶向FIXa/FX的Emicizumab，靶向Ang-2/VEGF的Faricimab和靶向CD20/CD3的Mosunetuzumab，并且在其管线中还有多个双特异抗体正在开发中。除了已经布局的双特异抗体，罗氏还在不断的更新双抗平台，如为了解决双特异抗体在实体瘤中的On-target off tumor 效应，其开发了肿瘤微环境特异性激活的的Prot-TCB《罗氏新型Prot-2+1 TCB抗体》等。本篇文章我们介绍一下罗氏旗下Genentech利用三特异抗体解决靶向激活T细胞的On-target off tumor效应，其主要是通过抗体同时靶向肿瘤细胞表明不同的靶点，促进抗体对肿瘤细胞的定位，并特异性杀伤肿瘤。

01同时靶向Ly6E和B7-H4

同时靶向肿瘤细胞表面两个不同的靶点最理想的是这两个靶点仅在肿瘤中表达，而不在正常组织细胞上表达。通过对83个乳腺癌肿瘤的检测发现，其中有78%的样本表达Ly6E，而有71%的样本表达B7-H4，而两个靶点都表达的样本占54%，并且23%的样本这两个靶点表达2+以上。同时对多种正常组织分析发现，这两个靶点仅在乳腺组织中表达，在正常组织中，这两个靶点最多仅有一个弱表达或者中等程度的表达，因此这两个靶点为理想的组合。

02双抗或者三抗的设计 

抗体的设计采用了经典的Knob-In-Hole结构，两个半抗分别表达，然后在体外混合组装。在抗体亲和力上，CD3的抗体选择了两种不同亲和力的抗体（+：高亲和力0.5nM；-：低亲和力，50nM）。

03双抗有效但是也有毒

在验证三抗有效性前，研究者首先验证了不同靶点对应的双特异抗体的有效性。在体外肿瘤杀伤性实验中，B7-H4/CD3双特异抗体无论是在体内还是在体外都可以有效杀伤HCC1569（同时表达Ly6E和B7-H4的肿瘤细胞），而且对CD3的亲和力越高，抗体的效果越好。但是对于Ly6E/CD3双抗，无论是对CD3高亲和力的双抗还是低亲和力的双抗，其在体外都无法对肿瘤细胞进行杀伤，但是在小鼠肿瘤模型中，高亲和力的双抗具有一定的疗效，这主要是靶向Ly6E的母抗体在单价时亲和力>200nM，双价时亲和力为3.7 nM。

这些双特异抗体虽然具有一定的疗效，但是也具有一定的毒性，主要是表现在小鼠的体重随着CD3亲和力的增加也在逐渐降低。另外，小鼠也具有黄疸，嗜睡等特征。对于B7-H4/CD3治疗后的小鼠，其肝脏，肾脏以及胰腺等都具有不同程度的炎症和损伤。

04共定位三特异抗体安全有效 

和罗氏常规的2+1结构类似，三特异抗体两个靶点分别位于外端（下图a中的1号和3号位），以利于和肿瘤细胞结合，CD3位于一侧内部（2号位），一方面可以降低其亲和力，另外一方面可以兼顾与两个靶点的距离，从而可以利于免疫突触的形成，此外该结构设计可以避免两个肿瘤靶点的距离过近，从而使得其可以同时和两个不同的靶点结合。   对CD3亲和力高的三特异抗体，无论Ly6E位于1号位还是3号位其都可以对不同抗原表达水平的肿瘤进行有效杀伤。但是对于CD3低亲和力的三特异抗体（下图中“-”），抗体的抗肿瘤活性不仅与1号位的抗体有关，而且和抗原的表达量及两个不同抗原的相对水平有关。随着肿瘤细胞表面两种抗原表达差异缩小（下图OVCAR4细胞），更强亲和力的B7-H4抗体位于1号位具有更强的活性。 

对于CD3低亲和力的三特异抗体，在小鼠动物模型的体内评价中，无论Ly6E位于1号位还是3号抗体都具有较好的抗肿瘤活性，但是当Ly6E位于3号位，即B7-H4位于1号位时，抗体在具有较强抗肿瘤活性的同时也具有较高的毒性。 随后研究者也构建了仅能结合一个靶点的对照抗体（下图b），以此来模仿在体内抗体结合仅表达一个靶点的正在组织。这些对照抗体在小鼠体内都无法有效的抑制肿瘤细胞的生长，这也从侧面证明，只有抗体同时同一肿瘤细胞表面的两个不同的靶点时才能发挥作用，因此其具有较强的选择性。

总结

对于肿瘤的治疗，激活CD3的双特异抗体可以通过桥接T细胞和肿瘤细胞，并利用T细胞对肿瘤细胞进行杀伤，并且该类型的双特异抗体已经在血液瘤中展现了优异的疗效，但是在实体瘤中，因为多数靶点也在正常组织细胞上表达，因此该类型的抗体会造成一定的On-target off tumor 效应，并很大程度的限制了药物的药效。目前已经有多种方案在尝试解决该问题，如肿瘤微环境特异性激活的双特异抗体（前面文章我们已经介绍了很多），以及近年来再生元开发的共定位的双特异抗体。

本篇文章Genentech采用靶向同一肿瘤细胞表面两个不同抗原的策略，利用两个抗原共定位肿瘤，并桥接激活T细胞对肿瘤细胞杀伤。三特异抗体的设计不仅与靶点抗体的亲和力，靶点在肿瘤上表达及两个靶点的相对量有关，而且与靶向不同抗原的Fab在抗体上的位置有关。

参考文献：

1、Danielle M. Dicara, Sunil Bhakta, Mary Ann Go et al.Development of T-cell engagers selective for cells co-expressing two antigens. MABS 2022

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