柠檬酸钾对高尿钙模型中磷酸钙结石的影响

Krieger NS, Asplin JR, Frick KK, Granja I, Culbertson CD, Ng A, Grynpas MD, Bushinsky DA. Effect of Potassium Citrate on Calcium Phosphate Stones in a Model of Hypercalciuria. J Am Soc Nephrol. 2015 Dec;26(12):3001-8. doi: 10.1681/ASN.2014121223. Epub 2015 Apr 8. PMID: 25855777; PMCID: PMC4657843.

柠檬酸钾对高尿钙模型中磷酸钙结石的影响

柠檬酸钾用于减少钙质肾结石患者的结石复发。柠檬酸盐结合肠道和尿钙并增加尿液 pH 值。柠檬酸盐代谢为碳酸氢盐，应通过减少骨吸收和增加肾钙重吸收来减少钙排泄。然而，柠檬酸盐与肠钙结合可能会增加磷酸盐和草酸盐的吸收和肾脏排泄。因此，柠檬酸钾对尿中草酸钙和磷酸钙过饱和和结石形成的影响是复杂且难以预测的。为了研究柠檬酸钾对尿液过饱和和结石形成的影响，我们使用了第 95 代近交遗传高钙尿结石大鼠。给大鼠喂食固定量的正常钙（1. 2%) 饮食补充柠檬酸钾或氯化钾（每次 4 mmol/d），持续 18 周。在 6、12 和 18 周收集尿液。在 18 周时，通过放射线照相术可见结石形成。喂食柠檬酸钾的大鼠的尿柠檬酸盐、磷酸盐、草酸盐和 pH 值较高，而尿钙水平较低。此外，柠檬酸钾的草酸钙和磷酸钙过饱和度更高；然而，尿酸过饱和度较低。两组的磷酸钙结石数量相似。因此，柠檬酸钾有效地提高了尿中的柠檬酸盐水平并降低了尿中的钙水平；然而，尿液 pH 值、草酸盐和磷酸盐水平的升高会导致草酸钙和磷酸钙过饱和度增加。

关键词：高钙尿症，肾结石，矿物质代谢

高钙尿症是在形成钙基肾结石的患者中观察到的最常见的代谢异常。1 – 3尿钙水平升高会增加草酸钙 (CaOx) 和/或磷酸氢钙 (CaHPO 4，透钙石) 晶体成核和生长成具有临床意义的肾结石的可能性。1含磷酸钙 (CaP) 的结石可能是透钙磷石、磷灰石或不太明确的晶体形式。特发性高钙尿症 (IH) 定义为无明显代谢原因的尿钙过多，通常血清钙正常，血清 1,25-二羟维生素 D3 正常或升高，血清甲状旁腺激素 (PTH) 正常或升高，血清正常或低磷酸盐和低骨量。1、4、5 IH表现出多基因遗传模式。4 – 6

在工业化国家，肾结石的年发病率超过千分之一，女性的终生风险约为 7%，男性约为 11%。7肾结石初次发作后，大约 60%–80% 的患者至少形成一个复发性结石。减少结石复发的策略之一是使用柠檬酸钾 (K-cit)。8 – 13预计口服柠檬酸盐会减少可供吸收的钙，14 , 15减少骨吸收，增加肾小管对钙的重吸收，所有这些都会降低尿钙。尿柠檬酸盐增加会隔离尿钙，防止与磷酸钙 (CaP) 和/或草酸盐结合，从而可能导致结石形成减少。然而，口服柠檬酸盐也会增加尿液的 pH 值，这可能会增加 CaP 结石的形成。在体外，柠檬酸盐对 CaOx 晶体的成核和生长有直接的抑制作用（Ryall 16综述）。因此，很难预测 K-cit 对 CaP 常见固相和最终结石形成的尿液过饱和的精确影响。

在患者中，饮食中添加 K-cit 似乎可以减少复发性结石形成。8 – 13在一项针对人体的随机、双盲、安慰剂对照研究中，K-cit 减少了复发性结石形成。17皮尔等人。18发表了对预防复发性结石形成的几种治疗方法的荟萃分析，包括噻嗪类利尿剂和柠檬酸盐。他们确定了三项研究（包括 Pak等人13和Barcelo等人17) 使用柠檬酸盐补充剂；在两项研究中结石复发减少，但在第三项研究中没有。不可能进行正式的荟萃分析，因为一项研究仅报告了结石形成率而不是患者人数。据报道，K-cit 治疗对噻嗪类药物治疗无效的患者有效。13 , 19

碎石术后使用柠檬酸盐来预防结石复发。在一项随机对照研究中，柠檬酸钾和钠似乎可以降低体外冲击波碎石术或经皮肾镜取石术后结石复发的风险。20在另一项随机对照研究中，K-cit 似乎可有效减少冲击波碎石术后的下杯结石。21这些研究都没有安慰剂对照。美国泌尿学协会目前的建议包括柠檬酸盐治疗以限制结石复发。22

然而，在所有以结石形成为主要终点的人体研究中，选择患有 CaOx 结石或钙结石的患者。因此，CaP 结石形成患者被排除在外，或者只是少数研究参与者。没有前瞻性对照试验研究柠檬酸盐在减少结石形成方面的有效性，特别是在 CaP 结石患者中，这仍然是一个重要的临床问题。23由于与 CaOx 结石形成者相比，CaP 结石形成者的尿液呈碱性，因此柠檬酸盐对 CaP 过饱和和结石形成的影响难以预测。碱负荷会增加尿液 pH 值，增加 CaP 过饱和度，而柠檬酸盐增加和尿钙减少会降低 CaP 过饱和度；然而，净效应是不确定的。鉴于柠檬酸盐对预防复发性 CaP 结石病的影响的不确定性，以及缺乏人体研究，我们使用第 95 代遗传性高钙尿结石（GHS）大鼠来研究 K-cit 对 CaP 结石的影响形成。

GHS 大鼠是通过选择性近交 Sprague-Dawley 大鼠以增加尿钙排泄而产生的。24 – 48当喂食标准的、充足的钙饮食时，每只 GHS 大鼠现在持续排泄的尿钙比 Sprague-Dawley 对照组多约 10 倍。24 – 49与 IH 患者一样，GHS 大鼠血清钙正常，24肠钙吸收增加26和骨吸收增强，49肾小管钙重吸收减少，36血清1,25-二羟维生素 D3水平正常25、26、30、41 , 42除了降低骨矿物质密度。39 , 47高钙尿症是 GHS 大鼠的多基因性状，44与人类一样。4 – 6当喂食标准、充足的钙饮食时，所有 GHS 大鼠都会出现肾结石，27、28、31、32由 CaP 组成。27、31、33、34在GHS大鼠的饮食中添加羟脯氨酸会导致 CaOx 结石形成。37、38、40 _ _ _ _

为了确定 K-cit 对尿溶质排泄、常见结石固相的过饱和以及 CaP 结石形成的影响，GHS 大鼠喂食不含羟脯氨酸的正常钙饮食和 K-cit 或氯化钾 (KCl)，如控制。

结果

尿溶质排泄

所有大鼠始终吃完全部分配的食物，因此两组中所有大鼠的溶质摄入量（柠檬酸盐、氯化物和钾除外）相似。K-cit 诱导总体平均尿钙降低（K-cit, 16.1±0.5 mg/d vs KCl, 18.6±0.3 mg/d; P <0.001），K-cit 在 6 和 12 降低尿钙周，但不是在 18 周（ 图1 ）。K-cit 导致总体平均尿磷酸盐（K-cit, 29±1 mg/d vs KCl, 20±1 mg/d; P <0.001）和总体平均尿草酸盐（K-cit, 1.11± 0.04 mg/d vs KCl, 0.62±0.02, P <0.001) 并且在每个时间点都观察到尿磷酸盐和尿草酸盐的增加（ 图1 ）。

图1。

K-cit 降低了尿钙 (Ca) 和尿、磷酸盐 (P) 和草酸盐 (Ox)。如简明方法中所述，在 6、12 和 18 周收集尿液 24 小时以确定溶质水平。值是平均值±SEM。*K-cit 与 KCl 不同，同一时间段，P <0.05。

正如预期的那样，喂食 K-cit 的大鼠的总体平均尿柠檬酸盐升高（K-cit, 182±3.4 mg/d vs KCl, 110±2.7 mg/d; P <0.001）（ 表格1 ）。K-cit 增加了平均总尿液 pH 值（K-cit，7.51±0.04 对比 KCl，6.71±0.05；P <0.001）。K-cit 降低了平均总尿 NH 4（K-cit，0.25±0.01 mmol/d 对比 KCl，0.41±0.01 mmol/d；P <0.001）。K-cit 增加了平均总尿硫酸盐（K-cit，1.08±0.02 mEq/d 与 KCl，0.86±0.02 mEq/d；P <0.001）。这些变化中的每一个都存在于每个时间点。总体平均尿酸排泄没有差异（K-cit, 1.6±0.1 mg/d vs KCl, 2.0±0.2 mg/d; P = NS）。

值表示为平均值±SEM。如简明方法中所述，在 6、12 和 18 周收集尿液 24 小时以确定溶质水平。

与 KCl 不同的K-cit，同一时间段， P <0.05。

K-cit 导致总体平均尿钠略低（K-cit, 2.16±0.03 mmol/d vs KCl, 2.36±0.04; P <0.001），这在 6 周和 18 周时显着，但在 12 周时不显着（ 表格1 ）。K-cit 导致平均总尿 K（K-cit，4.8±0.04 mmol/d 与 KCl，5.3±0.08 mmol/d；P <0.001）略微但显着降低，这在每个时间段都很显着。正如预期的那样，接受 K-cit 的大鼠比接受 KCl 的大鼠排泄更少的氯化物（K-cit，2.2±0.07 mEq/d 与 KCl，6.4±0.15 mEq/d；P <0.001），这在每 6-周时间段。K-cit 不改变总体平均尿量（K-cit, 47.3±1.6 ml/d vs KCl, 53.0±2.7 ml/d; P = NS）或总体平均尿肌酐（K-cit, 12.85±0.17 mg/d 对 KCl，12.74±0.22 mg/d；P = NS)。

尿液过饱和

K-cit 导致 CaP（K-cit, 8.5±0.6 vs KCl, 4.9±0.2; P <0.001）和 CaOx（K-cit, 9.8±0.5 vs KCl, 5.5）的尿液过饱和度显着增加±0.2；P <0.001）和降低尿酸过饱和度（K-cit，0.003±0.0005 与 KCl，0.022±0.003；P <0.001）（ 图 2 ）。这些差异中的每一个在每个时间段都是显着的。

图 2。

CaP 和 CaOx 的尿液过饱和度 (SS) 增加，而 K-cit 降低了尿酸 SS。在 6、12 和 18 周收集尿液 24 小时以确定用于计算相对过饱和度的溶质水平，如简明方法中所述。相对过饱和度的值是平均值±SEM并且没有单位。*K-cit 与 KCl 不同，同一时间段，P <0.05。

血清水平

K-cit 喂养和 KCl 喂养大鼠的血清钙和 PTH 水平没有差异，而 K-cit 喂养大鼠的血清磷酸盐水平降低（ 图 3 ）。

图 3。

K-cit 降低血清磷酸盐水平，但不改变血清 Ca 或 PTH。在为期 18 周的研究结束时，如简明方法中所述确定这些水平。值是平均值±SEM。*K-cit 与 KCl 不同，同一时间段，P <0.05。

石形成

K-cit 不会改变形成的结石数量或肾脏钙化程度（ 图 4 ）。所有大鼠都形成了大小和密度相似的结石，并且在肾脏和收集系统内具有相似程度的钙化。

图 4。

喂食 KCl 或 K-cit 的大鼠肾结石形成和钙化没有差异。在为期 18 周的研究结束时，肾结石和钙化的程度由三名观察者确定，如简明方法中所述。如简明方法中所述，还确定了肾钙化的程度。(A) 接受 KCl 或 K-cit 的大鼠肾脏的代表性 X 光片。所示图像的钙化分数仅供参考。(B) 对所有接受 KCl 或 K-cit 的大鼠的结石形成和钙化进行定量。值是平均值±SEM。

从两组的代表性肾脏解剖可见结石并分析晶体形态。所有分析样品的衍射图均与生物磷灰石（一种 CaP 石）的衍射图一致（ 图 5 ， 顶部）。使用透射电子显微镜 (TEM)，所有肾结石晶体呈棒状或针状，类似于生物磷灰石晶体的形态。 图 5 ，底部），并且与 CaOx 的八面体晶体形态不同。

图 5。 对肾结石晶体的分析表明含有 KCl 和 K-cit 的 CaP 结石。 上图：大鼠喂食 KCl（左）和大鼠喂食 K-cit（右）的石头的代表性电子衍射图，显示了生物磷灰石的典型构型。 下图：来自用于衍射图案的相同石头的 TEM 图像：来自喂食 KCl 的大鼠的石头（左）和来自喂食 K-cit 的大鼠的石头（右）。

讨论

高钙尿症是在形成钙基肾结石的患者中观察到的最常见的代谢异常。大多数高钙尿症患者有 IH。尿钙排泄增加提高了 CaOx 和/或 CaP 晶体成核和生长成临床显着肾结石的可能性。1

在 IH 患者中，K-cit 常用于预防复发性结石形成。然而，没有前瞻性对照研究显示 K-cit 在预防复发性 CaP 结石形成方面的功效。23柠檬酸盐对尿溶质排泄有复杂的影响，它对尿液过饱和与 CaP 结石形成的影响很难预测。一些研究表明，随着时间的推移，CaOx 结石可能会转变为 CaP 结石，而使用柠檬酸盐疗法可以解释这种现象。50 , 51然而，尚无明确的研究证明或反驳柠檬酸盐在 CaOx 转化为 CaP 结石病中的作用。

在这项使用 GHS 大鼠的研究中，提供 K-cit 导致尿中柠檬酸盐排泄量增加，并且 K-cit 还有效降低了尿钙。K-cit 降低尿钙的机制几乎肯定是多因素的。虽然柠檬酸盐本身很容易在肠道中吸收，52但它会降低钙的吸收和尿钙的排泄。增加的尿柠檬酸盐也会结合尿钙，从可用于与磷酸盐或草酸盐结合的池中去除钙。此外，柠檬酸盐代谢为碳酸氢盐会导致全身碱化，从而直接降低骨吸收53并增加肾小管对钙的重吸收，从而降低尿中钙的水平。尿钙的减少本身将有利地减少含钙肾结石的尿过饱和。

正如在人类中所见，柠檬酸盐疗法降低了 GHS 大鼠的尿钙并提高了尿柠檬酸盐和 pH 值。然而，我们还发现，在接受柠檬酸盐治疗的 GHS 大鼠中，尿草酸盐、硫酸盐和磷含量增加，血清磷含量降低，这是以前在接受柠檬酸盐治疗的人类中未曾报道过的变化。柠檬酸盐与肠道钙的结合可以减少肠道钙与草酸盐的结合，从而可能使草酸盐吸收更多。在肾脏中，草酸盐在近端小管中运输。54、55在肾近端小管和肠道中发现的鼠阴离子转运蛋白 Slc26a6 对氯/草酸盐交换具有特异性。56 – 58在小鼠中敲除 Slc26a6 会导致高草酸尿症，59、60低柠檬酸尿、61和CaOx结石形成。59在灌注实验中，硫酸盐或碳酸氢盐的存在抑制了草酸盐的转运，表明这些阴离子之间存在竞争性抑制。55 Slc26a6 和柠檬酸盐转运蛋白 NaDC-1 的共表达表明这些转运蛋白相互作用。61 NaDC-1 增强 Slc26a6 转运活性，而 Slc26a6 抑制 NaDC-1。61这些数据表明草酸盐和柠檬酸盐转运之间存在密切关系。在这项研究中，我们发现施用 K-cit 会导致尿液草酸盐排泄量显着增加，而这种增加会增加尿液中 CaOx 的过饱和度。

柠檬酸盐与肠钙的结合也将允许更多的磷酸盐吸收。肾脏对磷酸盐的重吸收受近端小管中 II 型 Na +偶联磷酸盐协同转运蛋白的调节，该转运蛋白被细胞外酸化抑制。62 K-cit 诱导的全身和尿液碱化会增加肾小管对磷酸盐的重吸收；然而，PTH 的增加虽然没有统计学意义，但可能是本研究发现的尿磷酸盐增加和血清磷酸盐减少的原因。

喂食 K-cit 的 GHS 大鼠尿硫酸盐增加。显示对硫酸盐、草酸盐和氯化物的底物特异性的阴离子转运蛋白 Slc26a2 也存在于近端小管中。63由于硫酸盐转运异常，人类SLC26A2的突变可导致隐性软骨发育不良。63当在非洲爪蟾卵母细胞中表达时，酸性胞外 pH 抑制阴离子交换，而酸性胞内 pH 激活胞外氯化物与胞内硫酸盐的交换，而不是氯化物或草酸盐。64需要进一步的研究来确定为什么在喂食 K-cit 的 GHS 大鼠中尿硫酸盐增加。

在这项研究中，K-cit 的提供导致尿液 pH 值升高，这将降低 CaP 的溶解度。相反，尿酸固相可能是钙结石形成的病灶，更易溶于碱性尿液。K-cit 没有改变尿量，表明尿过饱和的任何变化不是尿量差异的结果。K-cit 不改变尿肌酐排泄，表明该药物的给药在此期间不影响肌肉质量。

Zerwekh等人。65只 Sprague-Dawley 大鼠喂食低或高酪蛋白饮食，含 KCl 或 K-cit（每天 4 mEq 钾），持续 8 周。K-cit 不会增加尿液 pH 值。与低酪蛋白饮食+KCl相比，高酪蛋白饮食增加了尿钙排泄，而K-cit减少了这种增加的尿钙。K-cit 不改变尿磷酸盐或草酸盐。在目前的研究中，我们使用了 3 倍剂量的 K-cit，并观察到尿液 pH 值、尿草酸盐和尿磷酸盐显着增加，尿钙减少。

在这项研究中，我们发现虽然 K-cit 有效降低了尿钙，但它也增加了尿磷酸盐和草酸盐以及尿 pH 值，导致相对于 CaP 和 CaOx 固相的尿过饱和实际增加。尽管 CaOx 过饱和度增加，但对每组结石的分析发现 TEM 和衍射图表明所有结石均由 CaP 组成。K-cit 降低了尿酸的过饱和度，但这种过饱和度在任何一种情况下都非常低，以至于几乎没有形成尿酸结石的机会。GHS 大鼠的结石形成（在这种饮食中仅形成 CaP 结石）没有被 K-cit 改变。值得注意的是，柠檬酸盐处理的大鼠中 CaP 的较高过饱和度不会导致结石形成的增加。66需要进一步研究以确定向 GHS 大鼠喂食羟脯氨酸（导致它们仅形成 CaOx 结石）是否会影响尿过饱和或结石形成。

因此，提供 K-cit 会引起尿液化学成分的复杂变化，对降低 CaP 和 CaOx 过饱和的目标有些有利，有些则有害。在这种 CaP 结石形成模型中，柠檬酸盐不能有效减少结石负担。该研究表明，应在人类 CaP 结石形成者中进行进一步研究，以确定 K-cit 对尿液过饱和对 CaP 和结石形成的影响。

简洁的方法

动物

GHS 大鼠来自 Sprague-Dawley 大鼠（Charles River Laboratories，Kingston，NY），通过连续近交每一代中高钙尿症的后代。24 – 27 , 36 – 39 , 49来自第 95 代的 8 周龄雄性 GHS 大鼠用于本研究。

实验条件

在研究开始时（第 0 天），将 22 只 GHS 大鼠置于代谢笼中，喂食正常的钙饮食，13 g/d（1.2% 钙；Harlan-Teklad，Indianapolis，IN）。将 K-cit，4 mmol/d（11 只大鼠）或 KCl，4 mmol/d，作为对照（11 只大鼠）添加到饮食中以提供等量的阴离子柠檬酸盐和氯化物。所有大鼠均可自由使用去离子蒸馏水。每隔 6 周（6 周、12 周和 18 周），收集每只大鼠的尿液，持续四个 24 小时。对于两次收集，尿液用 HCl 酸化；对于另外两次收集，尿液被收集在百里酚中。在百里酚中收集用于 pH、尿酸和氯化物，在 HCl 中收集用于所有其他测量。18 周后，对所有大鼠实施安乐死并收集它们的血液，并迅速取出肾脏。任何吃过< 每天 10 克食物或每天喝 < 15 毫升水将被排除在进一步分析之外；然而，在整个研究过程中，所有大鼠都符合预先设定的标准。罗切斯特大学动物资源委员会批准了所有程序。

尿液和血清化学

使用 Beckman CX5 Pro 自动分析仪 (Beckman Coulter, Brea, CA) 分光光度法测量尿钙、镁、磷酸盐、铵和肌酐。通过 Beckman CX5 上的离子特异性电极测量尿钾、氯和钠。使用玻璃电极测量尿液 pH 值，并使用 Dionex ICS 2000 系统（Dionex Corp.，Sunnyvale，CA）通过离子色谱法测量柠檬酸盐、草酸盐和硫酸盐。在 6、12 和 18 周测量所有尿溶质，并计算每个时间段的平均值和总平均值。比色法测定血清钙和磷酸盐（BioVision，Milpitas，CA）。血清 PTH 通过酶免疫测定法测定完整 PTH (ALPCO, Salem, NH)。我们以前使用过所有这些方法。31 , 45, 47 , 48 , 67 – 69

尿液过饱和

通过测量的溶质排泄，使用计算机程序 EQUIL2, 70计算 CaOx、CaP 和尿酸固相的尿液过饱和度，正如我们之前所做的那样。28 , 29 , 33 , 34 , 37 , 40 , 43 , 48 , 67 – 69比率 1 表示尿液处于平衡状态，>1 表示过饱和，<1 表示欠饱和。我们发现尿液和血液以及骨培养基中计算的饱和度和实验测量的饱和度之间有很好的对应关系。31、45、47 _ _ _ _

钙化

从每只大鼠整体取出肾脏、输尿管和膀胱，冷冻，并在 Faxitron 柜式放射照相设备（Tucson，AZ）中成像以确定肾结石形成和钙化的程度。三位对治疗不知情的观察者对所有 X 光片进行评分，评分范围从 0（无结石或钙化）到 4（存在广泛结石和/或钙化）。

肾结石的晶体学

从两组大鼠的肾脏中解剖结石并嵌入EMbed 812树脂中，无需固定或脱水。在 Leica Ultracut 切片机上切割 100 nm 厚的切片，置于 Formvar 涂层网格上，并在 FEI Tecnai 20 TEM (FEI Co., Hillsboro, OR) 中观察。图像和衍射图案由 AMT 16000 相机收集。衍射图案分析是通过与在相同条件下收集的金图案进行比较来计算 d 间距来完成的。

统计分析

通过t检验将值与常规计算机程序 (Statistica; StatSoft, Tulsa, OK) 进行比较。值表示为平均值±SEM。P≤0.05被认为代表了统计学上的显着差异。

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